茶樹單體和聚合態(tài)兒茶素生物合成的研究進(jìn)展

劉亞軍，王培強(qiáng)，蔣曉嵐，莊菊花，高麗萍，夏濤

茶樹單體和聚合態(tài)兒茶素生物合成的研究進(jìn)展

劉亞軍1,2，王培強(qiáng)3，蔣曉嵐1，莊菊花4，高麗萍1,2*，夏濤1*

1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東 青島 266109；4. 貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽 550025

兒茶素類化合物，主要包括單體兒茶素和聚合態(tài)兒茶素，是茶樹（）多酚主要組成部分，是綠茶“茶味”決定性成分。茶樹兒茶素類化合物合成與積累具有顯著的組織器官特異性，鮮葉中主要積累單體兒茶素，根中以積累聚合態(tài)兒茶素為主。類黃酮代謝途徑下游的無色花青素還原酶（LAR）和花青素還原酶（ANR）是決定茶樹兒茶素類化合物類型的關(guān)鍵酶類。本文主要綜述了茶樹兒茶素類化合物合成、積累、轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展，重點(diǎn)關(guān)注LAR、ANR以及無色花青素雙加氧酶（LODX）功能和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的最新研究進(jìn)展，并對兒茶素合成途徑待解決問題提出了自己的觀點(diǎn)。

兒茶素；原花青素；無色花青素還原酶；花青素還原酶；無色花青素雙加氧酶

兒茶素類化合物（Catechins）屬于2-苯基苯并吡喃類化合物，具有典型黃烷-3-醇（Flavan-3-ol）的結(jié)構(gòu)特征（圖1）。不同的黃烷-3-醇類化合物的差異在于B環(huán)羥基化數(shù)目多少、C環(huán)-3-位是否被沒食子基團(tuán)取代、C環(huán)2,3位置的連接基團(tuán)空間結(jié)構(gòu)、是否形成聚合物等。按照C環(huán)2,3位置連接基團(tuán)空間結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行分類，茶樹兒茶素分為順式（-）兒茶素[或稱表型（-）兒茶素]和反式（-）兒茶素（或稱非表型兒茶素）。茶樹中兒茶素單體主要是順式兒茶素，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）和表兒茶素（EC）4種，還有少量反式兒茶素，如兒茶素（C）和沒食子兒茶素（GC）。如果考慮兒茶素旋光構(gòu)型，茶樹中兒茶素單體主要是左旋的順式兒茶素(-)-EGCG、(-)-ECG、(-)-EGC、(-)-EC和右旋的反式兒茶素(+)-C和(+)-GC[1]。

茶樹中也存在聚合態(tài)兒茶素。聚合態(tài)兒茶素通常被稱為縮合單寧（Condensed tannins，CT）或原花青素（Proanthocyanidins，PAs或PCs）[2]。根據(jù)延伸單元之間連接方式的不同，原花青素可分A型（通過C4-C8以及C2-O7連接）和B型（通過C4-C8和/或C4-C6連接）[3]。目前，本課題組利用LC-MS檢測到茶樹中24種原花青素都是B型結(jié)構(gòu)，其中大多數(shù)是以二聚體形式存在[4]。

茶葉界普遍認(rèn)為，單體兒茶素類物質(zhì)與茶飲料的收斂性關(guān)系密切，尤其是鮮葉中含量最高的EGCG。而原花青素由于含量遠(yuǎn)低于單體兒茶素且難以定量檢測，所以其與品質(zhì)的關(guān)系長期被忽略。最近的研究表明，原花青素很可能是夏秋茶苦澀的關(guān)鍵化合物[4]。研究原花青素的合成及其調(diào)控機(jī)理，對于解決茶樹夏秋茶苦澀問題具有指導(dǎo)作用。

近幾年，類黃酮下游代謝途徑中幾個關(guān)鍵酶功能有了新的發(fā)現(xiàn)，本文結(jié)合苜蓿（）、擬南芥（）等植物類黃酮代謝途徑最新研究進(jìn)展，綜述了茶樹單體兒茶素和聚合態(tài)兒茶素的合成及其調(diào)控的研究進(jìn)展。

1 茶樹單體和聚合態(tài)兒茶素積累的組織和種質(zhì)特異性

栽培種茶樹主要分為南方種（var.）和北方種（var.）。茶組植物與其他山茶屬植物中單體兒茶素積累存在顯著差異，特別是酯型兒茶素，在非茶組茶屬植物中幾乎檢測不到[5]。茶組植物中，栽培種茶樹中兒茶素積累區(qū)別于其他茶組植物，如禿房茶（）、四球茶（）、大廠茶（）等四室或五室茶類。四室或五室茶類相比于栽培種，B環(huán)三羥基兒茶素（EGC和EGCG）含量極低，主要和類黃酮-3',5'-羥基化酶基因（）低表達(dá)有關(guān)[6-7]。對比四球茶和舒茶早栽培種鮮葉，舒茶早幼嫩葉中EGCG含量約為90?mg·g-1（干重），而四球茶對應(yīng)發(fā)育時期鮮葉EGCG僅為9?mg·g-1（干重），因?yàn)槿u基兒茶素的缺乏，四球茶鮮葉兒茶素總量只有舒茶早的1/3[7]。茶組植物毛葉茶（）主要積累非表型兒茶素，如GCG、GC、C[8-9]。栽培種鮮葉GCG含量極低，較難被檢測到；相比于北方種茶樹，南方種茶樹鮮葉EC和ECG相對偏高[10]。

茶樹不同發(fā)育時期鮮葉和不同組織器官中兒茶素類型和積累差異明顯（圖2）。鮮葉中，主要積累單體兒茶素，6種單體兒茶素（C，GC，EC，EGC，ECG，EGCG）占鮮葉干重的12%～24%，其中酯型兒茶素約占總兒茶素的80%[10-11]。不同發(fā)育時期的鮮葉中，兒茶素總量在第一葉中最高，尤其是酯型兒茶素積累明顯。隨著鮮葉的發(fā)育，酯型兒茶素ECG和EGCG含量顯著降低，而對應(yīng)非酯型兒茶素EC和EGC顯著上升，一般3～4葉中非酯型兒茶素含量最高，這主要是與酯型兒茶素合成酶ECGT酶活性降低和單寧水解酶CsTA上升有關(guān)[12-13]。在成年茶樹的老葉中，酯型與非酯型兒茶素都顯著下降。鮮葉中也有少量原花青素積累，一般占鮮葉干重的0.3%～2.0%，老葉中積累相對較多[4]。

在茶樹不同組織器官中，單體兒茶素在鮮葉中含量最高，其次是嫩莖，根中最低。而原花青素在根中含量最高，葉中含量低。從單體兒茶素組成種類看，鮮葉中兒茶素種類最多，莖中兒茶素種類與鮮葉中相似，根中只檢測到了EC。鮮葉中積累的主要是低聚的原花青素，如EC-EGC、EC-EGCG，目前LC-MS在鮮葉中檢測到22種原花青素[4]。茶樹鮮葉和莖中，當(dāng)原花青素聚合度較小時，B環(huán)二羥基和三羥基的結(jié)構(gòu)單元同時存在，C2-形式兒茶素是主要的結(jié)構(gòu)單元；當(dāng)原花青素聚合度大于5，主要的聚合延伸單元為B環(huán)二羥基EC[14]。

在莖中，原花青素含量隨著莖的發(fā)育而升高。在木質(zhì)化程度較低的嫩莖中，單體以及原花青素的種類與葉中類似，其中單體兒茶素的含量占干重的3%～10%，原花青素占干重的1%～3%。木質(zhì)化程度較高的莖中積累的主要是EC及EC類型花青素，平均聚合度達(dá)到3[14]。

圖1 茶樹主要黃烷醇類化合物的結(jié)構(gòu)

圖2茶樹黃烷醇類化合物器官積累特異性

相比之下，根中積累的黃烷醇類化合物種類相對單一，主要是EC以及EC類型原花青素。在木質(zhì)化程度較低的根中僅積累少量的EC和C，原花青素占干重的1%～3%。木質(zhì)化成度高的老根中積累的主要是EC及EC類型原花青素，含量能達(dá)到干重的8%左右。老根中原花青素的聚合度達(dá)到12，平均聚合度為5左右，但是結(jié)構(gòu)單元單一，EC是主要的結(jié)構(gòu)單元，且以B型C4-C8連接為主[14]。

2 兒茶素類物質(zhì)組織和亞細(xì)胞定位

關(guān)于兒茶素類物質(zhì)的定位研究相對較少。無損質(zhì)譜成像表明，不同類型兒茶素在葉片組織內(nèi)的分布不同。酯型兒茶素EGCG在全葉片積累，而非酯型兒茶素EC和EGC主要分布于葉片兩邊靠近葉脈的部位[15]。原位雜交實(shí)驗(yàn)表明，兒茶素合成相關(guān)基因、、和在葉原基和幼葉組織中表達(dá)明顯，而在芽頂端分生組織中未檢測到明顯表達(dá)[16]，說明兒茶素在鮮葉中合成，呈現(xiàn)明顯的葉發(fā)育相關(guān)性。香草醛-鹽酸染色鮮葉切片顯示，兒茶素在葉片初展的鮮葉柵欄組織、維管束中均具有較明顯積累[17]。亞細(xì)胞層面，幼嫩葉片葉綠體中有兒茶素類化合物積累，而在較為成熟的葉片葉綠體中積累不明顯，主要積累在液泡中。兒茶素類化合物在幼嫩莖的表皮薄壁細(xì)胞中有少量積累，主要在韌皮部和木質(zhì)部導(dǎo)管壁。在幼嫩的根中，兒茶素類化合物主要積累于中柱鞘部位。在含葉綠體的愈傷組織中，葉綠體和液泡均有兒茶素類化合物積累[17]。

3 茶樹中兒茶素合成關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展

茶樹鮮葉積累的主要是表型兒茶素EC、EGC、ECG、EGCG，而非表型兒茶素C或GC積累量極少，該科學(xué)問題在茶多酚代謝研究領(lǐng)域一直備受關(guān)注。兒茶素合成關(guān)鍵酶位于類黃酮代謝途徑末端，一般認(rèn)為二氫黃酮醇-4-還原酶（Dihydroflavonol-4-reductase，DFR）催化二氫黃酮醇生成無色花青素，無色花青素一方面可以被無色花青素還原酶（Leucoanthocyanidin reductase，LAR）催化形成兒茶素，也可以被花青素合成酶（Anthocyanin synthase，ANS）催化形成花青素，生成的花青素可以經(jīng)花青素還原酶（Anthocyanin reductase，ANR）催化形成表兒茶素。然而，隨著研究的不斷深入，關(guān)于這些酶的功能有了新的發(fā)現(xiàn)，特別是LAR、ANR和ANS的功能。

3.1 LAR的研究進(jìn)展

LAR酶功能研究報道始于二十世紀(jì)八十年代，Stafford等[18]利用花旗松（）粗酶，以NADPH作為供氫體，催化無色花青素生成反式兒茶素（C）。2003年，Tanner等[19]利用原核表達(dá)獲得了重組的豆科植物山螞蝗屬鉤骨（）DuLAR蛋白，并利用體外酶反應(yīng)證明其可以催化無色矢車菊色素（3,4--leucocyanidin）生成對應(yīng)的兒茶素C；2004年，Punyasiri等[20]第一次從茶樹的粗酶中檢測到了DFR和LAR酶的活性，當(dāng)以二氫黃酮醇類（DHK、DHQ、DHM）為底物時，粗酶反應(yīng)又可生成對應(yīng)的產(chǎn)物阿福豆素（Afzelechin）、C和GC，間接證明了茶樹中DFR/LAR雙酶的功能。

2007年，Dixon課題組鑒定了苜蓿中、和等3個類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵基因[21]。在苜蓿和煙草中過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，盡管花青素含量明顯降低，但轉(zhuǎn)基因植物中并沒有檢測到C。2013年該研究團(tuán)隊進(jìn)一步研究了1條茶樹基因功能，原核表達(dá)得到的CsLAR重組酶，在體外可以催化無色花青素生成(+)-C，但是將在煙草中過表達(dá)之后卻生成了大量的EC，只檢測到了少量的C[22]。

2017年，本課題組對茶樹中LARs功能進(jìn)行了研究，通過原核表達(dá)獲得了3條CsLARs重組酶，并通過“DFR+LAR雙酶反應(yīng)”和“飼喂”的方式驗(yàn)證了3條CsLARs在體外的催化功能，均可以催化二氫黃酮醇生成兒茶素C；將3條基因過表達(dá)到煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草花瓣顏色均變淺，同時生成了大量的EC[23]。CsLARs在植物體內(nèi)和體外呈現(xiàn)出不同的催化功能。2016年，Dixon課題組在苜蓿中發(fā)現(xiàn)了1個MtLAR的新底物4-(-cysteinyl)-EC，MtLAR催化4-(-cysteinyl)-EC生成EC[24]，表明植物體內(nèi)可能存在LAR的另外1個底物。之后在葡萄原花青素合成過程的研究中，發(fā)現(xiàn)葡萄也積累了4-(-cysteinyl)-EC和4-(-cysteinyl)-C，VvLAR1和VvLAR2除了可以催化無色花青素以外，也可以催化4-(-cysteinyl)-EC和4-(-cysteinyl)-C生成EC和C[25]。

百脈根（）是一種積累C類型兒茶素的植物，單體兒茶素主要以(+)-C為主。本課題組對百脈根的LAR功能研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草生成了大量的EC，再次說明不同植物L(fēng)AR的酶功能是一定的，其催化產(chǎn)物取決于底物類型[26]。結(jié)合文獻(xiàn)和本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，LAR既可以參與表型兒茶素的合成，也可以參與非表型兒茶素的合成。如果LAR的底物是C類型無色花青素（C-typeleucocyanidin），生成的產(chǎn)物是C類型兒茶素；如果LAR的底物是EC類型無色花青素（EC-typeleucocyanidin），則生成的產(chǎn)物就是EC類型兒茶素（圖3）。

3.2 ANR的研究進(jìn)展

植物原花青素在植物物種中普遍存在，其在植物中合成機(jī)制一直是植物類黃酮代謝途徑待解決的難題。尋找原花青素合成末端合成酶，一直未停止。通過關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，多個植物中ANR基因表達(dá)與原花青素的積累高度正相關(guān)[27-29]。

ANR的研究報道最早追溯到1997年，Albert等[30]在擬南芥中篩到了1個突變體，發(fā)現(xiàn)突變體擬南芥的種子在成熟前期，種皮表面積累了大量的紅色物質(zhì)，由于這個顏色與Banyuls葡萄酒的顏色類似，因此將這個突變體命名為Banyuls，簡稱為BAN。

2003年，Dixon課題組的Xie等[31]在苜蓿中找到了基因的同源序列，將苜蓿和擬南芥中的過表達(dá)到煙草中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后的煙草花色變淺，甚至變?yōu)榘咨?，同時利用對二甲氨基肉桂醛（Dimethylaminocinnamaldehyde， DMACA）的化學(xué)顯色方法檢測到轉(zhuǎn)基因煙草花中積累了可以使DMACA變藍(lán)色的物質(zhì)；利用原核表達(dá)獲得的MtBAN重組蛋白，可以催化花青素生成表兒茶素。根據(jù)以上催化功能，Xie等[31]將基因編碼蛋白命名為花青素還原酶（ANR），這是花青素還原酶被首次提出，也澄清了BAN基因被認(rèn)為是同源基因的誤解，他提出ANR酶功能是催化花青素形成表型兒茶素。

在ANR基因從擬南芥中被分離鑒定后，葡萄、柿子、草莓等植物中的基因功能相繼被鑒定[27-28,32]。在體外ANR都可以催化花青素單體生成表兒茶素，而在ANR轉(zhuǎn)基因后的植物體內(nèi)都會積累可使DMACA變藍(lán)色的原花青素類似物，但是均未檢測到真正的原花青素物質(zhì)含量上升，因此推測ANR在植物體內(nèi)和體外的功能不同。是否ANR酶和LAR酶類似，存在多底物？產(chǎn)物的形成取決于底物類型？2016年，Dixon課題組研究了苜蓿的、以及雙突變體，發(fā)現(xiàn)突變體種子的種皮與野生型種子的種皮顏色一樣，而和/突變體的種子為紅褐色；檢測突變體的代謝物，發(fā)現(xiàn)中可溶性原花青素含量下降，而不可溶性原花青素含量升高，突變體中可溶性原花青素含量與不可溶性原花青素均降低[24]，這暗示ANR可能在原花青素的合成過程中扮演著重要的角色。

針對這個問題，本課題組進(jìn)一步研究了茶樹CsANR功能。茶樹CsANR原核重組酶在體外添加底物花青素Cyanidin和NAPDH，生成了(-)-C和兩種對應(yīng)旋光異構(gòu)體兒茶素(+)-EC、(-)-EC[33]。將茶樹在煙草中過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)煙草中積累了大量的原花青素類似物。利用LC-MS分析轉(zhuǎn)基因煙草酚類化合物，意外發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中一類兒茶素的中間體（中間態(tài)）含量顯著上升[34]。我們根據(jù)該化合物的特性，稱其為兒茶素碳正離子。兒茶素碳正離子在植物體內(nèi)極不穩(wěn)定，可以與EC類型無色花青素（EC-typeleucocyanidin）動態(tài)相互轉(zhuǎn)變[35]。這類碳正離子具有親電特性，可以被甲醇、乙醇、半胱氨酸（含有巰基）、兒茶素單體等親核試劑捕捉形成結(jié)合物[34]。有研究表明，在苜蓿中分離鑒定的4-(-cysteinyl)-EC可能來源于半胱氨酸與EC的結(jié)合反應(yīng)[24-25]。在本課題組研究中，以半胱氨酸為親核試劑去捕捉這類中間體，可以形成4-(-cysteinyl)-EC[34]。另外，當(dāng)以兒茶素單體作為親核試劑去捕捉這類中間體時，形成了原花青素二聚體和三聚體。據(jù)此，我們推測這類兒茶素中間體是原花青素聚合延伸單元，也初步確定原花青素的合成關(guān)鍵步驟是以兒茶素單體為起始單元，以親核試劑兒茶素中間體為延伸單位的非酶促反應(yīng)。

至此，基本明確茶樹CsANR功能，其催化花青素生成EC類型無色花青素（或EC類型兒茶素中間體），LAR催化該類型的中間體生成EC（圖3）。

3.3 ANS的研究進(jìn)展

從茶樹CsLAR功能研究可以得出，CsLAR可以催化花青素生成EC類型無色花青素和C類型無色花青素，合成EC和C。從合成途徑上看，EC類型無色花青素合成源頭也來自于C類型無色花青素。EC和C合成途徑共享底物，但茶樹鮮葉積累了大量表型兒茶素EC、EGC、ECG、EGCG，非表型兒茶素C或GC積累極少。推測是茶樹體內(nèi)存在非表型兒茶素向表型兒茶素轉(zhuǎn)變的途徑，非表型兒茶素只是茶樹兒茶素代謝途徑中的中間產(chǎn)物。

花青素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）是類黃酮代謝途徑中負(fù)責(zé)花青素合成的重要酶，能夠催化無色花青素生成花青素。在催化機(jī)理上，花青素合成酶屬于雙加氧酶類，其蛋白具有依賴Fe2+的2-酮戊二酸雙加氧酶家族基因的結(jié)構(gòu)域，因此也被稱為無色花青素雙加氧酶（Leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）[36]。很長時間的認(rèn)知誤區(qū)都認(rèn)為ANS和LDOX是同一個酶。在擬南芥中，可以互補(bǔ)（Tannin deficient seed 4）突變體缺失花青素和原花青素的性狀，證明既可以參與花青素的合成，也可以參與原花青素的合成[37]。有研究表明，ANS的功能并不只局限于催化無色花青素合成花青素，也可以執(zhí)行黃酮醇合成酶（Flavonol synthase，F(xiàn)LS）的活性，催化二氫黃酮醇生成黃酮醇，也可以催化(+)-C生成矢車菊色素（Cyanidin）和一種氧化型的二聚體原花青素[38-39]。這暗示了ANS和LDOX功能可能有所不同。

2018年，Dixon課題組對苜蓿中MtANS和MtLDOX的功能進(jìn)行了區(qū)分[40]。氨基酸比對分析表明，苜蓿中報道的MtLDOX與MtANS一致性較低，只有40%。通過原核表達(dá)獲得MtLDOX與MtANS重組酶，體外酶反應(yīng)表明，兩者都可以催化無色花青素生成花青素，同時也能夠以(+)-C為底物，生成矢車菊色素。酶動力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，MtLDOX比MtANS對底物(+)-C更具有親和力。在苜蓿體內(nèi)，兩者的功能差異表現(xiàn)明顯。突變基因以后，苜蓿小苗失去了合成花青素的功能；而突變后，對苜蓿苗中花青素的合成幾乎沒有影響，這說明植物體內(nèi)ANS的功能主要是合成花青素。

此外，通過檢測苜蓿與突變體中原花青素的種類，研究人員發(fā)現(xiàn)突變體中的原花青素大都是以C為起始單元（Starter unit），說明突變，植物體內(nèi)積累了較多的C。而在的突變體中，原花青素大都是以EC為延伸單元（Extension unit）進(jìn)行聚合；雙突變體中的原花青素，延伸單元和起始單元都是C類型[40]。通過以上試驗(yàn)結(jié)果可以推測，在苜蓿體內(nèi)，ANS主要控制花青素的合成；LDOX可以催化(+)-C形成原花青素類似物，因此是否突變并不影響花青素的合成。此外，在百脈根、棉花（）和銀葉山螞蝗（）等植物中兒茶素單體都是以(+)-C為主，原花青素也都以(+)-C為起始單位，推測可能是這些植物體中缺少基因。栽培種茶樹鮮葉中積累大量的順式兒茶素，而非反式兒茶素，因此我們推測茶葉中可能也存在類似功能的LDOX，但是目前尚未見相關(guān)報道。

注：CHS：查耳酮合成酶；CHI：查耳酮異構(gòu)酶；F3H：二氫黃酮3-羥化酶；DFR：二氫黃烷醇4-還原酶；LAR：無色花色素還原酶；ANS：花青素合成酶；LDOX：無色花青素雙加氧酶；ANR：花青素還原酶；GT：糖基轉(zhuǎn)移酶

結(jié)合目前其他植物中黃烷-3-醇合成途徑的最新研究進(jìn)展[35]，我們提出了新的茶樹兒茶素生物合成途徑（圖3）。

4 茶樹兒茶素及原花青素合成調(diào)控

植物類黃酮結(jié)構(gòu)基因表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如NAC、ZIP、MYB、bHLH等[41]，目前研究主要集中在R2R3-MYB、bHLH、WD40構(gòu)成的三聯(lián)復(fù)合體對類黃酮代謝的調(diào)控方面[42]。茶樹酚類物質(zhì)生物合成的代謝調(diào)控研究，特別是轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB的功能鑒定，已取得了一定的進(jìn)展[43-47]。

根據(jù)R2R3-MYB的C端保守基序不同，126條擬南芥R2R3-MYB可分為25個亞組[48]，位于進(jìn)化樹中同一亞組的MYB往往具有相似的功能。為了預(yù)測茶樹R2R3-MYB潛在的調(diào)控功能，將茶樹和擬南芥R2R3-MYB共同構(gòu)建進(jìn)化樹。通過進(jìn)化樹和MYB基序特點(diǎn)，對茶樹R2R3-MYB進(jìn)行分組歸類（圖4和表1）。根據(jù)預(yù)測，參與茶樹酚類物質(zhì)生物合成調(diào)控的R2R3-MYB可能位于進(jìn)化樹的第4、5、6、7、15等亞組[43,46]。

第4亞組的R2R3-MYB預(yù)測為負(fù)調(diào)控植物酚酸代謝和單寧的生物合成。例如擬南芥AtMYB4抑制基因的表達(dá)[53]；金魚草基因轉(zhuǎn)煙草植株，苯丙烷代謝途徑中的、和基因表達(dá)顯著下調(diào)[54]。茶樹的第4亞組MYB同樣被證明是負(fù)調(diào)控因子，雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果表明，CsMYB4a顯著抑制、、和等基因啟動子的活性[55]。轉(zhuǎn)煙草轉(zhuǎn)錄組以及代謝組分析表明，茶樹CsMYB4a同時抑制轉(zhuǎn)基因煙草莽草酸途徑、苯丙烷合成途徑、類黃酮合成途徑以及木質(zhì)素途徑[55]。

有關(guān)促進(jìn)兒茶素以及原花青素合成的MYB多位于第5亞組。研究最為深入的是擬南芥TT2，其可與bHLH轉(zhuǎn)錄因子（TT8、GL3、EGL3）以及WD40蛋白TTG1一起形成三聯(lián)復(fù)合體MBW，激活類黃酮合成下游靶基因（如、、、、、和等）表達(dá)，調(diào)控單體及原花青素的生物合成[56]。第5亞組不同MYB對原花青素合成調(diào)控也有所不同，如MtMYB5和MtMYB14均調(diào)控原花青素的合成，但作用靶基因有明顯的差異[57]。

茶樹第5亞組MYB至少有5個，包括TT2分支的CsMYB5a、CsMYB5b和CsMYB5c，以及AtMYB5分支的CsMYB5d和CsMYB5e。主要在嫩梢中高表達(dá)，且隨著發(fā)育程度增加而降低，與茶樹嫩梢中兒茶素類物質(zhì)的積累規(guī)律一致。而主要在根中高表達(dá)，可能與根中原花青素高積累相關(guān)[46]。在和過表達(dá)煙草中，這兩個轉(zhuǎn)錄因子都調(diào)控原花青素的合成，不同的是CsMYB5a促進(jìn)原花青素積累的同時降低花青素的含量；而CsMYB5e促進(jìn)EC類型兒茶素中間體的合成，但不影響花青素的積累[46]。全基因組關(guān)聯(lián)分析也表明（基因編號W12g025045）與茶樹第三葉片的兒茶素EC積累相關(guān)性較高[58]?；虮磉_(dá)分析表明，CsMYB5a主要促進(jìn)、和的表達(dá)，而CsMYB5e主要促進(jìn)的表達(dá)，其次是[46]。與CsMYB5a類似，CsMYB5b同樣通過調(diào)控和的共表達(dá)調(diào)控原花青素的積累。不同的是，CsMYB5b受糖誘導(dǎo)顯著表達(dá)[45]。

第6亞組的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測為調(diào)控花青素的合成。在模式植物擬南芥中，R2R3-MYB家族的AtPAP1、AtPAP2、AtMYB113、AtMYB114與bHLH家族的TT8、GL3、EGL3，以及WD40蛋白（TTG1）形成三聯(lián)復(fù)合體MBW，調(diào)控花青素合成關(guān)鍵基因和的表達(dá)[59]，其中擬南芥以及其他植物直系同源基因調(diào)控植物花青素合成最為明顯。茶樹同源基因（）與紫色芽葉品種如紫娟中花青素高積累高度相關(guān)，正調(diào)控茶鮮葉中花青素的合成[60-61]。茶樹和擬南芥轉(zhuǎn)基因煙草后發(fā)現(xiàn)，和均可以顯著上調(diào)煙草中和的表達(dá)，從而促進(jìn)代謝流流向類黃酮途徑，特別是花青素糖苷的合成[61]。也就是說茶樹第6亞組的（）與功能相似，促進(jìn)花青素的合成。

茶樹黃烷醇類化合物合成呈現(xiàn)明顯的組織表達(dá)特異性。葉中積累單體兒茶素，根中積累原花青素，這是茶樹酚類積累最大的特點(diǎn)。控制組織表達(dá)特異性的轉(zhuǎn)錄因子除了CsMYB5家族轉(zhuǎn)錄因子外，有研究表明TCP轉(zhuǎn)錄因子控制葉發(fā)育的同時也調(diào)控兒茶素的合成[62]。TCP轉(zhuǎn)錄因子是植物中調(diào)控多個組織細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化的一類轉(zhuǎn)錄因子[62]。茶樹2條CIN-type轉(zhuǎn)錄因子CsTCP3和CsTCP4，1條PCF-type轉(zhuǎn)錄因子可以與CsTT8結(jié)合，調(diào)節(jié)三聯(lián)復(fù)合體MBW，激活靶基因和的表達(dá)，從而調(diào)控茶鮮葉兒茶素合成[63]。LBD（Lateral organ boundaries domain）轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多個植物組織生長和發(fā)育[64]。茶樹LBD家族CsLOB_3和CsLBD36_2可以與兒茶素合成有關(guān)類黃酮途徑基因、和啟動子結(jié)合，暗示有些LBD家族轉(zhuǎn)錄因子同時調(diào)控葉片發(fā)育和葉片中兒茶素的合成[65]。

除了上述轉(zhuǎn)錄因子，通過基因表達(dá)和化合物關(guān)聯(lián)分析，MADS、C2H2-Zinc finger、WRKY、C2H2、C3H、NAC和ERF家族成員基因表達(dá)與茶樹兒茶素類化合物的積累高度關(guān)聯(lián)[66-68]。此外，有文獻(xiàn)表明茶樹兒茶素代謝途徑還受到MicroRNA的調(diào)控[69]，如介導(dǎo)了氮素營養(yǎng)對兒茶素代謝的調(diào)控[70]。

注：圖中涉及擬南芥和茶樹基因編號見表1

表1 基于擬南芥的同源蛋白分析茶樹R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子分組和基序

續(xù)表1

續(xù)表1

注：R2R3-MYB分組1—31根據(jù)參考文獻(xiàn)信息命名[49-50]；基序類型通過MEME工具確認(rèn)[51]；茶樹MYB基因編碼來自NCBI，其余來自茶樹TPIA茶樹基因組數(shù)據(jù)庫平臺[52]

Note: R2R3-MYB subgroup numbers from 1 to 31were named according to the references[49-50]. Motifs were confirmed using MEME tools[51]. The CsMYB accession number were provided from NCBI, the others from TPIA tea plant genome platform (http://tpdb.shengxin.ren)[52]

茶樹兒茶素合成表現(xiàn)出顯著的組織表達(dá)特異性。此外，茶鮮葉中兒茶素的合成還受到蔗糖[45]、紅藍(lán)光[71]、溫度[72]等因子影響，但上述因子調(diào)控兒茶素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與展望

茶樹非酯型兒茶素和原花青素的合成途徑基本清晰。茶樹LAR控制茶樹單體兒茶素的EC和EGC形成，進(jìn)一步在酯型兒茶素合成酶的作用下合成大量的ECG和EGCG。ANR酶催化EC類型兒茶素中間體的形成，促進(jìn)原花青素合成或后續(xù)通過LAR酶合成單體兒茶素。

在茶樹兒茶素類化合物合成、調(diào)控、轉(zhuǎn)運(yùn)方面，仍然有多個科學(xué)問題待解決：（1）鮮葉兒茶素積累模式。茶鮮葉為何主要積累的是兒茶素單體而不是高聚合態(tài)原花青素？雖然鮮葉中也有少量低聚原花青素積累。（2）黃烷醇類化合物的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸。茶樹根中積累了大量的高聚合態(tài)原花青素，是根中合成還是轉(zhuǎn)運(yùn)而來？雖然幼嫩的根中原花青素合成關(guān)鍵基因都有表達(dá)，但他們的表達(dá)量與高積累原花青素的量不相匹配[73]。例如，目前茶樹中檢出兩條原花青素合成延伸單位合成關(guān)鍵酶ANR的基因和，其根中表達(dá)量分別約是鮮葉中的1/15和1/10[73]?；衔锖亢徒M織化學(xué)定位表明，幼根中維管束鞘部位積累了大量黃烷醇類化合物，幼嫩莖中維管束木質(zhì)部和韌皮部都積累了大量黃烷醇類化合物[17]。這就暗示茶樹體內(nèi)可能存在葉莖根的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸。（3）茶樹細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。研究表明CsGSTF1參與了茶樹黃酮醇和花青素的胞內(nèi)運(yùn)輸積累[56,74]。體外親和力試驗(yàn)表明，3條CsGSTs重組酶對黃酮醇糖苷和花青素糖苷有較高的親和力，但是對兒茶素類化合物EC親和力極低；3條CsGSTs轉(zhuǎn)基因煙草葉片黃酮醇含量也較對照有顯著升高，但是花瓣中EC含量卻沒有上升，暗示茶樹中可能存在其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與單體兒茶素的胞內(nèi)運(yùn)輸或其他轉(zhuǎn)運(yùn)方式[74]。組織化學(xué)定位觀察到茶樹鮮葉細(xì)胞中存在多個小液泡積累兒茶素類化合物[17,75]，暗示茶樹兒茶素亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)可能通過小液泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。Dixon等[76]提出苜蓿中原花青素可能是在Pre-vacuolar vesicle中合成，再由Pre-vacuolar vesicle轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中心大液泡。（4）兒茶素合成的調(diào)控。雖然調(diào)控茶樹黃烷醇類化合物的MYB轉(zhuǎn)錄因子通過模式植物異源表達(dá)基本得以確定，但是茶樹缺乏有效轉(zhuǎn)基因體系和突變體庫。因此，調(diào)控這些MYB的上游轉(zhuǎn)錄因子和其他轉(zhuǎn)錄因子，特別是控制兒茶素組織表達(dá)特異性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在茶樹體內(nèi)功能驗(yàn)證也無法深入。所以茶樹兒茶素合成調(diào)控研究，雖然早已在路上，但仍任重道遠(yuǎn)。

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Research Progress on the Biosynthesis of Monomeric and Polymeric Catechins in

LIU Yajun1,2, WANG Peiqiang3, JIANG Xiaolan1, ZHUANG Juhua4, GAO Liping1,2*, XIA Tao1*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 3. College of Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 4. College of Tea Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China

Catechin compounds, mainly including monomeric catechins and polymericcatechins, are the main components of tea polyphenols inand the decisive components of the "taste" of green tea. The synthesis and accumulation of tea catechin compounds have remarkable tissue- and organ- specificity. The leaves mainly biosynthesize monomeric catechins, and roots mainly accumulate polymeric catechins. The downstream enzymes of flavonoid metabolism pathway, leucoanthocyanidin reductase (LAR) and anthocyanin reductase (ANR) are the key enzymes determining the types of catechins. This paper mainly reviewed the research progress on the biosynthesis, accumulation, and transcriptional regulation of catechins in, with emphasis on the latest research progress in the function and transcriptional regulation of LAR, ANR and leucoanthocyanidin dioxygenase (LODX). Our views on the unsolved problems in catechin synthetic pathway were also proposed.

catechins, proanthocyanidinsleucoanthocyanidin reductase, anthocyanin reductase, leucoanthocyanidin dioxygenase

S571.1

A

1000-369X(2022)01-001-17

2021-08-11

2021-09-07

國家自然科學(xué)基金（31870677、32072621、31902070、31902069）

劉亞軍，男，教授，主要從事植物酚類代謝研究，liuyajun1228@163.com。*通信作者：gaolp62@126.com；xiatao62@126.com

（責(zé)任編輯：黃晨）