戴夢(mèng)璘，蔣 槺，龔小紅，張勤修

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075；3.攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院耳鼻喉科,四川 攀枝花 617000；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)通過(guò)飛沫傳播、氣溶膠傳播、接觸傳播等途徑進(jìn)入人體而誘發(fā)的急性呼吸道傳染病。SARS-CoV-2病毒常從鼻咽進(jìn)入機(jī)體，與細(xì)胞膜上的病毒受體結(jié)合后開(kāi)始復(fù)制、增殖，因此患者鼻中的SARS-CoV-2病毒載量高于咽喉部[1]。變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉科常見(jiàn)的過(guò)敏性疾病，發(fā)病率高，隨著環(huán)境污染日益加重，目前已影響了全球多達(dá)40%的人口[2]?；加袊?yán)重過(guò)敏性疾病的患者可能面臨更大的COVID-19感染風(fēng)險(xiǎn)和更嚴(yán)重的臨床癥狀。韓國(guó)的一項(xiàng)全國(guó)性隊(duì)列研究表明，在7 340名COVID-19患者中，有4 210名(57.4%)患者患有變應(yīng)性鼻炎[3]。這些患者免疫力弱、敏感性高，較其他人更易感染COVID-19，感染后也更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀。因此，對(duì)于感染了COVID-19的AR患者，應(yīng)采取及時(shí)有效的治療措施防止癥狀加重。但目前還沒(méi)有針對(duì)COVID-19或AR的特異性藥物，因此尋找治療COVID-19合并AR的替代和補(bǔ)充療法非常重要。

中醫(yī)是以辨證論治為診療特點(diǎn)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，在COVID-19及AR的治療中發(fā)揮著重要的作用。在2020年2月發(fā)表的《2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染肺炎快速診斷與治療指南(標(biāo)準(zhǔn)版)》中，已經(jīng)將中醫(yī)療法納入COVID-19的預(yù)防和治療措施當(dāng)中[4]。作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，桂枝湯(Guizhi decoction，GZD)來(lái)源于《傷寒論》，由大棗、桂枝、甘草、白芍和生姜組成?；诒孀C論治的理論，桂枝湯被中醫(yī)廣泛應(yīng)用于COVID-19合并AR的臨床防治中?，F(xiàn)代藥理研究表明，桂枝湯具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用，并能有效提高患者的機(jī)體免疫力[5]。在《新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)經(jīng)方防治推薦方案(國(guó)際第1版)》中，桂枝湯被推薦為COVID-19預(yù)防方[6]。對(duì)于抵抗力弱、慢性病多發(fā)的老年人群體，湖南省推薦桂枝湯作為老年人預(yù)防COVID-19的中藥方劑[7]。此外，作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，桂枝湯對(duì)AR的治療作用也在臨床試驗(yàn)中得到了證實(shí)[8]。然而，用傳統(tǒng)的方法來(lái)闡明桂枝湯治療COVID-19合并AR的多化合物、多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜機(jī)制具有挑戰(zhàn)性。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)來(lái)解釋桂枝湯治療COVID-19合并AR的藥理學(xué)機(jī)制具有重要意義。

Guizhi decoctionFig 1 Venn diagram summarizing common targets of GZD,COVID-19 and AR

1 資料與方法

1.1 桂枝湯活性成分及靶基因的預(yù)測(cè)從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/index.php)中篩選桂枝湯的組成藥物(大棗、桂枝、甘草、白芍、生姜)的主要活性成分。篩選參數(shù)為藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%。然后利用這些活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的MOL ID號(hào)預(yù)測(cè)它們對(duì)應(yīng)的靶蛋白，并借助UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)的基因名稱(chēng)。

1.2 預(yù)測(cè)疾病相關(guān)基因在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，輸入關(guān)鍵詞“novel coronavirus”及“allergic rhinitis”來(lái)檢索與COVID-19和AR相關(guān)的靶基因。

1.3 篩選共有靶點(diǎn)及桂枝湯的關(guān)鍵成分借助Draw Venn Diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選藥物和疾病的共有靶點(diǎn)，以明晰桂枝湯、COVID-19和AR之間的聯(lián)系。應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，來(lái)展示共有靶點(diǎn)和桂枝湯中作用于這些靶點(diǎn)的活性成分之間的關(guān)系。然后，根據(jù)活性成分在網(wǎng)絡(luò)中的度值，篩選出排名前5的關(guān)鍵成分，并從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得這5個(gè)關(guān)鍵成分的2D結(jié)構(gòu)。

1.4 構(gòu)建共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析將上一步獲得的共有靶點(diǎn)輸入到String在線數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://string-db.org/)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，中等置信度=0.400，生成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.1軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，并根據(jù)共有靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度值進(jìn)行排列，最終篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 共有靶點(diǎn)的基因功能富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/)，從生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)3個(gè)方面對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析(P<0.01)。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/)進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.01。使用Hiplot網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(https://hiplot.com.cn)，繪制前10個(gè)GO條目(包括BP、CC、MF)和前20條KEGG通路的氣泡圖和“KEGG通路-共有靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)前10個(gè)GO條目和前20個(gè)KEGG通路進(jìn)行分析。

1.6 核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分之間的分子對(duì)接從RCSB-PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PyMOL 2.4.1軟件中進(jìn)行氫化、脫水和配體分離。同時(shí)，通過(guò)Chembio Office軟件將關(guān)鍵成分處理為mol2格式文件。然后，利用AutoDockTools 1.5.6軟件及Autodock Vina 1.1.2軟件，進(jìn)行核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分之間的分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)合能負(fù)值越高的受體分子在對(duì)接構(gòu)象中越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 桂枝湯活性成分及靶基因的預(yù)測(cè)從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到桂枝湯的五味中藥共含127個(gè)活性成分，這些成分共預(yù)測(cè)到2 554個(gè)靶蛋白。從中剔除重復(fù)的靶蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些蛋白的基因名標(biāo)準(zhǔn)化，得到394個(gè)靶基因。

2.2 預(yù)測(cè)疾病相關(guān)基因在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到COVID-19和AR的相關(guān)基因后，刪除其中的重復(fù)基因和得分低于中位數(shù)的基因，最終篩選出350個(gè)COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)和938個(gè)AR相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 篩選共有靶點(diǎn)及桂枝湯的關(guān)鍵成分在Draw Venn Diagram網(wǎng)站生成的Venn圖中，桂枝湯、COVID-19和AR共有52個(gè)共有靶點(diǎn)(Fig 1)?；谒@得的數(shù)據(jù)，結(jié)合Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建了一個(gè)包含165個(gè)節(jié)點(diǎn)和690條邊的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(Fig 2)。如Fig 2所示，5種中藥的108個(gè)活性成分作用于這52個(gè)共有靶點(diǎn)，桂枝中有6個(gè)，生姜中有4個(gè)，大棗中有17個(gè)，白芍中有4個(gè)，甘草中有86個(gè)。其中，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山奈酚和 (+)-兒茶素存在于兩種或兩種以上的中藥中。網(wǎng)絡(luò)中按度值排名前5位的活性成分是槲皮素(78)、β-谷甾醇(36)、山奈酚(34)、柚皮素(12)和 (+)-兒茶素(12)。這5種活性成分可能就是桂枝湯發(fā)揮抗病毒、抗過(guò)敏作用以治療COVID-19合并AR的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。

Fig 2 The “herbal-active component-target”networkGreen diamonds:herbs;pink octagons:active components that belong to only one herb;red octagons:active components belonging to two or more herbs;blue round rectangles:common targets;gray lines:the interrelationships between herbs,active components,and common targets;DZ:Ziziphus jujuba;GZ:Cinnamomum cassia;GC:Glycyrrhiza uralensis;BS:Paeonia albiflora;SJ:Zingiber officinale.The active component is indicated by the MOL ID in TCMSP database.

2.4 構(gòu)建共有靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析用Cytoscape 3.7.1軟件生成具有52個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 151條邊的共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(Fig 3)。在圖中形狀越大，顏色越深，靶點(diǎn)的度值就越高，在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。比較度值發(fā)現(xiàn)，IL-6、TNF、MAPK3、MAPK8、IL-2、IL-10、CXCL8、IL-4、MAPK1和EGFR是排名前10的核心靶點(diǎn)。

2.5 共有靶點(diǎn)的基因功能富集分析為了闡明桂枝湯治療COVID-19合并AR的多重作用機(jī)制，本研究分別通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)52個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，并獲得顯著富集的1 523個(gè)GO條目(BP 1 428個(gè)，CC 28個(gè)，MF 67個(gè))和145條KEGG通路(P<0.01)。在Hiplot平臺(tái)上，用氣泡圖(Fig 4)展示前10個(gè)GO條目及前20條KEGG通路富集分析的情況。結(jié)果提示，BP主要涉及細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)、T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控等；CC主要涉及細(xì)胞膜區(qū)、質(zhì)膜、細(xì)胞-底物連接部位等；MF主要涉及細(xì)胞因子活性、信號(hào)受體激活劑活性、受體配體活性等；KEGG通路包括Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。觀察“KEGG通路-共有靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 5)，可發(fā)現(xiàn)前20條KEGG通路與52個(gè)共同靶點(diǎn)中的43個(gè)存在相互作用。這一結(jié)果也與這20條主要通路顯著富集的結(jié)果一致。

Fig 3 PPI network of common targets

2.6 核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分之間的分子對(duì)接通過(guò)比較排名前5的關(guān)鍵成分的2D結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)槲皮素的結(jié)構(gòu)與山奈酚、柚皮素、(+)-兒茶素相似，因此以槲皮素作為這3種關(guān)鍵成分的代表進(jìn)行分子對(duì)接。β-谷甾醇的2D結(jié)構(gòu)與其它四種化合物有明顯不同，因此也選擇它進(jìn)行分子對(duì)接。借助PyMOL 2.4.1軟件、AutoDockTools 1.5.6軟件和Autodock Vina 1.1.2軟件，將這兩種關(guān)鍵成分(槲皮素、β-谷甾醇)與前3個(gè)核心靶點(diǎn)(IL-6、TNF、MAPK3)進(jìn)行分子對(duì)接。如Fig 6所示，關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)可以很好地結(jié)合。最佳模式下，槲皮素-IL-6、槲皮素-TNF、槲皮素-MAPK3的結(jié)合能分別為-4.8、-7.2、-9.1 kcal·mol-1；β-谷甾醇-IL-6、β-谷甾醇-TNF、β-谷甾醇-MAPK3的結(jié)合能分別為 -7.2、-7.7、-7.7 kcal·mol-1。

Fig 4 Bubble diagrams of GO and KEGG enrichment analysis of common targetsThe top 10 GO (BP,CC,MF)terms and the top 20 KEGG pathways were shown in bubble diagrams.

Fig 5 The “KEGG pathway-common target”network diagramBlue nodes:the top 20 KEGG pathways;red nodes:common targets;colored lines:the connection between KEGG pathways and common targets.

Fig 6 Molecular docking resultsA：Quercetin+IL-6；B：Quercetin+TNF；C：Quercetin+MAPK3；D：Beta-sitosterol+IL-6；E：Beta-sitosterol+TNF；F：Beta-sitosterol+MAPK3

3 討論

本研究共篩選出桂枝湯的127個(gè)有效成分和394個(gè)基因靶點(diǎn)。經(jīng)過(guò)分析Venn圖和“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)桂枝湯可通過(guò)108個(gè)活性成分與52個(gè)共有靶點(diǎn)的結(jié)合來(lái)發(fā)揮治療作用。108個(gè)活性成分的大多數(shù)來(lái)源于甘草，這提示甘草應(yīng)該是桂枝湯治療COVID-19合并AR的關(guān)鍵藥物。根據(jù)度值篩選出的關(guān)鍵成分主要屬于黃酮類(lèi)、植物甾醇類(lèi)和酚類(lèi)；核心靶點(diǎn)多為促炎細(xì)胞因子。共有靶點(diǎn)顯著富集于1 523個(gè)GO條目和145條KEGG通路中，包括與抗病毒、抗過(guò)敏、抗炎機(jī)制相關(guān)的條目和通路，如T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、NF-κB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路。最后，經(jīng)過(guò)分子對(duì)接證實(shí)了關(guān)鍵成分可以自發(fā)地與核心靶點(diǎn)相結(jié)合。

前5位關(guān)鍵成分中，(+)-兒茶素屬于酚類(lèi)化合物，β-谷甾醇屬于植物甾醇類(lèi)，其他三種活性成分屬于黃酮類(lèi)化合物。這表明，黃酮類(lèi)、植物甾醇類(lèi)、酚類(lèi)化合物是桂枝湯治療COVID-19合并AR的關(guān)鍵。研究證實(shí)，黃酮類(lèi)化合物不僅可以直接殺滅病毒，減輕炎癥[9]；而且還可以通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡來(lái)調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎患者的免疫機(jī)制[10]。兒茶素可以降低血清中IgE、IL-5、IL-13的水平，恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞平衡，并有效的減輕AR的炎癥反應(yīng)[11]。β-谷甾醇廣泛存在于多種中草藥中，具有抗病毒、抗氧化和抗菌活性，且它的抗病毒及抗過(guò)敏作用與抗病毒及免疫相關(guān)信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)[12-13]。

為了確定共有靶點(diǎn)之間的相互作用，本研究構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)度值篩選出前10個(gè)核心靶點(diǎn)，即IL-6、TNF-α、MAPK3、MAPK8、IL-2、IL-10、CXCL8、IL-4、MAPK1和EGFR。這些靶點(diǎn)是桂枝湯治療COVID-19合并AR的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在COVID-19的發(fā)病過(guò)程中會(huì)引發(fā)炎癥及免疫反應(yīng)，還會(huì)激活多種細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-6、STAT3等[14]。研究人員在重度COVID-19患者的血漿中也發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-2、IL-7、IL-10等細(xì)胞因子的水平較高[15]。MAPK1、MAPK3和MAPK8廣泛存在于多種中草藥中，參與了細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等生物過(guò)程的調(diào)節(jié)，它們是治療COVID-19的重要靶點(diǎn)[12]。

通過(guò)分析GO條目可以發(fā)現(xiàn)桂枝湯在T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、膜區(qū)、質(zhì)膜、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、信號(hào)受體激活劑活性等方面具有特異性作用。桂枝湯的抗過(guò)敏和抗病毒作用與顯著富集的KEGG通路有關(guān)，這些通路包括：Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路及IL-17信號(hào)通路。在Coronavirus disease-COVID-19通路中有17個(gè)共有靶點(diǎn)參與，這表明桂枝湯可以通過(guò)這17個(gè)靶點(diǎn)直接作用于Coronavirus disease-COVID-19通路，從而在COVID-19的治療中發(fā)揮不可或缺的作用。NF-κB是多種損傷反應(yīng)基因的多效調(diào)節(jié)因子，NF-κB信號(hào)通路可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)的轉(zhuǎn)錄，它還能觸發(fā)Th1、Th17介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，促進(jìn)IFN-γ和IL-17的釋放[16]。Toll樣受體是固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要參與者，它在識(shí)別氣道中潛在的病原體及激活相應(yīng)的免疫反應(yīng)的過(guò)程中起重要作用[17]。T細(xì)胞受體信號(hào)通路傳導(dǎo)的復(fù)雜分子機(jī)制會(huì)引起T細(xì)胞的活化，從而影響機(jī)體的免疫反應(yīng)[18]。

綜上所述，本研究表明桂枝湯主要通過(guò)黃酮類(lèi)、植物甾醇類(lèi)、酚類(lèi)等活性成分與共有靶點(diǎn)(IL-6、TNF、MAPK3等)的結(jié)合，來(lái)參與病毒、免疫、炎癥相關(guān)信號(hào)通路和生物細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)，最終達(dá)到治療COVID-19與AR的目的。