王夢杰，吳華，劉嘉華，張龍飛

(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810000)

現(xiàn)代快節(jié)奏的生活，使得人們的一些習(xí)慣發(fā)生改變，如晝夜顛倒、飲食不規(guī)律等，這些不規(guī)律和不健康的生活方式成為誘發(fā)各類癌癥的主要因素之一.其中，肝癌的發(fā)病率和死亡率均高居癌癥的前6位，2020年全球死于肝癌的人數(shù)達(dá)80多萬，占全球癌癥總死亡人數(shù)的8.3%[1].近些年，人們在研究和開發(fā)抗腫瘤藥物的過程中逐漸將目光轉(zhuǎn)向了可食用的天然化合物，其中就包括黃酮類化合物[2].茄科黑果枸杞多分布于中國西北地區(qū)，富含多種花青素類天然色素，其含量居漿果類植物之首[3-4].花青素是一種類黃酮物質(zhì)，屬黃酮類化合物的一個亞群，在抗腫瘤方面具有較強(qiáng)的生理活性，具有一定的食品開發(fā)和醫(yī)學(xué)研究意義[2,4].前期研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞提取物(LyciumruthenicumMurray extraction，LRME)可有效抑制HepG2細(xì)胞增殖和遷移，并具有劑量和時間依賴性[4].基于此，本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞和分子層面揭示LRME基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體自噬對HepG2細(xì)胞自噬影響的分子機(jī)理，為開發(fā)黑果枸杞的藥用價值提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

LRME,青海金麥杞生物科技有限公司[4]；HepG2細(xì)胞,中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞周期檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期

分別設(shè)對照組(NC),LRME組.將1×105/mL的HepG2細(xì)胞接種至6孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱穩(wěn)定24 h后，加入LRME進(jìn)行誘導(dǎo)，控制LRME終質(zhì)量濃度分別為0、25 μg/mL.誘導(dǎo)24 h后收集細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇固定過夜，PI染色后上機(jī)檢測.

1.2.2 qRT-PCR檢測關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)

分別設(shè)NC組、LRME組、自噬抑制劑組(3-MA)、LRME+3-MA組.將1×105/mL的HepG2細(xì)胞接種至6孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱穩(wěn)定24 h后進(jìn)行分組處理，控制LRME終質(zhì)量濃度分別為0、25 μg/mL，3-MA的終濃度為5 mmol/L.誘導(dǎo)24 h后通過Triol法提取總RNA，并按TIANGEN試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)，引物由上海生物公司合成(表1).使用 Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System 對各組樣本進(jìn)行擴(kuò)增，記錄各樣品擴(kuò)增Ct值(Ct值指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，采用2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達(dá)量.

1.2.3 Western blot檢測關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)

將1×105/mL的HepG2細(xì)胞接種至6孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱穩(wěn)定24 h后進(jìn)行分組處理，控制LRME終質(zhì)量濃度分別為0、25 μg/mL，3-MA的終濃度為5 mmol/L.細(xì)胞誘導(dǎo)24 h后，由含體積分?jǐn)?shù)1% PMSF的裂解液進(jìn)行裂解，離心后取上清液，BCA 法定量.蛋白于PCR儀上95 ℃加熱5 min，變性后泳道上樣，制備體積分?jǐn)?shù)8%的分離膠和體積分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠.SDS-PAGE 電泳濃縮膠 70 V、30 min；分離膠 120 V、90 min.電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，按體積比1∶1 000配制ATF4、FUNDC1及β-tubulin 一抗，4 ℃封閉過夜后洗膜.加入二抗，室溫1 h后洗膜.向PVDF膜滴加發(fā)光液試劑并反應(yīng)5 min后曝光顯影.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果分析

2.1 LRME調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖

2.1.1 LRME調(diào)控HepG2細(xì)胞周期

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，LRME可有效阻滯HepG2細(xì)胞周期(圖1).

a.NC組；b.LRME組；c.細(xì)胞所處周期百分比.與NC組比較*P<0.05；**P<0.01.圖1 LRME調(diào)控HepG2細(xì)胞周期Fig.1 Regulation of LRME on cell cycle in HepG2 cells

由圖1可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)(P<0.01)，并顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞在S期的細(xì)胞數(shù)(P<0.05).表明LRME可顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，并可有效阻滯HepG2細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化.

2.1.2 LRME調(diào)控HepG2細(xì)胞關(guān)鍵增殖因子mRNA表達(dá)水平

檢測增殖關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，LRME可有效抑制HepG2細(xì)胞增殖，結(jié)果見圖2.

由圖2可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調(diào)增殖關(guān)鍵因子TP53在mRNA水平的表達(dá)(P<0.01)，并顯著下調(diào)CCND1、CDK4和PCNA在mRNA水平的表達(dá)(P<0.05).表明LRME可通過上調(diào)TP53，下調(diào)CCND1、CDK4和PCNA的mRNA表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞增殖.

與NC組比較*P<0.05；**P<0.01.圖2 HepG2細(xì)胞增殖關(guān)鍵因子在mRNA水平的表達(dá)Fig.2 Expression of proliferation factors at mRNA level in HepG2 cells

2.2 LRME調(diào)控HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵因子mRNA和蛋白表達(dá)水平

分別選用LRME(25 μg/mL)和3-MA(5 mmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LRME可有效增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(圖3).

與NC組比較**P<0.01.與3-MA組比較## P<0.01.

由圖3可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調(diào)ATF4的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，3-MA可極顯著下調(diào)ATF4的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，LRME+3-MA可極顯著上調(diào)ATF4的mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平(P<0.01)；阻斷細(xì)胞自噬后，與3-MA組相比，LRME和LRME+3-MA均可極顯著上調(diào)ATF4的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平(P<0.01).說明LRME可通過上調(diào)ATF4在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.

2.3 LRME調(diào)控HepG2細(xì)胞線粒體自噬關(guān)鍵因子mRNA和蛋白表達(dá)水平

分別選用LRME和3-MA誘導(dǎo)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LRME可有效促進(jìn)HepG2細(xì)胞的線粒體自噬(圖4).

由圖4可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調(diào)FUNDC1的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，3-MA可極顯著下調(diào)FUNDC1的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，LRME+3-MA可顯著上調(diào)FUNDC1的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)并極顯著上調(diào)FUNDC1的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)；阻斷細(xì)胞自噬后，與3-MA組相比，LRME和LRME+3-MA均可極顯著上調(diào)FUNDC1的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平(P<0.01).說明LRME可通過上調(diào)FUNDC1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞線粒體自噬.

與NC組比較**P<0.01；與3-MA組比較## P<0.01.

2.4 LRME對HepG2細(xì)胞自噬關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，LRME可顯著促進(jìn)AMPK和LC3在mRNA水平的表達(dá)[4].本實(shí)驗(yàn)檢測自噬關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，LRME可顯著抑制mTOR的mRNA表達(dá)水平(P<0.05).阻斷細(xì)胞自噬后，與3-MA組相比，LRME+3-MA可極顯著上調(diào)AMPK和LC3在mRNA水平的表達(dá)(P<0.01)，并顯著下調(diào)mTOR在mRNA水平的表達(dá)(P<0.05)(圖5).表明LRME可通過下調(diào)mTOR并上調(diào)AMPK和LC3的mRNA表達(dá)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞自噬.

a.mTOR mRNA表達(dá)量；b.AMPK、mTOR和LC3 mRNA表達(dá)量.

3 討論

3.1 LRME調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖

細(xì)胞分裂過程中，CCND1基因所編碼的細(xì)胞周期蛋白D1可與細(xì)胞分裂蛋白激酶4相結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞由G1期向S期過渡，研究發(fā)現(xiàn)CCND1和CDK4下調(diào)，細(xì)胞周期進(jìn)程可被有效阻滯[5-6].此外，增殖細(xì)胞核抗原PCNA在細(xì)胞內(nèi)由G0期開始表達(dá)，S期到達(dá)峰值，M期出現(xiàn)回落[7].作為評價腫瘤細(xì)胞增殖能力的標(biāo)志物，PCNA表達(dá)量越高，表示細(xì)胞增殖越旺盛[8].而“分子衛(wèi)士”抑癌基因TP53則在細(xì)胞DNA發(fā)生損傷時發(fā)揮重要作用.研究發(fā)現(xiàn)，TP53所編碼的野生型p53蛋白可使G0/G1期和G2/M期細(xì)胞停止發(fā)育，從而抑制細(xì)胞增殖[9].基于花青素可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和阻滯細(xì)胞周期[10]，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，LRME顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞S期的細(xì)胞數(shù)，將HepG2細(xì)胞阻滯在G0/G1期；并通過下調(diào)PCNA、CCND1、CDK4和上調(diào)TP53的mRNA表達(dá)來阻滯HepG2細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞的增殖.

3.2 LRME基于線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對HepG2細(xì)胞自噬的影響

自噬是細(xì)胞自身的一種分解代謝機(jī)制，可通過溶酶體降解損傷細(xì)胞器和異常蛋白[11]，其中包括線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物可通過雙膜自噬小體將物質(zhì)傳遞至溶酶體進(jìn)行大量降解[12].雖然自噬通常被認(rèn)為可通過減輕細(xì)胞應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞存活，但目前基于癌癥病理生理學(xué)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的異常自噬對誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡起著重要作用[13-14].內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是合成和加工蛋白質(zhì)的場所，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞時，為了生存，細(xì)胞將啟動一系列自我保護(hù)事件，其中就包括細(xì)胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15].內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通常被認(rèn)為是細(xì)胞的一種病理性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)發(fā)生折疊錯誤和聚集異常，當(dāng)細(xì)胞持續(xù)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，自噬囊泡可吞噬并降解受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，降解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段可被細(xì)胞重新組裝形成新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，恢復(fù)細(xì)胞的正常生理狀態(tài)[15].腫瘤內(nèi)部細(xì)胞因缺氧存在著輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而重度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可造成線粒體損傷，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的存活[16].ATF4是反應(yīng)響應(yīng)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激的一種基因，可參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬[12].mTOR自噬途徑和AMPK基因可響應(yīng)并調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的存活[17-18].本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LRME可有效上調(diào)ATF4的mRNA和蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)mTOR的mRNA表達(dá)并上調(diào)AMPK的mRNA表達(dá)，說明LRME可通過上調(diào)ATF4、AMPK和下調(diào)mTOR促使HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞過度自噬，進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞的存活.

線粒體可參與細(xì)胞多種代謝活動，是細(xì)胞的“能量加工廠”，當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時，細(xì)胞則會啟動線粒體發(fā)生自噬以保證代謝的正常運(yùn)行[19].線粒體自噬需要線粒體與自噬機(jī)制相互作用，使細(xì)胞去除受損或多余的線粒體[20].FUNDC1是哺乳動物的一類典型的線粒體受體，可與線粒體相互作用并將LC3募集到線粒體，并借此誘導(dǎo)線粒體自噬[21].本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，LRME可有效上調(diào)FUNDC1的mRNA和蛋白表達(dá)，并顯著上調(diào)LC3的mRNA表達(dá)，表明LRME可通過上調(diào)FUNDC1和LC3促進(jìn)HepG2細(xì)胞線粒體自噬，并抑制HepG2細(xì)胞存活，這與Chen等[21]研究結(jié)果一致.

4 結(jié)論

LRME可在體外有效促進(jìn)線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞自噬，降低HepG2細(xì)胞活力.