唐敏，王淑敏，王歡，陳長(zhǎng)寶，王恩鵬，陳雪，李瓊

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

猴頭菌（Hericium erinaceus）隸屬擔(dān)子門(mén)（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）紅菇目（Russulales）猴頭菌科（Hericiaceae）猴頭菌屬（Hericium）[1]，作為珍貴的藥食兼用菌，其富含多肽、萜類(lèi)和甾醇等多種活性物質(zhì)，具有保肝護(hù)胃、降血糖、保護(hù)神經(jīng)、抗輻射、抗腫瘤及抗癌等功效[2-6]。猴頭菇經(jīng)發(fā)酵后，分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物藥理活性作用更大。人參（Panax ginseng C.A.Mey.）屬多年生宿根陰性草本雙子葉植物，為傳統(tǒng)的名貴中草藥之一，含有多種人參皂苷、人參多糖、萜類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化和抗菌等[7-12]。人參經(jīng)發(fā)酵后，其發(fā)酵產(chǎn)物中稀有皂苷種類(lèi)及含量明顯上升。發(fā)酵后的人參燥性大幅度降低，使人參的藥性更加溫和耐用，更易被人體吸收。

本研究主要以猴頭菌與人參進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，即以猴頭菌為發(fā)酵菌種，人參為藥性基質(zhì)進(jìn)行雙向固體發(fā)酵的過(guò)程。通過(guò)猴頭菌的生物學(xué)活性物質(zhì)分解代謝人參中的纖維、蛋白質(zhì)和糖類(lèi)等成分為自身提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)及能量，同時(shí)，利用次生代謝產(chǎn)物對(duì)人參中的活性成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造，從而得到新的藥效活性成分。與未進(jìn)行發(fā)酵的猴頭菌和人參相比，發(fā)酵菌質(zhì)中兼具猴頭菌和人參的藥效活性作用，同時(shí)提高了人參中某些活性皂苷含量及猴頭菌中麥角甾醇和麥角甾酮等活性物質(zhì)的含量。本研究以猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)提取液為原材料進(jìn)行口服液開(kāi)發(fā)，并著重對(duì)口服液的澄清工藝進(jìn)行研究。

中藥提取液中成分較為復(fù)雜，既含有多種有效成分，也含有如色素、鞣質(zhì)、果膠和蛋白質(zhì)等影響中藥提取液澄清度和穩(wěn)定性的高分子物質(zhì)[13]。在中藥提取液加工的過(guò)程中，澄清度作為反應(yīng)產(chǎn)品外觀和穩(wěn)定性的指標(biāo)之一，具有十分重要的地位。目前，提高澄清度的方法有自然沉淀法、膜分離法、水提醇沉法、高速離心法和吸附劑澄清法等[14]。其中，自然沉淀法耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)且澄清效果不佳；膜分離法在中藥制劑生產(chǎn)中易造成膜堵塞，降低膜使用壽命，造成中藥中有效成分保留率降低；水提醇沉法和吸附劑澄清法應(yīng)用較為廣泛。據(jù)報(bào)道，在吸附劑澄清法中，殼聚糖是最常用的澄清劑之一，是世界上第二大天然可再生資源，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單，毒性低，具有良好的生物可降解和生物相容性等特點(diǎn)，在果汁、中藥制劑及功能性飲料等制備過(guò)程中得到了廣泛的應(yīng)用[15]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素考察及正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)口服液的澄清工藝進(jìn)行研究。

希望通過(guò)本文的研究結(jié)果，為口服液的工藝開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為發(fā)酵菌質(zhì)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供思路。同時(shí)，希望以“藥用真菌雙向發(fā)酵工程”的新型發(fā)酵技術(shù)為橋梁，推動(dòng)猴頭菌和人參市場(chǎng)的二次開(kāi)發(fā)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

猴頭菌由吉林省生物研究所張金亭研究員贈(zèng)予；人參購(gòu)自吉林省怡生對(duì)外貿(mào)易有限公司；葡萄糖、無(wú)水葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母粉及瓊脂粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、正丁醇和三氯甲烷購(gòu)自北京化工廠；3,5-二硝基水楊酸、殼聚糖和人參皂苷Re購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；香草醛購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；檸檬酸、木糖醇和山梨酸鉀購(gòu)自南通奧凱生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YXQ-LS-50A壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；ZQZY-85CNS震蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；BT25S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；A11BS025粉碎機(jī)（德國(guó)IKA）；SWCJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN集團(tuán)公司）；Centrifuge 5810 R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 固體發(fā)酵菌質(zhì)提取物的制備

將保存于4℃冰箱中的猴頭菌菌種轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，在26℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)至菌絲布滿培養(yǎng)基表面。取適量固體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基（葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO4 2 g、MgSO4 7 H2O 1 g、蒸餾水1 L）中，在26℃、160 r/min的黑暗條件下進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)液體搖瓶中含有大量黃色菌球時(shí)，終止液體發(fā)酵，備用。將人參藥材粉碎，過(guò)篩，裝至固體發(fā)酵培養(yǎng)瓶，加入適量水，121℃高壓滅菌30min，待人參基質(zhì)冷卻至室溫后，將上述液體發(fā)酵菌種接至人參藥性基質(zhì)中，避光培養(yǎng)至猴頭菌菌絲布滿整個(gè)藥性基質(zhì)且形成明顯的菌蕾結(jié)構(gòu)，即得到發(fā)酵菌質(zhì)。將發(fā)酵菌質(zhì)于40℃條件下烘干，密封保存。

2.2 口服液的制備工藝

根據(jù)前期對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究，結(jié)合文獻(xiàn)中關(guān)于人參、猴頭菌及其他藥食兩用物質(zhì)的口服液制備的研究，考慮實(shí)際生產(chǎn)設(shè)備及生產(chǎn)成本等諸多方面因素影響，制定猴頭菌人參口服液的制備工藝路線。研究表明，發(fā)酵菌質(zhì)水提液中含有大分子蛋白質(zhì)，可能在一定程度上會(huì)對(duì)口服液的澄清度及穩(wěn)定性產(chǎn)生復(fù)合影響?？诜鹤鳛橐环N直接吸收的內(nèi)服制劑，考慮到藥效及對(duì)人體安全性的要求，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化。

猴頭菌人參發(fā)酵菌質(zhì)口服液制備工藝路線如下圖所示：

圖1 猴頭菌-人參固體雙向發(fā)酵菌質(zhì)口服液工藝研究流程圖Fig.1The process flow chart of ginseng solid two-way fermentation fungal substance oral liquid

2.3 樣品提取液的制備

本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮法進(jìn)行提取，通過(guò)前期考察，影響提取效果的因素主要有料液比、提取次數(shù)和提取時(shí)間。根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比為8:1、提取次數(shù)為3次、提取時(shí)間為2 h為最佳提取工藝對(duì)菌質(zhì)進(jìn)行提取。

2.4 殼聚糖對(duì)澄清度的影響

取1.0 g殼聚糖，加入100 mL的1%體積分?jǐn)?shù)乙酸溶液，并在80℃水浴中溶脹2 h，攪拌15 min直至均勻，冷藏備用。取猴頭菌人參固體雙向發(fā)酵菌質(zhì)提取物25.0 mL，在水提液中邊加邊攪拌1%的殼聚糖溶液，并在室溫下磁力攪拌保持15min，室溫靜置24h，取上清即得。

2.4.1 單因素考察以溶液中含有的人參總皂苷含量和多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，依次考察殼聚糖加入量、絮凝溫度、攪拌速度對(duì)口服液澄清度的影響。各因素水平分別設(shè)置為殼聚糖加入量為4%、6%、8%、10%和12%，絮凝溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，攪拌速度分別為160 r/min、320 r/min、480 r/min、640 r/min和800 r/min。建立因素水平表，如表1所示，每次試驗(yàn)時(shí)做3組平行試驗(yàn)。

表1 因素水平表Table 1 The table of the factor level

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步對(duì)澄清工藝考察，結(jié)合單因素的考察結(jié)果，以人參皂苷含量和多糖含量的權(quán)重系數(shù)各為50%為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立正交表，根據(jù)表2進(jìn)行正交試驗(yàn)考察。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Results of the orthogonal test design x

2.5 醇濃度對(duì)澄清度的影響

將猴頭菌 人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)20 g放入燒杯中，加適量蒸餾水浸泡1 h后，進(jìn)行煎煮。取煎煮液靜置冷卻后用8層紗布濾去殘?jiān)ㄈ葜?00 mL，使25mL的提取液相當(dāng)于1 g生藥量。取50 mL提取液加入乙醇進(jìn)行醇沉，調(diào)節(jié)醇的終濃度分別達(dá)到40%、50%、60%、70%和80%，以此對(duì)醇濃度進(jìn)行考察。將攪拌均勻的醇沉液于4℃靜置24 h后，6 000 r/min離心10 min，棄去下層沉淀殘?jiān)蒙锨逡?。以加?quán)值=人參總皂苷含量50%+多糖含量50%為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)不同醇濃度條件下的澄清工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.6 指標(biāo)評(píng)價(jià)方法

2.6.1 人參總皂苷含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備：精密稱定人參皂苷Re對(duì)照品10mg，加入甲醇，置于10mL容量瓶中，定容至刻度后搖勻，即得1 mg/mL的Re標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液的制備：按GB/T 18765-2015的方法稍做改動(dòng)，精確量取提取液30 mL，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加三氯甲烷30 mL振搖萃取，棄去三氯甲烷，重復(fù)3次，繼續(xù)用水飽和正丁醇30 mL振搖萃取，重復(fù)3次，合并正丁醇層液體，水浴鍋蒸干，殘?jiān)眉状既芙夂螅D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻備用。

分析結(jié)果計(jì)算：以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示的人參總皂苷含量（X）按下式計(jì)算：

公式中m1：稱取對(duì)照品的量，mg；m2：稱取樣品的量，mg；A1：對(duì)照品溶液的吸光度；A2：樣品溶液的吸光度。

2.6.2 總糖含量測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[16]稍作改動(dòng)，采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：將烘干至恒重的無(wú)水葡萄糖配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，精確移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1 mL于具塞的刻度試管中，并用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，震蕩混勻。依次加入5%苯酚1 mL、硫酸5 mL，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫，取出。以蒸餾水為空白，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。待測(cè)樣品如上條件進(jìn)行測(cè)定。

2.6.3 還原糖含量測(cè)定參考[17]稍作修改，采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定總還原糖（DNS）。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：將烘干至恒重的無(wú)水葡萄糖配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，精確移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1 mL于具塞的刻度試管中，以蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，震蕩混勻，加入DNS溶液2 mL，混勻后，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加入蒸餾水9 mL，混勻，以蒸餾水為空白，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。待測(cè)樣品如上條件進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 殼聚糖對(duì)澄清度的考察

3.1.1 殼聚糖用量的考察由表3可知，當(dāng)殼聚糖用量逐漸增加時(shí)，菌質(zhì)提取液的澄清度逐漸增加，當(dāng)殼聚糖加入量為6%時(shí)，溶液達(dá)到幾乎澄清透明，綜合評(píng)分也達(dá)到了最高。隨著殼聚糖用量的增加，溶液的澄清度有所增加，但有效成分的含量呈下降趨勢(shì)。綜合工業(yè)生產(chǎn)成本及操作性，本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖加入量為6%時(shí)為最佳條件。

表3 殼聚糖加入量考察結(jié)果Table 3 The results of the investigation of chitosan addition amount

3.1.2 溫度的考察由表4可知，溫度對(duì)菌質(zhì)提取液的有效成分含量有較大的影響，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，多糖含量和總皂苷含量的綜合評(píng)分值最高，在此條件下，溶液的澄清度達(dá)到了無(wú)沉淀的要求，溶液的顏色也開(kāi)始向淺顏色轉(zhuǎn)變。當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，溶液中澄清度沒(méi)有達(dá)到很好的清除效果，溫度過(guò)高時(shí)會(huì)損失有效物質(zhì)含量，所以綜合影響因素，本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖加入溫度為40℃為最佳條件。

表4 殼聚糖加入溫度考察結(jié)果Table 4 The results of the investigation of chitosan adding temperature

3.1.3 攪拌速度的考察殼聚糖加入的速度會(huì)直接影響絮凝作用，攪拌速度直接影響殼聚糖與溶液中雜質(zhì)的結(jié)合程度，故本實(shí)驗(yàn)選取攪拌速度為澄清工藝的篩選條件之一。從表5可知，隨著攪拌速度增加，菌質(zhì)提取液溶液顏色由深變淺，澄清度逐漸增加，殼聚糖對(duì)溶液中的雜質(zhì)清除能力越強(qiáng)。當(dāng)攪拌速度為640 r/min時(shí)，提取液的澄清度達(dá)到要求且有效物質(zhì)含量損失較小，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)效率及條件，本實(shí)驗(yàn)選取攪拌速度為640 r/min時(shí)為最優(yōu)條件。

表5 殼聚糖加入攪拌速度考察結(jié)果Table 5 The results of the investigation of the mixing speed of chitosan

3.2 澄清工藝正交考察

為優(yōu)化發(fā)酵菌質(zhì)口服液的澄清工藝，以人參藥材中有效成分人參皂苷和多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分法，按表2實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行3因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 澄清工藝正交試驗(yàn)與結(jié)果L9（34）Table 6 The orthogonal test and results of the clarification process L9(34)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以殼聚糖加入量（%）、絮凝溫度（℃）、攪拌速度（r/min）為討論因素，以多糖含量和總皂苷含量的加權(quán)值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。由上表數(shù)據(jù)可知，3個(gè)因素對(duì)猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)提取液品質(zhì)的影響作用大小為A＞B＞C，即殼聚糖用量對(duì)澄清度影響最大，其次是絮凝溫度，攪拌速度的影響最小。猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)口服液澄清工藝最優(yōu)組合為A1B3C3，即殼聚糖加量4%、絮凝溫度60℃、攪拌速度640 r/min，在此條件下有效成分的含量最高。

3.3 澄清優(yōu)化工藝驗(yàn)證

對(duì)上述澄清優(yōu)化得到的猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)口服液最佳澄清工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表7所示，正交試驗(yàn)所得的猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)口服液最佳澄清工藝條件，平行3組實(shí)驗(yàn)具有較好的重復(fù)性，工藝穩(wěn)定，可操作性強(qiáng)，可作為最佳的澄清工藝條件。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of the verification experiment

3.4 醇濃度考察

由表8的數(shù)據(jù)可知，當(dāng)對(duì)醇濃度為40%、50%、60%、70%和80%進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)醇濃度為40%時(shí)，提取液中有效成分損失較少，有效成分的含量最高，且加權(quán)值最大，在本實(shí)驗(yàn)條件下以40%醇濃度為醇沉工藝中的最佳條件。

表8 醇濃度考察結(jié)果Table 8 Results of the alcohol concentration investigation

4 討論

本研究以猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)為原材料，選用絮凝劑殼聚糖和醇沉兩種澄清方法，以人參總皂苷及多糖含量綜合加權(quán)值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，添加適量的矯味劑及防腐劑進(jìn)行口服液的澄清工藝開(kāi)發(fā)，篩選出生產(chǎn)猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵口服液的最佳澄清工藝。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可看出，相比于殼聚糖澄清法，醇沉法對(duì)提取液中有效成分的含量損失較大，且在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中需要耗費(fèi)大量的乙醇。綜合考慮工廠生產(chǎn)的儀器設(shè)備、資金成本和安全性，口服液中有效物質(zhì)含量等因素，最終選擇以殼聚糖加入量4%、絮凝溫度60℃、攪拌速度640 r/min為口服液最佳澄清工藝。

本研究為猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)口服液的批量生產(chǎn)提供提取工藝及澄清工藝的基礎(chǔ)研究，確定了最佳澄清工藝。希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，能為菌質(zhì)的二次開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)，為促進(jìn)人參及猴頭菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、推進(jìn)猴頭菌人參雙向固體發(fā)酵產(chǎn)品的精深加工提供技術(shù)參考。