陳東 蔣知新 張潔 史春夏

(1.中國人民解放軍第305醫(yī)院腎臟內(nèi)科，北京 100017；2.中國人民解放軍第305醫(yī)院中心實驗室,北京 100017；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院腎內(nèi)科,北京 101149)

糖尿病腎病是糖尿病并發(fā)癥之一，目前尚未有針對糖尿病腎病的特定治療方法，因此，需深入研究其發(fā)病機制以開發(fā)合適的治療策略及藥物[1-2]。中藥是防治糖尿病腎病的重要方式之一[3-4]。桃葉珊瑚苷(Aucubin，AU)又名杜仲苷，是從中草藥中提取出的天然活性物質(zhì)，一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有良好的抗炎和抗氧化作用[5-6]。研究報道桃葉珊瑚苷可抑制血腫周圍腦組織中TNF-α的表達[7]。桃葉珊瑚苷可能通過抑制MAPKs炎癥信號通路，保護血管內(nèi)皮細胞免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷[8]。桃葉珊瑚苷可以改善肝臟缺血再灌注損傷和腦損傷中的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[9-10]。然而桃葉珊瑚苷對腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響及機制尚不清楚。研究[11]報道m(xù)iR-374可能參與糖尿病性視網(wǎng)膜病的血管生成。2型糖尿病患者血清中miR-374高表達[12]。但miR-374對腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響尚未清楚。本研究探討桃葉珊瑚苷和miR-374對腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響及桃葉珊瑚苷是否通過調(diào)控miR-374的表達影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 腎小管上皮細胞HK-2(美國ATCC)；DMEM培養(yǎng)液(美國Genmed)；葡萄糖(美國Sigma)；桃葉珊瑚苷(HPLC≥98%，上海寶曼生物科技有限公司)；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(日本同仁)；蛋白提取試劑盒(美國Invent)；熒光定量PCR試劑盒(美國Thermo fisher)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)腎小管上皮細胞HK-2，待細胞生長至80%左右時，用終濃度為5.5mmol/L葡萄糖[對照(Con)組]、25mmol/L葡萄糖[高糖(HG)組]處理HK-2細胞，用25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L桃葉珊瑚苷和25mmol/L葡萄糖[桃葉珊瑚苷低、中、高濃度(HG+AU-L、M、H)組]處理HK-2細胞，48 h后收集細胞備用；將miR-NC、miR-374轉(zhuǎn)染至HK-2細胞后用25mmol/L葡萄糖處理，記為HG+miR-NC組、HG+miR-374組；將anti-miR-NC、anti-miR-374轉(zhuǎn)染至HK-2細胞后用100 μmol/L桃葉珊瑚苷和25mmol/L葡萄糖處理，記為HG+AU+anti-miR-NC組、HG+AU+anti-miR-374組。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6、TNF-α水平 收集各組細胞上清液，按試劑盒說明操作。

1.4 流式細胞術(shù)檢測腎小管上皮細胞凋亡情況 收集各組細胞，加300 μL結(jié)合緩沖液，按試劑盒說明操作，上流式細胞儀，檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blot法檢測Bcl-2和Bax的蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，定量后通過SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Bcl-2和Bax一抗在4℃條件下孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，暗室曝光顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白表達水平。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-374表達水平 提取腎小管上皮細胞的總RNA，合成cDNA，設(shè)計合成引物，按試劑盒說明進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線數(shù)據(jù)，按照公式2-△△Ct法[△△Ct=(Ct目的-Ct內(nèi)參)-(Ct對照組-Ct內(nèi)參)]計算miR-374的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥因子表達的影響 與Con組比較，HG組HK-2細胞中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與HG組比較，桃葉珊瑚苷低、中、高濃度組HK-2細胞中IL-6、TNF-α水平降低，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥因子表達的影響

2.2 桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡的影響 與Con組比較，HG組HK-2細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高(P<0.05)；與HG組比較，桃葉珊瑚苷低、中、高濃度組HK-2細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖1，表2。

表2 桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡的影響

2.3 桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞miR-374表達的影響 與Con組比較，HG組HK-2細胞中miR-374表達水平降低(P<0.05)；與HG組比較，桃葉珊瑚苷低、中、高濃度組HK-2細胞中miR-374表達水平升高，呈濃度依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞miR-374表達的影響

2.4 miR-374過表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥損傷的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-374組HK-2細胞中miR-374表達水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，HK-2細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 miR-374過表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥損傷的影響

圖2 miR-374過表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡的影響

2.5 抑制miR-374表達逆轉(zhuǎn)了桃葉珊瑚苷(100 μmol/L)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥損傷的作用 與HG+AU+anti-miR-NC組比較，HG+AU+anti-miR-374組HK-2細胞中miR-374表達水平降低，IL-6、TNF-α水平升高，HK-2細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高(P<0.05)，見圖3，表5。

圖3 抑制miR-374表達逆轉(zhuǎn)了桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡的作用

表5 抑制miR-374表達逆轉(zhuǎn)了桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥損傷的作用

3 討論

腎小管損傷在糖尿病腎病中起著重要作用，且不同炎癥因子都參與其中，其中腎小管上皮細胞能分泌多種細胞因子，導(dǎo)致間質(zhì)炎癥和纖維化的發(fā)生，介導(dǎo)糖尿病腎病發(fā)生與發(fā)展；而中藥成分在治療糖尿病腎病中有顯著優(yōu)勢，干預(yù)糖尿病腎病的炎癥機制[13-17]。桃葉珊瑚苷是一種具有來源豐富，安全性良好和有益生物活性眾多的化合物，具有很高的潛在價值，可用于保健產(chǎn)品和藥品[18]。桃葉珊瑚苷可通過NF-κB通路抑制LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平[19]。桃葉珊瑚苷可減少急性肺損傷小鼠肺內(nèi)TNF-α表達，增加抑炎因子IL-10的表達，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[20]。桃葉珊瑚苷通過下調(diào)Bax、Caspase-3表達上調(diào)Bcl-2表達，抑制HaCaT細胞凋亡[21]。以上研究均表明桃葉珊瑚苷具有抗炎及保護細胞免受損傷的作用。本實驗用高糖處理HK-2細胞模擬體外糖尿病腎病模型，然后用不同濃度桃葉珊瑚苷處理，結(jié)果顯示，IL-6、TNF-α水平及細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，呈濃度依賴性；IL-6、TNF-α是主要的的促炎因子，其高水平加劇炎癥反應(yīng)[22]；因此，本實驗表明桃葉珊瑚苷可濃度依賴性的抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，即桃葉珊瑚苷可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥損傷。提示，桃葉珊瑚苷可能是一種有希望的糖尿病腎病的防治中藥。

研究表明[23]miRNA可參與調(diào)控腎小管上皮細胞損傷過程。研究報道[24]miR-374通過靶向Wnt5a改善腦缺血再灌注損傷。miR-374過表達可防止胸腔硬膜外麻醉后小鼠心肌缺血-再灌注損傷[25]。miR-374可以通過激活PI3K / Akt通路靶向SP1，減輕七氟醚預(yù)處理的大鼠心肌缺血再灌注損傷[26]。本實驗結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞中miR-374表達水平降低；過表達miR-374后，IL-6、TNF-α水平降低，細胞凋亡率降低，表明過表達miR-374后抑制了高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度桃葉珊瑚苷可提高miR-374的表達水平高，而抑制miR-374表達逆轉(zhuǎn)了桃葉珊瑚苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥損傷的作用。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果提示，桃葉珊瑚苷通過上調(diào)miR-374表達抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥損傷。