許麗君，王學(xué)鵬，林偉杰，梁龍銘，赫玉杰，趙正剛，李芳紅，周素瑾，趙子建

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是兒童和青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，目前轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者5年生存率僅為20%[1-2]。骨肉瘤的治療模式是術(shù)前新輔助化療+手術(shù)切除+術(shù)后輔助化療，化療藥物包括順鉑、阿霉素、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺等，但這些化療藥物副作用明顯，且易產(chǎn)生耐藥性。因此，開發(fā)新的藥物治療骨肉瘤迫在眉睫。

磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)能夠特異性水解環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)[3]。研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞MG-63含有較高的PDE4活性[4]，并且用PDE4抑制劑咯利普蘭處理可導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞Saos-2內(nèi)cAMP積累[5]。全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)研究提示cAMP水平降低與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。因此，PDE4有可能成為治療骨肉瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。多年來的研究證實(shí)PDE4抑制劑具有很好的抗腫瘤作用[7]，但其劑量依賴性的胃腸道不良反應(yīng)如惡心、嘔吐等嚴(yán)重阻礙了此類藥物的開發(fā)應(yīng)用，這也成為當(dāng)前開發(fā)新型PDE4抑制劑的難點(diǎn)。ZL-n-91，又稱羅氟普蘭，作為一種新型的高選擇性PDE4抑制劑，其抑制PDE4D4和PDE4D5的IC50分別是11.8 nmol·L-1和19.2 nmol·L-1，相對(duì)于其他PDE家族有至少5 000倍的選擇性，并且通過比格犬灌胃給藥的方式驗(yàn)證了ZL-n-91相對(duì)于咯利普蘭具有極低甚至可能不具有致嘔吐的潛能[8]，因此，ZL-n-91可能成為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的新一代PDE4抑制劑。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),ZL-n-91能夠抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖[9]，但ZL-n-91對(duì)于骨肉瘤的療效尚鮮見報(bào)道。本研究旨在研究ZL-n-91對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，以期為骨肉瘤的靶向治療找到新的突破口。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑 ZL-n-91由藥明康德公司合成，以無水乙醇(EtOH)溶解至相應(yīng)濃度；胰蛋白酶和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；McCOY′s 5A培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8，批號(hào)：G909FA003)購(gòu)自上海生工生物工程公司；碘化丙啶(PI，批號(hào)：90395858)和PE Annexin V/7AAD試劑盒(批號(hào)：9074586)購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司。BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液購(gòu)自Thermo Fisher公司；Bcl-2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，β-actin、GADPH購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、HPR標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自上海碧云天生物公司。

1.2 儀器AC2-4S1型二級(jí)生物安全柜(ESCO，新加坡)；CLM-170B-8-NF型二氧化碳培養(yǎng)箱(ESCO，新加坡)；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(DXP AthenaTM，美國(guó))；ChemiDoc+XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；Leica倒置顯微鏡(Leic，德國(guó))；CMAXPLUS+酶標(biāo)儀(美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS細(xì)胞采用含10%胎牛血清的McCOY′s 5A培養(yǎng)基，均置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行。

1.3.2CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制 將U2OS細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度(0、20、40、80、160、240、320、400、480 μmol·L-1)的ZL-n-91分別處理并培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK-8 溶液10 μL，孵育1～2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(OD)值。計(jì)算ZL-n-91在U2OS細(xì)胞中的半數(shù)抑制濃度和細(xì)胞增殖抑制率/%=(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。之后細(xì)胞設(shè)空白對(duì)照組(Control組)、溶劑對(duì)照組(EtOH組)和ZL-n-91處理組(200 μmol·L-1)，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。梯度培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm處OD值。

1.3.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔1 000個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入藥物處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)3組(EtOH組、50、100 μmol·L-1ZL-n-91處理組)。12 d后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆即終止培養(yǎng)，以多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，經(jīng)PBS洗滌后，將≥50個(gè)細(xì)胞克隆團(tuán)記為1個(gè)細(xì)胞克隆，觀察計(jì)數(shù)各組細(xì)胞克隆形成數(shù)目，結(jié)果以細(xì)胞克隆形成數(shù)目表示。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔接種于6孔板，饑餓處理24 h后加入藥物處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)4組(EtOH組，100、200、300 μmol·L-1ZL-n-91處理組)。藥物處理48 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞。按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行Annexin V-PE、7AAD染色，隨后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U2OS細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔接種于6孔板，饑餓處理24 h后加入藥物處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)2組(EtOH組、200 μmol·L-1ZL-n-91處理組)。藥物處理48 h后，PBS洗滌2次后用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌離心后，加入1 mL 70%的預(yù)冷乙醇，置于-20 ℃固定24 h以上。按照試劑盒說明書進(jìn)行PI染色，隨后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.3.6蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡及周期蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)4組(EtOH組，100、200、300 μmol·L-1ZL-n-91處理組)，藥物處理48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞，超聲破碎后12 000 r·min-1離心20 min。取上清，采用BCA法進(jìn)行測(cè)定蛋白濃度。定量后用12%SDS-PAGE凝膠對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%牛奶封閉1 h，加入稀釋后的一抗于4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)，搖床室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL化學(xué)發(fā)光顯色，并應(yīng)用ImageJ軟件分析目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值，相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2 結(jié)果

2.1 ZL-n-91抑制U2OS細(xì)胞增殖如Fig 1所示，CCK-8結(jié)果顯示ZL-n-91顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖，且隨著濃度增高，ZL-n-91抑制能力增強(qiáng)，其IC50為174.1 μmol·L-1(Fig 1A)。與Control組和EtOH組相比，ZL-n-91(200 μmol·L-1)處理24 h開始，細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P<0.05)(Fig 1B)。與對(duì)照組相比，ZL-n-91對(duì)U2OS細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。

2.2 ZL-n-91對(duì)U2OS細(xì)胞克隆形成能力的影響如Fig 2所示，當(dāng)不同濃度ZL-n-91分別作用于U2OS細(xì)胞后，與EtOH組相比，50、100 μmol·L-1ZL-n-91處理組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯降低(P<0.01)。結(jié)果表明ZL-n-91可抑制U2OS細(xì)胞的克隆形成能力。

2.3 ZL-n-91處理后U2OS細(xì)胞周期變化如Fig 3所示，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與EtOH組相比，ZL-n-91(200 μmol·L-1)處理48 h后，U2OS細(xì)胞的細(xì)胞周期G2/M期比例降低(P<0.01)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01)。結(jié)果表明ZL-n-91可將U2OS細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

Fig 1 Effect of ZL-n-91 on proliferation of U2OS cells n=3)*P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs EtOH

Fig 2 Effect of ZL-n-91 on colony formation of U2OS cells n=3)**P<0.01 vs EtOH

2.4 ZL-n-91處理后U2OS細(xì)胞凋亡變化如Fig 4所示，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，隨著ZL-n-91濃度的增加，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用呈劑量依賴性增高。其中，經(jīng)300 μmol·L-1ZL-n-91處理后，細(xì)胞凋亡比例明顯增加(P<0.01)。結(jié)果表明ZL-n-91可促使U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 Western blot 檢測(cè)ZL-n-91對(duì)U2OS細(xì)胞周期蛋白CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1表達(dá)的影響如Fig 5所示，不同濃度的ZL-n-91處理U2OS細(xì)胞48 h后，與EtOH組相比，CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1的表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)。結(jié)果進(jìn)一步證明ZL-n-91導(dǎo)致U2OS細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

2.6 Western blot 檢測(cè)ZL-n-91對(duì)U2OS細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的影響如Fig 6所示，不同濃度的ZL-n-91處理U2OS細(xì)胞48 h后，與EtOH組相比，300 μmol·L-1處理可明顯降低Bcl-2的蛋白表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果進(jìn)一步證明ZL-n-91可誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Effect of ZL-n-91 on cell cycle distribution of U2OS cells n=3)

Fig 4 Effect of ZL-n-91 on apoptosis of U2OS cells n=3)**P<0.01 vs EtOH

Fig 5 Effect of ZL-n-91 on expression of CDK2,CDK4，CyclinD1,CyclinE1 protein in U2OS n=3)*P<0.05 vs EtOH ,**P<0.01 vs EtOH

Fig 6 Effect of ZL-n-91 on expression of Bcl-2 protein in U2OS cells n=3)**P<0.01 vs EtOH

3 討論

骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后差，早期即能發(fā)生局部及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響青少年的健康。盡管當(dāng)前外科截肢手術(shù)及化療藥物不斷發(fā)展，骨肉瘤患者的5年生存率得以明顯提高，但高劑量的化療藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重[10]，因此尋找新型高選擇性的靶向治療藥物極為重要。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)新型PDE4抑制劑ZL-n-91可導(dǎo)致骨肉瘤U2OS細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，顯著抑制細(xì)胞增殖，為臨床治療骨肉瘤提供新的思路。

ZL-n-91作為新型PDE4抑制劑，選擇性高，副作用低，其在急性肺損傷[11]、帕金森疾病[12]、慢性阻塞性肺疾病[13]、前列腺癌[9]等疾病的治療中都取得了很好的療效?；谇捌谘芯勘砻鞴侨饬黾?xì)胞中高表達(dá)PDE4，提示PDE4有可能成為治療骨肉瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，通過PDE4抑制劑有望治療骨肉瘤。本研究選用新型的PDE4抑制劑ZL-n-91，觀察其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZL-n-91可以以劑量依賴性抑制骨肉瘤細(xì)胞U2OS的增殖，顯著抑制U2OS細(xì)胞的克隆形成能力。

癌癥的發(fā)生發(fā)展與不受控制的細(xì)胞增殖有關(guān)，大多數(shù)化療藥物主要是通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程來抑制細(xì)胞的快速增殖而達(dá)到抗腫瘤的效果。本研究發(fā)現(xiàn)ZL-n-91可使U2OS細(xì)胞阻滯在G0/G1期，這與PDE4抑制劑羅氟司特誘導(dǎo)卵巢癌OVCAR3細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞G0/G1期周期阻滯[14]的研究結(jié)果相一致。CDK2-cyclinE1和CDK4/6-cyclinD1兩種細(xì)胞周期激酶復(fù)合體是啟動(dòng)細(xì)胞周期從G1期到S期順利轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15]。本研究發(fā)現(xiàn)ZL-n-91顯著下調(diào)骨肉瘤U2OS細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1的表達(dá)，表明ZL-n-91可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

細(xì)胞周期阻滯能夠使細(xì)胞進(jìn)行自我介導(dǎo)的DNA修復(fù)或者細(xì)胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)ZL-n-91顯著誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，通過控制線粒體膜通透性來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[17]。本研究觀察到ZL-n-91處理后，U2OS細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)。因此ZL-n-91可通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2觸發(fā)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，新型的PDE4抑制劑ZL-n-91可抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，為研發(fā)抗骨肉瘤新藥提供了一定的理論基礎(chǔ)。