李 蕾，張小樂，孫世中，賈昱靖，郭嘉航，唐光美，張福瓊，黃晶心，官會林

(云南師范大學 能源與環(huán)境科學學院，高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復云南省野外科學觀測研究站，云南省農(nóng)村能源工程重點實驗室，云南 昆明 650500)

隨著工業(yè)“三廢”排放量日益上升，污水灌溉導致農(nóng)田土壤重金屬污染嚴重、土壤生產(chǎn)力下降[1]、農(nóng)產(chǎn)品污染等諸多問題.據(jù)統(tǒng)計中國重金屬污染耕地約占16.67%[2].重金屬污染對植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)有重要影響，進而影響種子萌發(fā)[3]，植物生長發(fā)育[4]；重金屬脅迫下植物葉綠素含量降低，抑制植物光合作用[5]，甚至造成線粒體受損，呼吸作用降低，植物細胞死亡[6]，進而導致農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量下降.鉛、鎘是最常見的兩種土壤重金屬污染物.鉛進入人體后將對消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)造成損害，尤其是兒童對鉛吸收率更高，易感性強[7].鎘由食物鏈進入人體后主要貯存于腎和肝中，可造成腎臟、肝臟受損，長期攝入將導致脊柱畸形、骨骼軟化、內(nèi)分泌失調(diào)等[8].目前全球人口在不斷增加，土壤重金屬污染加劇，可用耕地面積不斷減少[9].如何綜合利用受重金屬污染的耕地是目前亟待解決的問題.

重金屬污染農(nóng)耕地的綜合利用方法包括重金屬原位鈍化、農(nóng)藝措施消減重金屬積累等[10]，其中利用抗性品種是一種重要方法.植物抗性是植物在不同環(huán)境條件下演化而對環(huán)境產(chǎn)生了不同類型和不同程度的適應的結(jié)果[11].在重金屬污染的農(nóng)耕地上種植具有重金屬抗性的品種，能有效降低重金屬對植物的影響.研究不同基因型小麥對硒、鉛和鎘脅迫的響應差異中發(fā)現(xiàn)，抗性品種的產(chǎn)量和千粒重均遠遠超過敏感品種，且其體內(nèi)重金屬含量并未超過國家標準[12].因此，在全國耕地重金屬污染背景下，抗性品種應用是一種經(jīng)濟有效且不危害人類健康的措施[13].

大量研究表明重金屬通常積累在植物細胞膜和蛋白質(zhì)中[14]，在脂肪細胞中積累較少[15]，油料作物不易重金屬超標，超標的油料作物也還能通過制作燃料柴油、航空煤油等被利用.這使得油料作物在重金屬污染耕地綜合應用中有著明顯的價值.花生（Arachis hypogaeaL.）是世界上種植面積最多、產(chǎn)量最高、油品質(zhì)量較好的油料作物[16].目前人類培育的花生品種包括多個品系，研究發(fā)現(xiàn)不同基因型花生對鎘脅迫的響應存在顯著性差異，具體表現(xiàn)在莖葉生物量、根系生物量、葉綠素含量、根系活力以及根分泌物含量的差異[17]；研究不同花生品種對鉻的吸收差異及調(diào)控措施發(fā)現(xiàn)，來自不同地域347 個品種對重金屬的富集能力差異較大[18]；在對不同濃度鎘污染下多個花生品種籽粒鎘含量的研究中發(fā)現(xiàn)，花生籽粒重金屬含量均隨著土壤重金屬濃度的增加而增加，且不同品種增長趨勢不同[19].研究8 個花生品種對鉛、鎘吸收分配規(guī)律表明，其花生籽仁的鉛、鎘含量、富集與分配存在顯著差異，且不同花生品種對重金屬的富集特性是影響花生籽仁重金屬含量的主要原因[20]；研究鉛脅迫對花生生理特性的影響中發(fā)現(xiàn)，隨著鉛濃度升高，花生葉片葉綠素a、b 降低，細胞中活性氧積累[21].據(jù)此我們推測不同花生品種對重金屬污染物的抗性不同，而目前該方面的研究較少.

綜合上述背景，本文研究不同花生品種在重金屬脅迫下的生長狀況、生理變化，以此來選擇重金屬耐性較高花生品種，適合在重金屬污染農(nóng)田中種植，為重金屬污染農(nóng)田的綜合利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料本研究使用的土壤為綠化用地土壤，經(jīng)測試未發(fā)現(xiàn)重金屬污染物超標現(xiàn)象.選用中國目前廣泛種植、經(jīng)濟價值較大的3 個花生品種：產(chǎn)量高、適應性強的黑豐一號，綜合抗性高的紅花12 號，抗旱性較強的濰花八號進行研究.

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗于2019 年10―12 月在昆明市云南師范大學校區(qū)進行.選取籽粒飽滿、大小一致的3 種花生種子，用0.1% HgCl2溶液消毒10 s，去離子水反復沖洗，均勻播在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿5 粒種子作為1 個重復，每個處理含3次重復.本試驗共設(shè)置7 個處理組，包括空白對照組（CK），根據(jù)中國耕地表層土壤重金屬污染狀況[22]設(shè)置鉛、鎘污染處理.其中鉛的質(zhì)量濃度梯度為5、10、20 mg·L?1，鎘的質(zhì)量濃度梯度為1、5、10 mg·L?1，每個處理添加重金屬溶液10 mL 使種子萌發(fā)，CK組添加等量去離子水.25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d 后計算萌發(fā)率.

將備用土壤混勻過5 目篩（孔徑4 mm），而后分裝至63 個上口外徑11 cm，高10 cm 的塑料盆缽中，每盆裝土290 g.分別添加鉛溶液使土壤中鉛質(zhì)量比分別達到5、10、20 mg·kg?1；添加鎘溶液使土壤中鎘質(zhì)量比分別達到1、5、10 mg·kg?1；CK 組添加等量去離子水.在培養(yǎng)皿中以去離子水萌發(fā)150顆花生種子，各處理分別種植萌發(fā)狀況一致的花生幼苗，每盆種植5 株花生作為1 個重復，每個處理設(shè)置3 次重復.將盆缽放入人工氣候箱中，設(shè)置為25 ℃，濕度為60%，光照度為1 000 lx，保證每天16 h的光照和8 h 的黑暗處理，2 d 澆水1 次，試驗周期為1 個月.

1.2.2 測定指標及方法 當胚根與種子等長、胚芽長度達到種子長度一半時，認定種子已萌發(fā).連續(xù)觀察各組花生萌發(fā)情況直至各品種CK 的發(fā)芽率不再變化，計算各品種在不同處理下的萌發(fā)率，萌發(fā)率=供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%.葉綠素含量（單位：SPAD）的測定采用葉綠素儀SPAD?502 Plus（KONICA MINOLTA,Japan），在生長中期測定每盆中5 株花生的第3 伸展葉的葉綠素，并求均值作為1 個重復.種植1 月后收獲植物，使用游標卡尺測量花生幼苗莖基直徑；用直尺由幼苗莖底部測量至最長莖頂部為株高；用自來水沖洗幼苗根部土壤，晾干表面水分，測量其生物量；采集花生幼苗新鮮葉片，采用鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性（U·mL?1）[23]；采用茚三酮顯色法測定脯氨酸質(zhì)量分數(shù)[24]；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性（U·g?1·min?1）[25].

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，用R 軟件（版本號：3.6.2）通過單因素方法分析統(tǒng)計土壤中不同重金屬含量下不同品種的花生種子萌發(fā)率、葉綠素含量、莖基直徑、株高、生物量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性和脯氨酸的差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬對不同品種花生種子萌發(fā)率的影響由圖1 可見，在含不同質(zhì)量濃度鉛、鎘溶液處理下3 種花生種子萌發(fā)率存在顯著差異（P<0.05）.5、10、20 mg·L?1鉛質(zhì)量濃度下濰花八號的萌發(fā)率均高于另 外2 種花生品種.鎘質(zhì)量 濃度為1、5 mg·L?1時，濰花八號的萌發(fā)率顯著高于另外2 種品種.這說明3 種花生中濰花八號種子的萌發(fā)對鉛污染（5、10、20 mg·L?1）和中低濃度的鎘污染（1、5 mg·L?1）有更高的抗性.

圖1 不同質(zhì)量濃度重金屬脅迫下花生萌發(fā)率Fig.1 Germination ratio of peanut under different concentrations of heavy metals

2.2 重金屬對不同品種花生幼苗生長的影響由圖2 可見，在土壤中不同質(zhì)量比的鉛、鎘處理下不同花生品種株高呈顯著差異（P<0.05）.花生幼苗株高隨重金屬離子質(zhì)量比的升高而逐漸降低.5、10、20 mg·kg?1鉛質(zhì)量比下，濰花八號株高均為最高；1、5 mg·kg?1鎘質(zhì)量比下，濰花八號株高顯著高于另2 種花生.說明3 種花生中濰花八號幼苗株高對鉛污染（5、10、20 mg·kg?1）、中低質(zhì)量比鎘污染（1、5 mg·kg?1）有更高抗性.不同質(zhì)量比鉛、鎘處理下3 個品種花生莖基直徑有顯著性差異（P<0.05）（圖2）.花生幼苗莖基直徑隨重金屬質(zhì)量比增加而減小.鉛質(zhì)量比0、5、10 mg·kg?1處理下，濰花八號莖基直徑顯著高于另2 種；鎘離子質(zhì)量比1、5、10 mg·kg?1處理下，濰花八號莖基直徑均高于另2 種.說明3 個品種花生中濰花八號莖基直徑對鎘污染（1、5、10 mg·kg?1）及中、低質(zhì)量比鉛污染（5、10 mg·kg?1）更具抗性.不同鉛、鎘質(zhì)量比處理下不同品種花生幼苗生物量有顯著性差異（P<0.05）（圖2）.花生單株生物量隨重金屬質(zhì)量比升高而降低.5、10、20 mg·kg?1鉛質(zhì)量比，1、5、10 mg·kg?1鎘質(zhì)量比下濰花八號生物量均最高，說明3 種花生品種中濰花八號幼苗生物量對鉛（5、10、20 mg·kg?1）、鎘（1、5、10 mg·kg?1）具有更高抗性.不同鉛、鎘質(zhì)量比處理下3 個品種花生葉片葉綠素有顯著性差異（P<0.05）（圖2）.花生葉綠素隨重金屬質(zhì)量比增加而降低.5、10、20 mg·kg?1鉛質(zhì)量比和1、5、10 mg·kg?1鎘質(zhì)量比處理下濰花八號幼苗葉綠素含量均高于另2 種花生.在此鉛、鎘質(zhì)量比下濰花八號幼苗葉綠素具有更高抗性.

圖2 不同處理下花生幼苗得的株高、莖基直徑、生物量、葉綠素含量Fig.2 Plant height,stem base diameter,single biomass and chlorophyll content of peanut seedlings under different treatments

2.3 重金屬對不同品種花生幼苗抗氧化酶活性、脯氨酸含量的影響由圖3 可見，不同鎘質(zhì)量濃度處理下3 種花生幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶(POD)活性和脯氨酸質(zhì)量分數(shù)有顯著性差異（P<0.05）.不同品種花生SOD、POD 活性和脯氨酸質(zhì)量分數(shù)隨著鎘質(zhì)量比的增加而增加，且濰花八號上述指標顯著高于另2 種花生.不同質(zhì)量比鉛處理下不同花生品種幼苗脯氨酸質(zhì)量分數(shù)有顯著性差異（P<0.05）.花生脯氨酸質(zhì)量分數(shù)隨著重金屬質(zhì)量比的增加而增加.5、10 mg·kg?1鉛質(zhì)量比處理下，濰花八號幼苗脯氨酸質(zhì)量分數(shù)最高.

3 討論

種子萌發(fā)和幼苗生長期是植物對環(huán)境脅迫較為敏感的時期,因此通過研究種子在脅迫條件下其萌發(fā)與幼苗生長的特征可以在一定程度上反映植物對脅迫的耐性[26].本研究結(jié)果顯示，不同含量鉛、鎘脅迫下，3 種花生種子萌發(fā)率，幼苗生物量、株高、莖基直徑、葉綠素含量均呈不同程度下降趨勢.重金屬主要是通過抑制種子內(nèi)脫氫酶、蛋白酶、淀粉酶和酸性磷酸酯酶的活性[27]，影響植物種子的萌發(fā).由于鉛、鎘不是植物生長必需元素，在植物體內(nèi)積累將會影響細胞分裂和生長，干擾營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和分配[28-29].導致植物對養(yǎng)分的吸收和運輸能力降低，養(yǎng)分缺乏、相關(guān)代謝過程和物質(zhì)成分的紊亂，表現(xiàn)出缺素癥狀[30]，嚴重抑制植物的生長發(fā)育[31]，且隨脅迫時間增強.并且用鉛和鎘處理植物使得葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化，破壞了葉綠體膜系統(tǒng)，降低葉片葉綠素含量[32]，影響植物光合作用.袁敏等[33]、秦建橋等[34]、黃芳等[35]、Jamali 等[36]、弭寶彬等[37]也有類似研究結(jié)果.本研究結(jié)果顯示土壤中鉛、鎘含量增加，對花生種子萌發(fā)和生長發(fā)育抑制作用增強.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是重金屬含量增加，誘導植物體內(nèi)超氧陰離子和羥基自由基等大量產(chǎn)生，嚴重干擾保護酶的活性，造成代謝紊亂，抑制植物生長[38].這與鉛、鎘脅迫下火炬樹種子萌發(fā)[39]和黑麥草（Lolium perenne）種子脅迫[40]的研究結(jié)果相似.

本研究結(jié)果顯示不同品種花生對重金屬鉛、鎘的抗性存在差異.5、10、20 mg·kg?1鉛質(zhì)量比下，濰花八號的萌發(fā)率比值均高于另外2 種花生品種；鎘質(zhì)量比為1、5 mg·kg?1時，濰花八號的萌發(fā)率顯著高于另外2 種品種.在不同濃度鉛、鎘污染下，濰花八號株高、莖基直徑、幼苗生物量、葉綠素含量均顯著高于另2 個品種花生.由研究結(jié)果可知3個品種花生中濰花八號對鉛（5、10、20 mg·kg?1）、中低質(zhì)量比的鎘（1、5 mg·kg?1）具有更高抗性.植物品種間的耐性差異與其內(nèi)源抗氧化酶系統(tǒng)的變化及膜脂過氧化程度密切相關(guān)[41].重金屬脅迫誘導植物體產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，導致植物遭受氧化脅迫，引起膜脂過氧化，損傷生物膜[42]，造成葉綠體和線粒體等細胞器功能受損，最終導致細胞凋亡[43].SOD、POD 是活性氧清除系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的抗氧化酶，能清除植物體內(nèi)各種環(huán)境壓力下產(chǎn)生的活性氧自由基，減輕對生物膜系統(tǒng)的損害，保護細胞結(jié)構(gòu)和功能.植物體內(nèi)抗氧化酶活性的提高能增強植物對多種氧化脅迫的抗性[44].脯氨酸作為植物胞質(zhì)中的滲透調(diào)節(jié)劑，在穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)、降低細胞的酸度、消除氨的毒性和調(diào)節(jié)細胞作為能量庫的方面起著重要的作用，在一定程度上反映了植物的抗逆性.有研究表明，重金屬污染通常會誘導植物合成一系列代謝產(chǎn)物如脯氨酸，并且隨著重金屬濃度的增加，脯氨酸的積累會急劇增加[45].本試驗結(jié)果顯示：在一定濃度鉛、鎘脅迫下，3 個品種花生SOD 活性、POD 活性、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)總體呈上升趨勢.隨著鎘含量增加，濰花八號SOD 活性均顯著高于另2 種花生；1、5 mg·kg?1鎘質(zhì)量比下，濰花八號POD 活性最高；隨著鉛、鎘質(zhì)量比增加，濰花八號幼苗脯氨酸質(zhì)量分數(shù)均最高.這與鉛、鎘脅迫對花生種子萌發(fā)和幼苗生長的影響基本一致，這可能是由于鉛脅迫下花生葉片脯氨酸質(zhì)量分數(shù)增高，穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)，增強花生抗性；在鎘脅迫下花生葉片中SOD 活性、POD 活性以及脯氨酸質(zhì)量分數(shù)升高，細胞清除活性氧自由基能力增強，提高了花生對氧化脅迫的抗性.不同花生品種抗性差異是花生體內(nèi)保護酶系統(tǒng)與代謝產(chǎn)物抵抗鉛、鎘脅迫的能力不同導致的.

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)濰花八號在一定濃度鉛、鎘污染下有更高的萌發(fā)率、株高、莖基直徑、生物量和葉綠素含量，具有更高重金屬抗性.其重要原因是鉛、鎘脅迫下濰花八號有更高SOD、POD 活性和脯氨酸質(zhì)量分數(shù)，更能抵抗氧化脅迫、維持細胞結(jié)構(gòu)功能，進而增強花生抗性.這意味著濰花八號可用于鉛、鎘污染農(nóng)耕地的綜合利用.