申安平，李 桓，王炳森，李曉坤，李松偉

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1.研究生院、2.第一臨床醫(yī)學(xué)院、3.藥學(xué)院、4.第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)累及腎臟致免疫復(fù)合物沉積而形成的炎癥性腎病，病程較長且易反復(fù)發(fā)作，若不及時控制可造成嚴(yán)重的腎臟損傷。LN尚無對應(yīng)的中醫(yī)病名，可根據(jù)臨床癥狀將其歸類為“腎痹”“陰陽毒”等范疇，病因病機(jī)為風(fēng)濕內(nèi)擾于腎。雷公藤為衛(wèi)矛科藤本植物雷公藤的干燥根，其味苦辛，能燥能行，祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)，治療LN風(fēng)濕擾腎證[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)雷公藤具有抗炎、止痛和免疫抑制等作用，具有與糖皮質(zhì)激素相似的治療效應(yīng)，已成為國內(nèi)治療狼瘡性腎炎的常用藥物。但是雷公藤制劑也會造成腎功能衰竭、腎功能不全、血尿、少尿、肌酐升高等與腎臟相關(guān)的不良反應(yīng)[2]，因此，LN治療選用雷公藤時應(yīng)該更加謹(jǐn)慎。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建雷公藤干預(yù)LN的作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，分析作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點和信號通路，探討雷公藤對LN的效-毒作用，為進(jìn)一步研究評價雷公藤治療LN整體效果提供思路及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件本研究利用中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫獲取雷公藤主要活性成分及靶點；從CoolGeN數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫中搜集狼瘡性腎炎相關(guān)靶點；運用Uniprot數(shù)據(jù)庫將獲得的蛋白靶點名稱標(biāo)準(zhǔn)化后通過STRING數(shù)據(jù)庫分析蛋白相互作用關(guān)系；使用Venny在線工具及Cytoscape3.7.1軟件分析藥物疾病共同靶點形成韋恩圖，并構(gòu)建“藥物-成分-靶點圖”和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 雷公藤成分及靶點篩選基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集雷公藤的化學(xué)成分。根據(jù)吸收、分布、代謝、排泄ADME參數(shù)篩選出同時滿足口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18的化學(xué)成分并預(yù)測其靶點。通過Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將所得靶點蛋白名轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。

1.3 狼瘡性腎炎相關(guān)靶點收集和篩選基于人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http://www.omim.org/)、在線文本挖掘工具CoolGeN數(shù)據(jù)庫(http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)，以“l(fā)upus nephritis”為關(guān)鍵詞收集與狼瘡性腎炎相關(guān)的疾病靶點。為增加疾病靶點的可信度，收集過程中根據(jù)疾病基因出現(xiàn)頻率刪除支撐文獻(xiàn)較少的靶點。將檢索結(jié)果合并去重得到LN疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

1.4 雷公藤對LN作用靶點預(yù)測將雷公藤成分靶點和狼瘡性腎炎靶點數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)分析得到兩者共同靶點，即為雷公藤治療LN的潛在作用靶點。采用Cytoscape3.7.1軟件繪制雷公藤-活性成分-潛在作用靶點-LN網(wǎng)絡(luò)模型。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建雷公藤對LN的治療效應(yīng)是多個蛋白交互作用的結(jié)果。使用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(STRING11.0)(https://string-db.org/Version 11.0)分析雷公藤治療LN的作用靶點，限定物種為人(homo sapiens)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，去掉游離的靶點，篩選置信度0.400以上的蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件可視化作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO和 KEGG富集分析為了解中藥的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用，將雷公藤治療LN靶點導(dǎo)入采用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(the database for annotation,visualization and integrated discovery,DAVID6.7)(https://David.ncifcrf.gov/)DAVID6.7數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集與京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG))通路富集分析，P<0.05，并按照所含的靶點數(shù)目進(jìn)行排序，篩選有統(tǒng)計學(xué)意義且可靠的生物過程和通路。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤成分靶點和狼瘡性腎炎疾病靶點篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到雷公藤52種潛在藥效成分和對應(yīng)的167個相關(guān)靶點，剔除22個沒有對應(yīng)靶點的成分和94個重復(fù)靶點，得到30個藥物有效成分和73個對應(yīng)的靶點，其中多個成分可以共同作用于一個靶點，成分triptolide、tripterine、kaempferol對應(yīng)的靶點尤多。在CoolGeNCool、OMIM和GeneCards 3個疾病數(shù)據(jù)庫中搜索“l(fā)upus nephritis”，去重后共得到1 227個與狼瘡性腎炎相關(guān)的靶點。

2.2 雷公藤-狼瘡性腎炎治療靶點預(yù)測利用VENNY2.1將73個藥物靶點與1 227個疾病靶點取交集，藥物-疾病共同靶點共有38個，見Fig 1，即為雷公藤治療狼瘡性腎炎的作用靶點。利用Cytoscape3.7.1構(gòu)建雷公藤-LN調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如Fig 2，圖中橘紅色圓形代表雷公藤有效成分，藍(lán)色圓形代表雷公藤-LN共同靶點基因。

Fig 1 Intersection of predicted targets of Tripterygium wilfordii Hook.f.target and LN

2.3 作用靶點蛋白互作關(guān)系與核心靶點篩選在String中分析得到雷公藤-狼瘡性腎炎作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，包括35個節(jié)點，207條邊。以節(jié)點大小和顏色深度代表相鄰節(jié)點數(shù)目，相鄰節(jié)點越多，節(jié)點越大，顏色越深，在PPI網(wǎng)絡(luò)中的地位就越重要。以邊的粗細(xì)代表Combined score，即相互關(guān)系的綜合得分，Combined score值越高，邊越粗，兩個節(jié)點的連接質(zhì)量越高。Degree值>13的靶點有13個，具體如Fig 3。

Fig 2 Component-target network of Tripterygium wilfordii Hook.f.in treatment of lupus nephritis

Fig 3 PPI network of Tripterygium wilfordii Hook.f.for LN

2.4 雷公藤-狼瘡性腎炎作用基因的生物學(xué)過程GO富集分析結(jié)果顯示雷公藤-狼瘡性腎炎作用基因的生物過程(biological process,BP)顯著富集在凋亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、細(xì)胞通訊的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控、對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育、對細(xì)胞遷移的調(diào)控、NF-κB級聯(lián)的調(diào)控、白細(xì)胞黏附等；細(xì)胞組分(cell component,CC)主要富集在細(xì)胞外區(qū)域部分、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞器內(nèi)腔、膜封閉腔、核腔、細(xì)胞表面、基底膜等；分子功能(molecular function,MF)主要富集在類固醇激素受體活性、配體依賴性核受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、序列特異性DNA結(jié)合、蛋白復(fù)合物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶調(diào)節(jié)劑活性等。按照統(tǒng)計學(xué)P值由小到大部分展示，見Tab 1。

2.5 雷公藤-狼瘡性腎炎作用基因的生物學(xué)通路KEGG通路富集結(jié)果顯示雷公藤-狼瘡性腎炎主要富集在細(xì)胞凋亡途徑(apoptosis)、黏著斑途徑(focal adhesion)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、p53信號通路(p53 signa-ling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、RIG-I樣受體信號通路(RIG-I-like receptor signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等，見Tab 2。

Tab 1 GO enrichment of potential targets from Tripterygium wilfordii for lupus nephritis

Tab 2 KEGG enrichment results of Tripterygium wilfordii Hook.f.-lupus nephritis treatment targets

3 討論

3.1 富集通路分析根據(jù)KEGG通路富集結(jié)果分析，雷公藤對LN治療作用主要表現(xiàn)在抑制免疫及炎癥、腎間質(zhì)纖維化和血管損傷等方面，見Fig 5。①調(diào)控免疫及炎癥：NOD樣受體家族、RIG-Ⅰ受體家族和Toll樣受體家族等模式識別受體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。NOD樣受體信號通路在狼瘡性腎臟疾病中介導(dǎo)早期炎癥反應(yīng)、炎癥因子的致纖維化作用、誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、促使腎小球系膜細(xì)胞增殖等[3]。核心靶點RELA、CASP8、MAPK8等富集在此通路中，RELA作為NF-κB的組分可能通過上調(diào)促炎癥介質(zhì)和促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤而加劇腎組織炎癥的發(fā)生；MAPK8激活胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-jun氨基末端激酶等調(diào)節(jié)腎組織炎癥反應(yīng)和纖維化過程[4]，在狼瘡樣小鼠腎組織中表達(dá)上調(diào),成分雷公藤甲素使MAPK8進(jìn)核受阻從而抑制促炎細(xì)胞因子的釋放[5]。RIG-Ⅰ受體信號通路和TOLL樣受體信號通路也可促進(jìn)促炎因子和干擾素IFN等分子的表達(dá)，引起LN的異常炎癥反應(yīng)，參與腎臟增生性改變[6]。富集在這兩條通路中的核心靶點FOS組成激活子蛋白AP-1，通過下游促炎分子網(wǎng)絡(luò)參與LN腎小管間質(zhì)損傷[7]。②抑制腎間質(zhì)纖維化和血管損傷：P53信號通路可通過誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞增生的恢復(fù)[8]。在此通路中，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CCND1能夠促使細(xì)胞持續(xù)增殖，研究證明CCND1與腎小球增殖程度密切相關(guān),而雷公藤中雷公藤紅素等多種成分能夠下調(diào)CCND1的表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖[9]。黏著斑(focal adhesion)是細(xì)胞骨架的重要結(jié)構(gòu)，既維持細(xì)胞整體形態(tài)，又參與信號傳遞等生命活動。富集在黏著斑通路中的靶點BCL2可調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡,雷公藤成分川陳皮素能夠增加BCL2表達(dá)水平以調(diào)節(jié)抗凋亡機(jī)制[10]。

Fig 5 KEGG pathway of Tripterygium wilfordii Hook.f.-lupus nephritis treatment targets

3.2 核心靶點分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示degree>13的核心靶點還有TIMP1、PPARG、MCL1、ESR1、ICAM1、VCAM1、MYC等。TIMP1能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)腎小球硬化進(jìn)程，還能夠抑制系膜細(xì)胞的凋亡，加劇細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積，雷公藤成分雷公藤紅素抑制腎臟TIMP1的表達(dá)，對狼瘡鼠模型的腎小球硬化有明顯的延緩作用[11]。MCL1在多種自身免疫性疾病中過表達(dá)，可能通過異常調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡參與LN腎小球增生性病變。ESR1編碼雌激素受體α，其表達(dá)水平與紅斑狼瘡抗ANA抗體、抗RAP抗體和臨床癥狀嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。ICAM-1、VCAM-1被多種細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)誘發(fā)表達(dá)，募集白細(xì)胞黏附于腎臟，加重炎癥反應(yīng)引起組織損傷，造成腎組織微循環(huán)障礙和組織灌溉失調(diào)，最終導(dǎo)致腎臟功能受損，而雷公藤的多種成分對細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)具有抑制作用[13]。原癌基因MYC,廣泛參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，尤其與增殖活躍的組織密切相關(guān)，可能通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖紊亂而影響狼瘡發(fā)病。

3.3 潛在毒副作用預(yù)測通過查閱文獻(xiàn)對研究結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，雷公藤的主要化學(xué)成分對腎組織也具有潛在副作用，如Fig 6。CASP3能夠啟動凋亡過程，研究表明在狼瘡性腎炎中CASP3表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致腎小球足細(xì)胞凋亡、蛋白尿癥狀加重，而雷公藤成分雷公藤甲素上調(diào)CASP3和CASP9的表達(dá)[14]，可能加重蛋白尿癥狀。VEGFA在PPI網(wǎng)絡(luò)中是核心靶點，與其受體FLT1具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和血管系統(tǒng)完整性的功能，能在炎癥環(huán)境中保護(hù)腎小球濾過屏障[15]，在狼瘡性腎炎中VEGFA合成降低且血清受體FLT1升高，導(dǎo)致腎組織內(nèi)VEGFA不足，致使纖維化和蛋白尿的發(fā)生，但實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素等成分能在乳腺癌等疾病中下調(diào)VEGFA的表達(dá)抑制血管形成[16]，若雷公藤甲素在腎臟組織中具有相同效應(yīng)，則可能加重腎臟損害；PPARG在受損腎臟細(xì)胞上表達(dá)增強(qiáng)，具有抗腎臟纖維化作用，雷公藤成分山柰酚和β-谷甾醇被證實分別在骨髓充質(zhì)干細(xì)胞和心肌中表現(xiàn)出對PPARG的抑制作用[17]，其在腎組織中是否具有同樣的抑制作用并促使腎臟纖維化還需進(jìn)一步研究。雄激素受體AR則在SLE發(fā)生發(fā)展中起保護(hù)性作用，雷公藤中多種成分可作用于AR降解途徑阻斷AR信號通路[18]，干擾雄激素對LN的保護(hù)作用。

Fig 6 Schematic diagram of corresponding targets ofeffective-toxic componentsPink:up-regulation;blue:Down-regulation;dotted line:potential toxicity

3.4 小結(jié)本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤成分雷公藤甲素、雷公藤紅素、川陳皮素等可能通過RELA、CASP8、MAPK8、BIRC2、FOS、CCND1、BCL2等靶點，在NOD樣受體信號通路、RIG-Ⅰ受體信號通路、Toll樣受體信號通路、p53信號通路和黏著斑通路中發(fā)揮治療狼瘡性腎炎作用，其他核心靶點TIMP1、PPARG、MCL1、ESR1、ICAM1、VCAM1、MYC雖未富集在上述通路中，但也可通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮治療作用。有效成分雷公藤甲素具有治療作用，同時也因作用于靶點CASP3、CASP9、VEGFA可能導(dǎo)致蛋白尿癥狀加重、腎臟纖維化進(jìn)程提前。其他成分如山柰酚和β-谷甾醇等也可能通過靶點PPARG、AR促使腎臟纖維化。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及文獻(xiàn)信息整合方法探討了雷公藤對狼瘡性腎炎可能的效-毒作用及其機(jī)制，為雷公藤的現(xiàn)代研究、靶向給藥和安全應(yīng)用提供基礎(chǔ)。此研究中所預(yù)測的雷公藤治療LN的有效成分、作用通路和效-毒作用需更進(jìn)一步深入研究、測定和臨床驗證。