王偉影 陳夢(mèng) 毛菊華 陳衛(wèi)平

(麗水市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江 麗水 323000)

菝葜為2020年版《中國(guó)藥典》一部收載品種[1]，藥用部位為百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹，解毒散瘀的功效，用于治療小便淋濁，帶下量多，風(fēng)濕痹痛，疔瘡癰腫?，F(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)缺少指標(biāo)性成分含量測(cè)定[1]；現(xiàn)有菝葜及相關(guān)制劑的化學(xué)成分定量研究主要集中在落新婦苷、黃杞苷、槲皮素、薯蕷皂苷元等[2-10];相關(guān)藥理學(xué)研究顯示，菝葜在抗炎、抑制腫瘤、免疫抑制等方面具有優(yōu)良的作用[11-16]。本文綜合考慮菝葜的藥理研究和化學(xué)成分研究，選取了具有良好的抗菌消炎和抗腫瘤等活性的綠原酸、有抗菌消炎作用的原兒茶酸、在免疫抑制方面有明顯作用的落新婦苷和用于腫瘤抑制白藜蘆醇等4種成分，以綠原酸為內(nèi)參物，建立QMAS法菝葜中上述4種成分的測(cè)定方法，以期為菝葜的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種經(jīng)濟(jì)、高效的多指標(biāo)質(zhì)控方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀，配DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)；XS105DU電子天平(瑞士梅特勒公司)；Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6mm×250 mm，5 μm) (美國(guó)安捷倫公司)；DKS24恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Lc-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；Agilent ZorbaxSB-C18色譜柱(4.6mm×250 mm，5 μm) (美國(guó)安捷倫公司)；Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6mm×250 mm，5 μm) (美國(guó)Phenomenex公司)；Inertsil ? ODS-3 C18色譜柱(4.6mm×250 mm，5 μm)(日本島津公司)。

1.2試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.8%)；原兒茶酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110809-200604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100.0%)；落新婦苷對(duì)照品(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號(hào)：V7840010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.8%)；白藜蘆醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110535-200301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100.0%)；甲醇，乙腈為色譜純；磷酸，乙醇為分析純；水為自制純化水。

菝葜藥材(見表1)，市場(chǎng)購入，經(jīng)由麗水市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院王建偉副主任中藥師鑒定均為2020年版《中國(guó)藥典》收載品種百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖，分別粉碎，過三號(hào)篩，備用。

表1 菝葜藥材一覽

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 AgilentEclipse PlusSB-C18(4.6mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，A 10%→15%；10～20 min，A 15%→25%；20～28 min，A 25%→30%；28～35 min，A 30%→40%；35～50 min，A 40%→70%)，流速為1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm；進(jìn)樣量為5 μL；理論塔板數(shù)按綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷與白藜蘆醇計(jì)均不得低于5000。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷與白藜蘆醇對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含綠原酸573.06 μg、原兒茶酸223.00 μg、落新婦苷543.41 μg、白藜蘆醇218.60 μg的溶液，作為儲(chǔ)備液。精密吸取4種儲(chǔ)備液制成每1 mL含綠原酸57.31 μg、原兒茶酸22.30 μg、落新婦苷54.4 μg、白藜蘆醇21.86 μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液(各成分均已按其質(zhì)量分?jǐn)?shù)折算)。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置磨口錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，90～95 ℃水浴中回流提取60 min，放冷至室溫，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取“2.2.1”與“2.2.2”項(xiàng)下溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷、白藜蘆醇與其他成分均可達(dá)到基線分離，分離度均>1.5，理論塔板數(shù)均>10 000，分離效果良好。用 DAD檢測(cè)器進(jìn)行峰純度檢查，純度因子均滿足閾值限值要求(閾值為 990)。

A.對(duì)照品；B.菝葜；1.原兒茶酸；2.綠原酸；3.落新婦苷；4.白藜蘆醇

2.3.2線性關(guān)系考察 吸取混合對(duì)照品溶液1，2，5，8，10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量X進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 4種成分的線性關(guān)系、檢出限、定量限

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下溶液，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果，4種成分峰面積的RSD為0.65%～1.62%，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、6、12、18、24、36 h按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果，4種成分峰面積RSD為0.97%～1.35%，表明供試品溶液在制備后36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取BQ-1樣品，平行取樣6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各成分含量。結(jié)果，4種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.89%～1.26%，表明該測(cè)定方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.6回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的菝葜(BQ-1)6份，各約0.5 g，精密稱定，置磨口錐形瓶中，分別精密加入綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液0.5、1.0、0.5、0.5 mL和70%乙醇47.5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備回收率試液，按“2.1”色譜條件測(cè)定，測(cè)定各成分的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果，4種成分的平均加樣回收率為100.38%～100.72%、RSD為0.72%～1.43%，表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確度良好，方法可行。

2.4相對(duì)校正因子(RCF)的確定

2.4.1RCF的計(jì)算 取“2.2.1”項(xiàng)下溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、8、10、20 μL，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以綠原酸為內(nèi)參物，按公式

計(jì)算原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇的RCF，結(jié)果見表4。

表4 菝葜中3種成分的RCF

2.4.2RCF重現(xiàn)性考察 取“2.2.1”項(xiàng)下溶液，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別考察安捷倫1260、島津Lc-20AT高效液相色譜儀和4.6 mm×250 mm，5 μm規(guī)格的4根色譜柱(Agilent Eclipse Plus C18、Agilent ZorbaxSB-C18、Phenomenex Luna C18、Inertsil ? ODS-3 C18)對(duì)原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇的RCF的影響，結(jié)果見表5，RSD均小于2%，表明該方法重現(xiàn)性好。

表5 不同高效液相色譜儀、不同色譜柱測(cè)得的RCF

2.4.3RCF的確定 依據(jù)相關(guān)技術(shù)指南和相關(guān)研究[17-20]，綜合考慮影響RCF的因素，取“2.4.1”與“2.4.2”試驗(yàn)所得的所有RCF的平均值，最終確定原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇的RCF分別為2.340、1.566、0.307，RSD分別為1.38%(n=14)、1.58%(n=14)、1.33%(n=14)。

2.5待測(cè)組分色譜峰的定位 取“2.2.1”項(xiàng)下溶液，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別考察安捷倫1260、島津Lc-20AT高效液相色譜儀和同樣為4.6 mm×250 mm，5 μm規(guī)格的4根色譜柱(Agilent Eclipse Plus C18、Agilent Zorbax SB-C18、Phenomenex Luna C18、Inertsil ? ODS-3 C18)，測(cè)定并計(jì)算待測(cè)組分原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇與內(nèi)參物綠原酸的相對(duì)保留值(RRT)，結(jié)果見表6。結(jié)果表明原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇的相對(duì)保留值波動(dòng)較小，RSD均小于5%(n=8)。

表6 不同色譜儀、不同色譜柱測(cè)得各成分的相對(duì)保留值

2.6QAMS與ESM測(cè)定結(jié)果的比較 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別采用QAMS法與ESM法計(jì)算綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇的含量，結(jié)果見表7。ESM法實(shí)測(cè)值與QAMS計(jì)算值的相對(duì)誤差(RE)小于3%，表明2種方法得到的結(jié)果無顯著差異，說明本試驗(yàn)建立的以綠原酸為內(nèi)標(biāo)的QAMS法在菝葜的多指標(biāo)成分定量分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用是適用的、可行的。

表7 QAMS與ESM測(cè)定結(jié)果比較(n=2)

3 討論

參考相關(guān)研究[2-4,8]，發(fā)現(xiàn)以乙腈-水系統(tǒng)加入少量磷酸分離效果較理想且峰形較佳、分析時(shí)間短；預(yù)實(shí)驗(yàn)采用多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定，結(jié)合190～400 nm波段紫外掃描的結(jié)果，確定306 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。所建立的色譜條件下，綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇4種成分的分離效果均良好。本實(shí)驗(yàn)所選的綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇4種物質(zhì)中，綠原酸性質(zhì)穩(wěn)定且最價(jià)廉易得，故選擇其作為內(nèi)參物進(jìn)行QAMS的分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，綠原酸作為該QAMS的內(nèi)參物是適宜的。

QAMS應(yīng)用的前提是色譜峰的準(zhǔn)確定位，一般采用相對(duì)保留值(RRT)或保留時(shí)間差等方式定位色譜峰。本試驗(yàn)選擇RRT作為考察參數(shù)，結(jié)果顯示綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇4種物質(zhì)在不同品牌、相同品牌不同類型的色譜柱中均有良好的穩(wěn)定性，RRT波動(dòng)小，所建立的方法適用性良好。

本試驗(yàn)所建立的QAMS與ESM法在菝葜的綠原酸、原兒茶酸、落新婦苷和白藜蘆醇4種成分含量測(cè)定中無顯著差異，該QAMS法實(shí)現(xiàn)一種價(jià)廉對(duì)照品同步測(cè)定4種成分，為菝葜的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一種經(jīng)濟(jì)、高效、實(shí)用的多指標(biāo)質(zhì)控方法。