microRNA與功能性腸病

鄢香蕓 姚俊鵬 張微 楊雨晴 牟林軒 陳敏 李瑛

1成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院/第三附屬醫(yī)院（成都610075）；2成都中醫(yī)藥大學教務(wù)處（成都611137）；3成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院/附屬醫(yī)院（成都610075）；4成都中醫(yī)藥大學研究生院（成都610075）

功能性腸?。╢unctional bowel disease，F(xiàn)BD）是由腸道功能紊亂導(dǎo)致的以腹痛、腹脹、和排便習慣改變等為主要癥狀的一系列腸道疾病，臨床以腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）和功能性便秘（functional constipation，F(xiàn)C）最常見［1］。FBD 由多種因素誘發(fā)，腸屏障/運動功能、內(nèi)臟高敏感性、炎癥反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)及腦?腸互動異常等因素可能參與FBD 的發(fā)病機制。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約22 個核苷酸，進化上高度保守的內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNA 在基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用，其代表了一種新的作用模式，具有精確傳遞信號和放大信號的能力［2］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 通過對FBD 靶基因的調(diào)控及相關(guān)信號通路的活化在腸黏膜屏障、腸道動力、內(nèi)臟超敏、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。深入研究miRNA與FBD 的關(guān)系對闡釋該類疾病的潛在生物標志物、治療靶標及發(fā)病機制等方面具有重要意義。目前miRNA 在功能性腸病中的作用已是研究熱點，因此本文將miRNA 在FBD 中作用的研究進展綜述如下。

1 microRNA 概述

miRNA 指在內(nèi)源性非編碼RNA 中一類長度約為22 個核苷酸的單鏈小分子RNA，其靶基因種類繁多且數(shù)目巨大，廣泛地參與到許多細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中。miRNA 經(jīng)由三個階段加工成熟：首先在細胞核中，miRNA 被RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為含有5′帽和3′聚（A）尾的pri?microRNA；之后由RNaseⅢ酶Drosha 和雙鏈RNA 結(jié)合蛋白DGCR8 組成的復(fù)合體切割得到長度約為70 個核苷酸的前體miRNA；最后前體miRNA 被轉(zhuǎn)運蛋白運出到細胞質(zhì)，由另一種RNase Ⅲ型酶Dicer 和AGO 蛋白加工處理為長度約22 個核苷酸的成熟miRNA。miRNA可通過交叉調(diào)節(jié)、自我調(diào)節(jié)、可逆性調(diào)節(jié)等方式在轉(zhuǎn)錄后水平與靶mRNA 特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA 降解或抑制其翻譯，實現(xiàn)靶基因表達的負調(diào)控［3］。miRNA 不僅是遺傳信息的內(nèi)源性調(diào)控者，也是細胞間遠距離通訊的媒介。研究證實，miRNAs 在體液中經(jīng)細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）或胞外小體穩(wěn)定遷移，被靶細胞內(nèi)吞后介導(dǎo)信號的遠距離傳導(dǎo)［4］。每個miRNA 可同時調(diào)節(jié)多個靶基因，不同的miRNA 也可以協(xié)同調(diào)控同一靶基因，由此形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精細調(diào)控基因的表達，廣泛參與細胞的增殖、分化和凋亡等多個環(huán)節(jié)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。

2 microRNA 在FBD 不同組織中的表達

MART?NEZ 等［6-7］分析了FBD 和健康受試者腸組織中miRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)miR?16 和miR?103 在IBS?D 患者空腸黏膜中的表達顯著下調(diào)。而在慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）患者結(jié)腸組織中，存在13 個表達上調(diào)的miRNA。進一步研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)誘導(dǎo)的STC 大鼠模型和體外培養(yǎng)的結(jié)腸平滑肌細胞中，過表達的Let?7f 可能通過下調(diào)SCN5A 基因的表達，降低鈉離子通道NaV1.5 的電流密度和腸道平滑肌收縮性，進而減緩結(jié)腸傳輸功能。提示Let?7f 可能作為腸道傳輸功能的分子調(diào)節(jié)器，在STC 或其他腸道動力性疾病的病理生理中扮演重要的角色。

miRNA 不僅定位于結(jié)腸細胞內(nèi)，還會被轉(zhuǎn)運到細胞外，可以在血液、尿液等體液中檢測其含量。GUO 等［8］發(fā)現(xiàn)IBS?D 患者血清中miR?1305、miR?575、miR?149、miR?190、miR?135a、miR?210、miR?148a 和miR?151?3p 表達顯著上調(diào)；而miR?22、miR?483?3p、miR?194、miR?887、miR?1、miR?127?5p 和miR?892b 表達明顯下調(diào)。監(jiān)測外周血中miRNA 的表達水平可能為FBD 的臨床診斷提供了一種非侵入性的生物學指標。血液微泡是EVs 的一種，能通過彌散、內(nèi)吞等方式進入靶細胞，轉(zhuǎn)運特異性蛋白、miRNA 等生物活性物質(zhì)，促進細胞間信息交流。IBS?D 患者血液微泡中miR?29a 表達增加，推測其可作為腸膜通透性增強的IBS?D 患者的獨特分子標記物［9］。此外，IBS 不同亞型患者外周血中miRNA 表達也存在差異。不確定型和混合型IBS 患者血清中miRNA?144、miRNA?29a 和miRNA?200a 表達水平顯著高于其他亞型。而單純便秘型和腹瀉型IBS 僅miRNA?29a 和miRNA?200a 表達水平存在差異［10］。由此可見，miRNA 在外周血的差異表達為臨床IBS 分型及診斷提供參考。

在FBD 動物模型的研究中，有學者運用液相芯片技術(shù)結(jié)合RT?PCR 驗證的方法，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)臟超敏大鼠結(jié)腸黏膜中，let?7f、let?7i、miR?130b、miR?29a、miR?132、miR?21 和miR?375 的表達上調(diào)，而miR?24、miR?31a、miR?192、miR?221 和miR?223 的表達下調(diào)［11］。在嗎啡加大黃誘導(dǎo)的STC 雌鼠結(jié)腸組織中，miR?128 的表達顯著下調(diào)，與該團隊前期的臨床研究結(jié)果一致，這顯示出miR?128 作為STC診斷生物標志物的運用前景［12］。

miRNA 在外周血和腸組織中存在差異性表達（表1），表明miRNA 可能參與調(diào)節(jié)FBD 的發(fā)生發(fā)展，這為FBD 的生物學診斷提供了新靶標。

表1 部分miRNA 在功能性腸病中的表達Tab.1 The expression of miRNAs in functional bowel diseases

3 miRNA與FBD 發(fā)病機制

3.1 miRNA與腸黏膜屏障腸黏膜屏障分為機械屏障、免疫屏障、生物屏障與化學屏障，各個屏障結(jié)構(gòu)和功能上的完整由緊密連接蛋白、促炎癥細胞因子和腸道菌群等共同維持［13］，能有效阻擋致病微生物和有毒化合物進入循環(huán)，維持機體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。屏障受損可導(dǎo)致腸道功能紊亂，甚至敗血癥和多器官功能障礙等全身性病變［14］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 在基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，能從多種途徑調(diào)控相應(yīng)的靶基因調(diào)節(jié)腸屏障功能。

3.1.1 緊密連接緊密連接是機械屏障中最為重要的一環(huán)，主要包括咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）、連接黏附分子（JAM）和閉合小環(huán)蛋白（ZOs）。這四種跨膜蛋白和分子將相鄰的腸上皮細胞連接在一起，維持細胞極性和黏膜屏障功能［15］。

在IBS?D 患者空腸活檢組織中，miR?125b 和miR?16 表達降低，靶向上調(diào)緊密連接蛋白的表達，促進腸上皮屏障功能恢復(fù)［16］。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，IBS?D 模型小鼠結(jié)腸miRNA?29a 表達升高，靶基因ZO1和CLDN1 表達降低，結(jié)腸黏膜損傷進行性加重；敲除miR?29 基因后，可顯著上調(diào)CLDN1 和NKRF的表達來逆轉(zhuǎn)腸黏膜的高通透性［9，17］。由此表明miR?29a 可通過靶向抑制緊密連接蛋白加重腸黏膜屏障損傷。另一項體外研究發(fā)現(xiàn)miR?144 對緊密連接蛋白也具有類似的調(diào)控作用［18］。

3.1.2 免疫與炎癥反應(yīng)低等級的粘膜炎癥和免疫激活與FBD 免疫屏障功能損傷和神經(jīng)元異常敏感性有關(guān)。巨噬細胞和肥大細胞作為一類重要的固有免疫細胞群，廣泛分布于皮膚、消化道和氣道等部位，以及時應(yīng)對環(huán)境中的變應(yīng)原做出免疫應(yīng)答。當機體受到外界刺激，如微環(huán)境改變，生理和心理應(yīng)激等均可使腸道內(nèi)大量的炎癥細胞迅速活化，釋放多種生物活性介質(zhì)和細胞因子，引發(fā)內(nèi)皮和上皮的通透性增加［19-20］。而miRNA 作為一種重要的細胞間通訊分子，亦參與調(diào)節(jié)胃腸道炎癥反應(yīng)。有研究表明［21］，F(xiàn)C 患者結(jié)腸組織中異常增加的巨噬細胞和肥大細胞與miR?128 表達下調(diào)相關(guān)，且過表達的miR?128 可下調(diào)FC 患者結(jié)腸組織中肥大細胞數(shù)量，抑制胃腸道炎癥反應(yīng)。此外，miR?181c?5p 可以負調(diào)控炎性因子IL1A 的表達，減輕由冰醋酸灌腸聯(lián)合直腸球囊刺激誘導(dǎo)的IBS 大鼠的腸道炎癥反應(yīng)［22］。類胰蛋白酶/PAR2 是經(jīng)典的炎癥信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA?490?5p可激活肥大細胞類胰蛋白酶/PAR2 信號通路，誘發(fā)IBS?D 腸道黏膜的持續(xù)低度炎癥反應(yīng)［23］。

3.1.3 腸道菌群腸道菌群是腸道生物屏障中的重要部分，參與腸黏膜上皮細胞的增殖、分化。腸道微生物群的失衡可能促進病原體與腸壁粘附，損害腸屏障功能［24］。

miRNA 可作為宿主細胞與腸道細菌交流的橋梁，由宿主細胞發(fā)送后進入細菌內(nèi)，調(diào)節(jié)細菌基因的表達和生長，維持腸道穩(wěn)態(tài)［25］。研究發(fā)現(xiàn)腸上皮細胞和Hopx 基因陽性細胞（如杯狀細胞）的miRNA 可進入腸道細菌體內(nèi)，靶向調(diào)節(jié)細菌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，造成腸道菌群相關(guān)代謝途徑的改變，影響細菌生長；而miRNA 缺陷型小鼠更容易出現(xiàn)腸道菌群紊亂，在給予糞便miRNA 移植后可重塑其腸道菌群并減輕胃腸道癥狀［26］。MANSOUR 等［27］首次研究了大腸菌群和血清miRNA?199b 水平的具體關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，IBS 及不同亞型患者糞便培養(yǎng)中大腸菌群數(shù)量顯著增加，血清中miRNA?199b 表達明顯下降，兩者呈負相關(guān)，表明miRNA 可能對腸道菌群起負調(diào)控的作用。

此外，腸道菌群也能調(diào)節(jié)miRNA 在FBD 中的表達。腸道共有細菌過分泌的肽聚糖可通過Toll樣受體2/4 信號途徑誘導(dǎo)腸上皮細胞miR?21?5p的轉(zhuǎn)錄，抑制厭氧菌、梭狀芽孢桿菌Ⅳ等有益菌的翻譯，導(dǎo)致SCFAs、二氧化碳、甲烷等含量減少［28］。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌L.caseiLC01 通過抑制腸上皮細胞中miR?144 的表達水平，上調(diào)緊密連接蛋白的表達，促進IBS 患者腸上皮屏障功能恢復(fù)［18］。當前，益生菌制劑治療FBD 的有效性已被證實［29］，但miRNA與腸道菌群的相關(guān)性在FBD 中的研究相對較少，值得深入探討兩者的關(guān)系和調(diào)控機制，為FBD 的臨床診斷和治療提供新靶點。

3.2 MicroRNA與內(nèi)臟高敏內(nèi)臟高敏指內(nèi)臟組織對刺激過度反應(yīng)，與神經(jīng)信號的傳導(dǎo)密切相關(guān)。有研究者通過慢病毒基因沉默技術(shù)使miRNA?490?5p 表達下調(diào)，降低內(nèi)臟高敏模型大鼠的結(jié)腸敏感程度［30］。

miR?199a 能抑制瞬態(tài)受體勢葉片蛋白1 型（TRPV1）離子通道的活性，減弱感覺神經(jīng)元的信號傳導(dǎo)；腹腔注射lenti?miR?199a 前體可上調(diào)miR?199a 的表達，減少TRPV1 信號來降低內(nèi)臟超敏反應(yīng)［31］。提示miR?199a 的降低可能是IBS 患者內(nèi)臟高敏的關(guān)鍵因素。而miR?199 前體可能是內(nèi)臟疼痛患者的候選治療方法。大麻素受體1（CNR1）是內(nèi)臟超敏的重要調(diào)節(jié)劑，與FBD 中的癥狀表型、疼痛知覺、神經(jīng)傳播抑制和結(jié)腸轉(zhuǎn)運有關(guān)［32］，抑制CNR1 的表達可增強內(nèi)臟敏感性。體內(nèi)實驗表明，miR?200a 可通過下調(diào)CNR1 和血清素轉(zhuǎn)運體SERT的表達來誘導(dǎo)內(nèi)臟超敏，加重或?qū)е翴BS?D 的發(fā)病［33］。

在WAS 誘導(dǎo)的IBS 小鼠的結(jié)腸上皮細胞中，神經(jīng)遞質(zhì)5?HT 受體HTR7 是miRNA?29a 的靶基因；敲除IBS 小鼠miRNA?29a 能增加HTR7 水平，減輕胃腸道癥狀和腹痛嚴重程度。體外實驗證實，miRNA?29a 抑制劑增強了HTR7 的表達，而模擬miRNA?29a 可下調(diào)腸道上皮細胞中HTR7 的表達［34］。表明miRNA?29a 可以負性地調(diào)節(jié)HTR7 的表達，miRNA?29a 抑制劑在腸道高敏的預(yù)防和治療中有應(yīng)用價值。

3.3 miRNA與腸動力腸道動力失調(diào)是FBD發(fā)病的重要機制。研究表明，miR?let?7f、miR?let?7e、miR?200a?3p 和miR?429 可通過抑制靶基因SCN5A的表達，降低結(jié)腸平滑肌細胞NaV1.5 通道的電流密度，進而增加平滑肌條收縮頻率及振幅，改善腸道動力［7］。平滑肌細胞特異性敲除miRNAs 基因的小鼠，平滑肌表型、功能及基因表達譜急劇變化這一現(xiàn)象也佐證上述觀點［35］。

腸道間質(zhì)細胞（interstitial cell of cajal，ICC）分布于胃腸道內(nèi)各肌層，是腸神經(jīng)元與平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）的中間媒介。ICC 還是胃腸慢波活動的起搏細胞，除極化后觸發(fā)慢波，通過縫隙連接傳遞至SMC，引起平滑肌收縮。有團隊［36-38］運用基因芯片技術(shù)檢測STC 患者病變結(jié)腸組織中miRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)miR?128 和miR?129 表達明顯下調(diào)。為進一步探索miRNA 調(diào)控腸動力的信號通路，該團隊從重度STC 患者病變結(jié)腸組織中取樣，發(fā)現(xiàn)miR?128 可通過調(diào)節(jié)SCF 和IGF 信號通路改變結(jié)腸ICC 的形態(tài)；而miR?129 可能通過調(diào)控N 乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1/轉(zhuǎn)化生長因子?β1信號通路，誘導(dǎo)ICC 細胞轉(zhuǎn)分化，影響腸道蠕動。在STC 大鼠模型結(jié)腸組織中，miR?222 過表達使c?kit 和干細胞因子表達水平下降，誘導(dǎo)ICC 細胞凋亡和自噬過度［39］。這些研究充分證實，miR?128、miR?129 和miR?222 可通過調(diào)節(jié)胃腸動力相關(guān)細胞的形態(tài)和功能參與FBD 的發(fā)病機制，是FBD 的重要研究靶點。

4 討論

功能性腸病是一類以慢性或反復(fù)發(fā)作的腸道癥狀為診斷標準的非器質(zhì)性疾病，以IBS 和FC最常見。流行病學調(diào)查研究顯示，F(xiàn)BD 患病率為28.6%～ 31.7%［40］，其高發(fā)病率和病程的持久性嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和身心健康。臨床上FBD 的診斷缺乏“金標準”，往往是結(jié)合臨床表現(xiàn)、腸鏡檢查等，排除其它器質(zhì)性腸道疾病后確診；而治療多是以改善癥狀為主的多學科綜合模式。研究發(fā)現(xiàn)［41］，約有46%的FBD 患者常陷入反復(fù)就醫(yī)的痛苦當中，加重了社會經(jīng)濟和醫(yī)療的負擔。因此，當前亟待建立基于分子水平的FBD 精準化的診斷和治療體系。

4.1 miRNA與FBD 診斷FBD 的診斷和鑒別診斷目前仍依賴于臨床癥狀，羅馬IV 認為FBD 以病理生理特征的聯(lián)系存在于一個癥狀譜中，其中FC患者也可能伴隨腹痛或腹脹［42］，這極大增加了IBS和FC 鑒別診斷的難度。miRNA 在FBD 患者不同組織和疾病分型的表達中存在差異，而血液和體液中的miRNA 穩(wěn)定性較高，有望成為疾病診斷、鑒別診斷和精準分型的非侵入性標志物。同時，對FBD 病情的評估也需要有效的生物標志物。FBD患者的癥狀往往不能代表腸道功能障礙的嚴重程度，若以患者的癥狀指導(dǎo)臨床用藥往往會導(dǎo)致對FBD 患者的不當治療。研究顯示約有25%的FBD 患者沒有明顯的腸道癥狀卻接受了過度的臨床治療［43］。GUO 等［8］研究發(fā)現(xiàn)miRNA 的表達可能與病情嚴重程度相關(guān)，IBS 患者外周血miR?148a?3p 的水平隨腹痛程度的減輕而顯著下降，這為臨床上把控FBD 的病情進展和預(yù)后指明了方向。

4.2 miRNA與FBD 治療調(diào)控miRNAs 的水平可一定程度上緩解腸功能紊亂，因此miRNAs 可作為FBD 的潛在治療靶標。根據(jù)其在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用不同（表2），主要采取抑制致病性miRNA 或模擬關(guān)鍵miRNA 等治療策略。許多miRNA 的潛在治療作用已通過反義寡核苷酸［9］、過表達［22］、siRNA［35］、CRISPR/cas9［34］、shRNA［44］等多種技術(shù)手段在FBD 動物模型上得到驗證。在IBS 小鼠模型中，利用反義寡核苷酸技術(shù)抑制miR?24 的表達能增加近端結(jié)腸的疼痛閾值，有效減輕胃腸道癥狀和腹痛嚴重程度［45］。研究發(fā)現(xiàn)［17，34］，miR?29a 抑制劑能精準調(diào)控ZO1、CLDN1 和HTR7等靶基因的表達，同時逆轉(zhuǎn)內(nèi)臟高敏，腸屏障損傷等多個病理過程，為FBD 的靶向治療提供參考。此外，F(xiàn)BD 患者個體差異明顯，深入挖掘不同患者的核心miRNA 有助于實現(xiàn)FBD 的個體化治療。

表2 不同miRNA 在功能性腸病中的作用機制Tab.2 The mechanism of miRNAs in functional bowel diseases

但是近年來以RNA 為基礎(chǔ)的治療方法在FBD中發(fā)展較緩慢，功能性腹瀉、餐后不適綜合征等疾病的相關(guān)研究尚待開展。篩選每種疾病類型或不同人群的核心miRNA 仍是極大的挑戰(zhàn)。在臨床應(yīng)用中，也可能面臨潛在毒性和脫靶等問題。因此今后應(yīng)繼續(xù)開展大量研究，深入探討miRNA 在FBD 中的調(diào)控機制，實現(xiàn)精準化診療理念向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。