文/王靜波 王小亮 曹歡 戴旭平.2 王澎 徐立蒲.2*

海豚鏈球菌是魚(yú)類(lèi)主要病原菌之一，給魚(yú)類(lèi)健康養(yǎng)殖帶來(lái)極大風(fēng)險(xiǎn)。為探索海豚鏈球菌滅活疫苗對(duì)鱘魚(yú)免疫效果，本文利用前期從雜交鱘魚(yú)分離得到海豚鏈球菌菌株LY160816K制備了滅活疫苗，并通過(guò)腹腔注射和浸泡兩種方式免疫雜交鱘，免疫第28d后用半數(shù)致死量濃度（LD）攻毒以評(píng)價(jià)海豚鏈球菌滅活疫苗對(duì)雜交鱘的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，本研究所制備的海豚鏈球菌滅活疫苗對(duì)雜交鱘具有較好的免疫效果，有較好的推廣應(yīng)用潛力。

鱘魚(yú)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的大型魚(yú)類(lèi)，目前我國(guó)大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖，年產(chǎn)量高達(dá)8萬(wàn)余t，占世界鱘魚(yú)養(yǎng)殖總量的80%以上。由于高密度養(yǎng)殖等諸多因素，導(dǎo)致鱘魚(yú)病害頻發(fā)，患病后死亡率不斷升高，影響了鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。近年來(lái)，有關(guān)鱘魚(yú)感染海豚鏈球菌（）的報(bào)道較多，由此病原菌引發(fā)的鱘魚(yú)疾病發(fā)病率可達(dá)20%～30%，死亡率高達(dá)70%以上。然而，我國(guó)目前尚無(wú)有效防治魚(yú)類(lèi)海豚鏈球菌病的藥物，海豚鏈球菌對(duì)鱘魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的影響愈加明顯，打擊了養(yǎng)殖戶的積極性。20世紀(jì)90年代，國(guó)外就已開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)海豚鏈球菌疫苗的研制工作，并在實(shí)際生產(chǎn)中取得了較好的效果。近年我國(guó)也陸續(xù)開(kāi)展了羅非魚(yú)和牙鲆海豚鏈球菌疫苗研究，但尚未有針對(duì)鱘魚(yú)海豚鏈球菌疫苗研究的報(bào)道。為探索通過(guò)疫苗免疫提高鱘魚(yú)抗病力的方法，本文將從雜交鱘分離純化得到的海豚鏈球菌制備為滅活疫苗，采用注射和浸泡兩種方式免疫健康雜交鱘，探索免疫應(yīng)答反應(yīng)和保護(hù)效果，以期為鱘魚(yú)海豚鏈球菌病的防控技術(shù)研究提供支撐。

一、材料與方法

（一）試劑

主要有腦心浸液培養(yǎng)基（BHIB）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHIA）、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（BA）、API 20S TREP鑒定試劑條、UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒和37%～40%甲醛溶液等。

（二）菌株復(fù)壯致病

將凍存的海豚鏈球菌菌株LY160816K（分離于河北保定某鱘魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的患病雜交鱘）復(fù)蘇、純化，然后通過(guò)腹腔注射于健康雜交鱘復(fù)壯后再次分離、純化、PCR分析后備用。

（三）LD50測(cè)定

將復(fù)壯后的菌株經(jīng)肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體制備含菌量3.5×10cfu/mL、3.5×10cfu/mL、3.5×10cfu/mL和3.5×10cfu/mL的菌懸液，分別腹腔注射雜交鱘（0.2mL/尾），每組設(shè)置2個(gè)平行（10尾/組）。注射后觀察試驗(yàn)魚(yú)的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)死亡率，采用改良寇氏法計(jì)算菌株的LD：

LD=lg-1[X-i（∑p-0.5）]

其中，X為最高濃度組劑量對(duì)數(shù)，i為相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)差，∑P為各試驗(yàn)組死亡率之和。

（四）疫苗制備

將復(fù)壯后菌株接種于BHIB 220rpm，28℃培養(yǎng)18h～24h，加入甲醛溶液并置于28℃條件下滅活48h，然后10℃條件下離心20min（6000rpm），用滅菌1×PBS洗滌3次，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取制備好的疫苗100μL分別涂布于BHIA、BA以及BHIB，28℃培養(yǎng)72h，進(jìn)行滅活疫苗安全性檢測(cè)。

（五）免疫接種

幼齡雜交鱘（♂×♀）（體重：（295±25）g；體長(zhǎng)：（28±2）cm）購(gòu)自河北保定某鱘魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)。暫養(yǎng)和試驗(yàn)用水為充分曝氣的地下水，養(yǎng)殖條件為水溫（20±2）℃，溶解氧6mg/L～8mg/L，每天投餌1次。

所有實(shí)驗(yàn)用魚(yú)隨機(jī)分成對(duì)照組、注射組和浸泡組，每組4個(gè)平行（10尾/組）。其中，注射免疫使用滅活菌的濃度分別為3.5×10cfu/mL、3.5×10cfu/mL和3.5×10cfu/mL（0.2mL/尾），對(duì)照組注射同體積生理鹽水。浸泡免疫組使用滅活菌終濃度為3.5×10cfu/mL的疫苗浸泡20min，浸泡結(jié)束后轉(zhuǎn)入無(wú)海豚鏈球菌水槽中飼養(yǎng)觀察。

（六）血清抗體凝集效價(jià)

在免疫開(kāi)始前和免疫后第7d、14d、21d和28d分別采集尾靜脈血，血樣室溫下靜置2h～3h后離心5min（5000r/min），取上層血清經(jīng)56℃水浴滅活30min，后置于-80℃?zhèn)溆谩Ｓ糜跍y(cè)定抗體凝集效價(jià)。

（七）攻毒

在免疫第28d后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，即將實(shí)驗(yàn)魚(yú)置于海豚鏈球菌環(huán)境下（3.5×10cfu/mL）持續(xù)浸泡20min，連續(xù)觀察14d，同時(shí)記錄各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)存活率，計(jì)算疫苗免疫的相對(duì)保護(hù)率（RPS，%）。

RPS（%）=（1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）×100

二、結(jié)果

（一）海豚鏈球菌致病特征及鑒定

經(jīng)人工感染2d后，部分實(shí)驗(yàn)魚(yú)體色發(fā)黑，游泳活力明顯減弱，3d后實(shí)驗(yàn)魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)死亡，7d后平均累計(jì)死亡率達(dá)70%?；疾◆~(yú)游動(dòng)緩慢，口圍和頰部出現(xiàn)血斑，肛門(mén)紅腫，腹部膨大或體表出現(xiàn)點(diǎn)狀出血或潰瘍。解剖后發(fā)現(xiàn)其肝臟充血并有出血點(diǎn)，脾臟和腎臟明顯腫大，腎呈紫黑色或嚴(yán)重糜爛不易剝離；腸道充血嚴(yán)重，腸壁變薄，腸道和腹腔中有積液，這些均為海豚鏈球菌致病典型特征（見(jiàn)圖1）。與之相比，實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚(yú)未出現(xiàn)死亡和病理癥狀。

圖1 海豚鏈球菌感染雜交鱘致病癥狀

感染后從魚(yú)體分離病原菌在血瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24h，菌落為圓形，中心白色，周邊半透明，形成β溶血環(huán)。氧化酶陰性，觸酶反應(yīng)陰性，革蘭氏染色陽(yáng)性，卵圓形，呈鏈狀或雙排鏈狀。經(jīng)PCR擴(kuò)增的16S rDNA基因片段約1500bp，測(cè)序后經(jīng)Blast同源性檢索，與海豚鏈球菌的同源性99.2%以上，確定即為海豚鏈球菌。

（二）LD50測(cè)定結(jié)果

接種海豚鏈球菌3d后實(shí)驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)死亡，且隨接種菌量增大死亡呈上升趨勢(shì)，其中最高劑量組死亡率達(dá)90%，而最低劑量組死亡率僅為20%，對(duì)照組無(wú)死亡。據(jù)此計(jì)算菌株對(duì)雜交鱘半數(shù)致死量（LD）為3.9×10cfu/mL，詳見(jiàn)表1。

表1 菌株對(duì)雜交鱘半數(shù)致死量

（三）免疫保護(hù)

各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在攻毒第2d后均出現(xiàn)感染海豚鏈球菌臨床癥狀，如肛門(mén)紅腫，口腔周?chē)溲?，且解剖后從病魚(yú)的腦、肝、脾、腎等組織中均能分離得到海豚鏈球菌。攻毒第3d后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，第7d后各組存活率分別為30%（對(duì)照組）、80%（3.5×10cfu/mL）、88%（3.5×10cfu/mL）、95%（3.5×10cfu/mL）和77%（浸泡組）（見(jiàn)圖2）。隨著注射疫苗濃度增大，免疫保護(hù)效果呈增加趨勢(shì)，即3.5×10cfu/mL免疫組存活率最高為95%，其相對(duì)保護(hù)率（RPS）達(dá)到了92.8%，但注射免疫各組之間相對(duì)保護(hù)率無(wú)顯著差異（＞0.05）。浸泡免疫組相對(duì)保護(hù)率（RPS）為67.1%，但與注射免疫各組間無(wú)顯著差異（＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后又繼續(xù)觀察7d，各實(shí)驗(yàn)組魚(yú)均未出現(xiàn)死亡。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)存活率（%）

從上述結(jié)果可以看出，盡管注射和浸泡免疫各組的免疫保護(hù)率均顯著高于對(duì)照組（＜0.05），但是注射和浸泡免疫各組間的免疫保護(hù)率無(wú)顯著差異（＞0.05），這說(shuō)明注射和浸泡兩種免疫方式均可對(duì)雜交鱘起到較好的免疫保護(hù)作用。

（四）血清抗體凝集效價(jià)

如表2所示，接種疫苗后第7d，各免疫組鱘魚(yú)血清中的抗體效價(jià)較低，凝集效價(jià)≤1:8，注射免疫組到第14d時(shí)凝集效價(jià)顯著升高，最高可達(dá)1:32。免疫第21d時(shí)，注射低濃度組（3.5×10cfu/mL）與浸泡組血清中凝集效價(jià)一致，均為1:16，注射中濃度組（3.5×10cfu/mL）和注射高濃度（3.5×10cfu/mL）血清中凝集效價(jià)分別為1:32和1:64。免疫第28d時(shí)，各免疫組血清凝集效價(jià)與第21d時(shí)一致。對(duì)照組血清凝集效價(jià)一致為零。結(jié)果表明，隨著注射疫苗濃度的增加和免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫組鱘魚(yú)血清中凝集效價(jià)也隨之升高，且免疫各組血清抗體凝集效價(jià)顯著高于對(duì)照組（＜0.05），但注射組間以及各注射組與浸泡組間無(wú)顯著差異（＞0.05）。

表2 菌株免疫組和對(duì)照組不同時(shí)間血清抗體凝集效價(jià)

三、討論

為確保本研究中所用海豚鏈球菌毒力恢復(fù)以及抗原性完整，本研究首先將保存的海豚鏈球菌在健康雜交鱘中復(fù)壯。感染2d后，雜交鱘出現(xiàn)與自然發(fā)病基本一致的臨床癥狀。然后再次分離到致病菌，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序比對(duì)分析，顯示該菌即為海豚鏈球菌。復(fù)壯后的海豚鏈球菌對(duì)雜交鱘半數(shù)致死量濃度（LD）為3.9×10cfu/mL，與已報(bào)道雜交鱘海豚鏈球菌半數(shù)致死量濃度一致，表明該菌株經(jīng)復(fù)壯后已經(jīng)恢復(fù)致病毒力。

魚(yú)類(lèi)疫苗免疫方式有噴霧、口服、注射和浸泡，免疫次數(shù)可分為單次和多次連續(xù)免疫。針對(duì)海豚鏈球菌，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者開(kāi)展了滅活疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗對(duì)羅非魚(yú)和牙鲆的研究。如美國(guó)研制的一種海豚鏈球菌滅活疫苗，以腹腔接種的方式免疫羅非魚(yú)后，相對(duì)保護(hù)率可達(dá)90%以上；國(guó)內(nèi)開(kāi)展的羅非魚(yú)腹腔注射免疫海豚鏈球菌滅活疫苗的免疫相對(duì)保護(hù)率為93.8%，而牙鲆源海豚鏈球菌Sip11重組亞單位疫苗注射免疫保護(hù)率可高達(dá)100%。本研究結(jié)果表明，海豚鏈球菌滅活疫苗腹腔注射和浸泡免疫保護(hù)效果顯著高于對(duì)照組，最高濃度的注射免疫組和浸泡免疫組相對(duì)保護(hù)率分別達(dá)92.8%和67.1%，且隨著注射滅活疫苗濃度的增加，其免疫保護(hù)效果也不斷升高。

三個(gè)不同濃度的注射疫苗組之間的免疫保護(hù)效果并沒(méi)有顯著差異（＞0.05），并且注射免疫各組與浸泡免疫組間免疫保護(hù)效果也沒(méi)有顯著差異（＞0.05）。這表明本研究所制備的海豚鏈球菌滅活疫苗可以通過(guò)注射和浸泡兩種方式提高對(duì)鱘魚(yú)的保護(hù)效果，這些與已報(bào)道的其它魚(yú)類(lèi)海豚鏈球菌注射滅活疫苗相對(duì)保護(hù)率相近。

滅活疫苗免疫的魚(yú)一般是基于體液免疫的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體來(lái)中和、清除病原微生物和毒素，對(duì)細(xì)胞外感染病原微生物具有較好的免疫保護(hù)作用。另外，魚(yú)類(lèi)抗體形成比哺乳動(dòng)物耗時(shí)長(zhǎng)，在最佳溫度下，接種后7d其血清中才逐漸出現(xiàn)免疫球蛋白。本研究中，隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，血清中凝集效價(jià)也隨之升高，這與張生等已報(bào)道的海豚鏈球菌滅活疫苗免疫羅非魚(yú)血清中產(chǎn)生抗體的凝集效價(jià)變化規(guī)律一致，且其免疫后最高凝集效價(jià)為1:64。

有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)兩次注射免疫或者首次浸泡、二次注射免疫，可以顯著提高免疫魚(yú)血清中抗體的效價(jià)。關(guān)于浸泡免疫魚(yú)血清中抗體凝集效價(jià)低于注射免疫魚(yú)的原因，Nakanishi等認(rèn)為浸泡免疫引起的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在鰓局部的黏膜組織中，而魚(yú)類(lèi)黏膜免疫系統(tǒng)可以不依賴(lài)免疫系統(tǒng)而獨(dú)立完成特異性免疫應(yīng)答，因此檢測(cè)到血清抗體低并不意味著沒(méi)有產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本研究中發(fā)現(xiàn)，浸泡組血清抗體效價(jià)低于中高濃注射度組，與低濃度注射組一致，但保護(hù)率與注射免疫各組無(wú)顯著差異，也許正是因?yàn)樯鲜鲈颉?/p>

本文研究結(jié)果表明，海豚鏈球菌滅活疫苗對(duì)雜交鱘具有較好的免疫保護(hù)效果，可為鱘魚(yú)鏈球菌病防控技術(shù)研究提供理論依據(jù)，并為我國(guó)鱘魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供保障。