楊善忠鄧招游黃宏業(yè)唐廷崇吳文健李曉平陶卿胡庭俊何家康

(1.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530007；2.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧 530005)

雞熱毒壅盛喘咳證是以咳喘癥狀為主要特征的一類疾病的統(tǒng)稱，其致病機理是由于熱毒入侵肺經(jīng)所致，肺氣不宣，則呼吸不暢導致咳喘，肺氣清肅，肺失肅降，肺氣則會上逆，同樣造成咳喘，從而導致脾運化受阻，肝腎氣血不足，最終咳喘加重[1,2]；致病因素主要包括細菌、病毒、代謝病、飼養(yǎng)管理不當?shù)萚2]。臨床表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、頻繁搖頭伸頸、氣管啰音、流鼻液等一系列癥狀[3]。剖檢可見，上呼吸道、消化道均有出血性炎癥，心包積液并伴有大量的炎性滲出，肝臟腫大，腎臟腫大有出血點，全身多處肌肉出血。該病病程長短不一，短則幾天，肉雞最長可延續(xù)至出欄，嚴重影響了禽類養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益[4]。腫節(jié)風三清顆粒處方為自研方，由腫節(jié)風、射干、甘草3味藥材組成，通過處方來源、處方依據(jù)及藥物對雞熱毒壅盛喘咳證的處方篩選試驗，經(jīng)中獸醫(yī)辯證施治理論組方而成[5]。前期的人工感染傳染性支氣管炎模型試驗結(jié)果表明，腫節(jié)風三清顆粒推薦劑量對人工復制雞熱毒壅盛喘咳證具有良好的療效[6]，為了進一步驗證腫節(jié)風三清顆粒的臨床治療效果以及劑量和用藥療程的合理性，本試驗使用該制劑的推薦劑量對雞自然感染熱毒壅盛喘咳證患雞的散發(fā)病例進行了擴大臨床療效試驗，以期對雞熱毒壅盛喘咳證的臨床治療提供更多理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

廣西岑溪某雞場散發(fā)病例，符合中獸醫(yī)喘咳證熱毒壅盛證型的病雞120只。品種為廣西“岑溪三黃雞”，日齡為180日齡，體重為900～1300g。

1.1.2 受試藥品

腫節(jié)風三清顆粒，廣西北斗星動物保健品有限公司生產(chǎn)，經(jīng)廣西獸藥監(jiān)察所檢驗合格。規(guī)格：1g相當于原生藥1.6g；250g/袋。生產(chǎn)批號：20101201。

麻杏石甘散，廣西普大動物保健品有限公司生產(chǎn)，經(jīng)廣西獸藥監(jiān)察所檢驗合格。規(guī)格：250g/袋；生產(chǎn)批號：20110301。

1.1.3 試驗材料

天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒，丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒，白蛋白(ALB)試劑盒，總蛋白(TP)試劑盒；尿酸(UA)測定試劑盒，氯化物(Cl)測定試劑盒，肌酐(CR)測定試劑盒等，均購于四川省邁克科技有限公司；傳染性支氣管炎病毒(IBV)標準陽性血清，購自中國獸藥監(jiān)察所；蔗糖，購自北京益利精細化學品有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞熱毒壅盛喘咳證診斷方法的建立

1.2.1.1 流行病學調(diào)查與臨床癥狀觀察

按常規(guī)方法對雞群進行流行病學調(diào)查。試驗期間，每天觀察并記錄雞的各種臨床癥狀，如呼吸道癥狀、精神、飲欲、食欲等。

1.2.1.2 病理剖檢

對死亡病例逐只剖檢，記錄內(nèi)臟器官尤其是肺臟、氣管、支氣管、鼻竇、鼻腔和腎臟等處的病理變化。

1.2.1.3 實驗室檢查

微量血凝和血凝抑制(HA-HI)試驗。無菌采集經(jīng)過臨床和病理剖檢初步診斷患有熱毒壅盛喘咳證病雞的病料(鼻咽拭子)，接種于雞胚尿囊腔培養(yǎng)增殖，收集尿囊液，隨后將粗提病毒懸液進行蔗糖線性梯度離心進一步純化，并通過微量(HA-HI)試驗判斷病毒效價。

PCR鑒定。各組隨機抽取10只病雞或者瀕死狀態(tài)的病雞頸動脈放血處死，觀察氣管、肺臟以及腎臟病變，取氣管、肺臟、腎臟凍存，參照InvitrogenTRIzol提取試劑盒說明書提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，然后取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 臨床療效試驗

1.2.2.1 病例的選擇

為蛋雞場6月齡產(chǎn)蛋雞的散發(fā)病例見熱毒壅盛喘咳證候者。病雞臨床表現(xiàn)：大部分病雞出現(xiàn)咳嗽,甩頭，鼻漏，氣喘,張口呼吸，氣管啰音；部分雞高熱，排白色糞便，鼻竇、眼瞼腫脹，眼結(jié)膜發(fā)紅，精神不振，食欲、產(chǎn)蛋下降。依據(jù)熱毒壅盛喘咳證表現(xiàn)的癥候群以確定主癥﹑次癥和納入標準。

主癥：氣管啰音，氣喘，張口呼吸，咳嗽，甩頭，高熱。

次癥：鼻竇、眼瞼腫脹，眼結(jié)膜發(fā)紅，排白色尿酸鹽糞便，精神不振，食欲下降。

納入標準：符合主癥3～4項，次癥1～2項。

納入病例還按上述1.2.1要求進行部分病例的剖檢和實驗室檢查，綜合考察、選擇符合條件的病雞作為試驗雞。

1.2.2.2 試驗分組及動物處理

符合病例選擇標準的6月齡試驗雞120只，采用隨機原則分為2組，試驗藥物組和藥物對照組每組各60只。具體試驗分組與處理見表1。

表1 試驗分組與處理

1.2.2.3 飼養(yǎng)條件

室內(nèi)雙層單籠飼養(yǎng)，同欄舍對照，自由采食、飲水，飼料為雞場飼料車間自行配制且不含任何藥物的蛋雞全價料。

1.2.2.4 觀察指標

臨床癥狀：試驗期間，每天觀察并記錄雞的臨床癥狀，如健康狀況、站姿、呼吸、精神狀態(tài)、食欲、糞便、飲食量、飲水量等。觀察期從第1次給藥后持續(xù)到停藥后第15天。從給藥后每天記錄疾病發(fā)展情況，最后統(tǒng)計治愈率和有效率。

增重情況：于試驗前1d(第1天)、試驗結(jié)束第2天(第22天)分別于上午采食前逐個空腹稱重，并計算各組平均增重和相對增重率。

病理剖檢：對死亡病例逐只剖檢，記錄肺臟、氣管、支氣管、鼻竇和鼻腔等處的病理變化。

血液生化指標：每組病雞隨機抽取20只，分別于試驗前1d(第1天)、給藥結(jié)束第2天(第7天)，早晨空腹翅下靜脈采血，分離血清，-20℃保存，用于谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿酸(UA)等肝腎生化指標的檢測。

1.2.2.5 療效評價標準

臨床療效主要指標為氣管啰音、氣喘、咳嗽、高熱；次要指標為鼻竇、眼瞼、眼結(jié)膜、精神、食欲、糞便等狀況。按治愈、顯效、有效、無效作為判定。

治愈：氣喘、咳嗽、氣管啰音、鼻竇腫脹等消失，體溫、精神、食欲、糞便恢復正常，在停藥觀察期內(nèi)不復發(fā)，判為治愈，計算治愈率。

顯效：主要癥候氣管啰音消失，氣喘、咳嗽明顯改善，體溫、精神、食欲、糞便恢復正常，在停藥觀察期內(nèi)不加重，判為顯效。

有效：氣管啰音消失，咳嗽、氣喘等證候有較好的改善，體溫、精神、食欲明顯改善，在停藥觀察期內(nèi)不加重，判為有效，根據(jù)治愈、顯效和有效，計算總有效率。

無效：在試驗期間，用藥后臨床證候沒有得到改善甚至加重或死亡，或在停藥觀察期內(nèi)復發(fā)判為無效，無效雞數(shù)占每組試驗雞數(shù)的百分率為無效率。

1.2.2.6 療效綜合判定

依據(jù)臨床療效、增重情況、血液生化指標等做出綜合評定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以平均值±標準差表示，計數(shù)資料用卡方(X2)統(tǒng)計，組內(nèi)用藥前后比較和組間均數(shù)比較采用單因素與方差比較(ANOVA)和多重比較(LSD)，其中LSD比較是t檢驗。

2 試驗結(jié)果

2.1 病例診斷結(jié)果

2.1.1 臨床證候及病理變化

納入標準的試驗雞臨床表現(xiàn)：咳嗽，氣喘，氣管啰音，鼻竇腫脹，鼻腔有大量分泌物，結(jié)膜炎，拉白色尿酸樣稀便，部分雞體溫升高達42～43℃，精神不振，食欲、產(chǎn)蛋下降，具體臨床資料見表2。

表2 納入標準的試驗雞臨床資料

剖檢病死雞可見鼻腔、眶下竇及氣管粘膜充血，氣管充滿黏液，肺充血、腫大、出血，氣囊有豆腐渣樣分泌物，腎腫大、充血，呈花斑腎，腎小管呈白色變粗，內(nèi)有尿酸鹽結(jié)晶，輸卵管出血，蛋膜上有白色分泌物。其它器官未見明顯異常。

2.1.2 實驗室診斷

2.1.2.1 微量HA-HI試驗結(jié)果

試驗雞病料病毒分離物經(jīng)過蔗糖密度梯度離心提純，1μg·mL-1的磷酸酶37℃處理后，具有典型的血凝性，能夠凝集雞0.5%紅細胞，血凝效價均達到27以上，而且這種血凝性可以被傳染性支氣管炎特異抗血清所中和，證明病料中含有傳染性支氣管炎病毒。

2.1.2.2 PCR診斷結(jié)果

部分病死雞的PCR鑒定如圖1所示，病料在740bp附近出現(xiàn)了1條明顯的核苷酸條帶，與設計的引物大小一致，表明病雞感染了傳染性支氣管炎病毒。

圖1 病死雞病料病毒基因組N基因的PCR鑒定

2.1.3 中獸醫(yī)辯證

主癥：呼吸困難，氣喘，咳嗽，鼻竇腫脹，氣管啰音或高熱，拉白色尿酸鹽樣稀便，眼結(jié)膜發(fā)紅。

證候分析：疫癘之邪侵入機體，故見高熱；熱毒壅盛阻于肺，痰熱互結(jié)，故見氣喘，咳嗽，氣管啰音；痰濁阻滯致氣滯血瘀，故見鼻竇腫脹，結(jié)膜發(fā)紅；若熱毒之邪，深入血分，即見臟腑器官喉充血、出血。

辯證：根據(jù)主癥及病理解剖中實質(zhì)器官腫大、充血、出血，辯證為熱毒壅盛型喘咳證。

綜合流行病學調(diào)查、臨床癥狀、病理剖檢﹑實驗室診斷以及結(jié)合中獸醫(yī)辯證，確診病雞所患疾病為雞傳染性支氣管炎，屬熱毒壅盛喘咳證范疇。

2.2 臨床療效試驗結(jié)果

2.2.1 藥物組臨床療效測定

由表3可知，試驗藥物組和對照藥物組的治愈率分別為61.7%和50.0%，兩者差異不顯著(P>0.05)，兩藥的總有效率分別為91.7%和86.7%，差異不顯著(P>0.05)，試驗藥物和對照藥物麻杏石甘散給藥48h后，病情得到有效控制，連續(xù)用藥5d，使雞群得以恢復健康，表明腫節(jié)風三清顆粒和麻杏石甘散對雞熱毒壅盛喘咳證均具有良好的治療作用。

表3 腫節(jié)風三清顆粒對雞熱毒壅盛型喘咳證的治療效果(N=60)

2.2.2 試驗雞血液生化指標

由表4可知，給予腫節(jié)風三清顆粒和麻杏石甘散后均使試驗雞血液中的UA、ALB、TP、ALT、AST、Cl、CR的含量水平發(fā)生一定程度的降低，且腫節(jié)風三清顆粒極顯著(P<0.01)地降低血中UA的水平，表明腫節(jié)腫節(jié)風三清顆?？梢苑乐鼓蛩猁}的沉積，對腎臟具有一定的保護作用。

表4 不同時間段試驗雞血液生化指標的變化(M±S d=20)

2.2.3 平均增重

試驗藥物組與對照藥物組的平均增重率分別為14.65%、13.04%，表明腫節(jié)風三清顆粒和麻杏石甘散對患有熱毒壅盛喘咳證病雞的增重均有一定的促進作用，且腫節(jié)風三清顆粒的增重效果略優(yōu)于麻杏石甘散。

3 討論

熱毒壅盛喘咳證多因溫熱之邪由口鼻而入，或風寒、風熱之邪入里化熱，邪化熱內(nèi)陷壅迫于肺，肺失宣降，則見喘息[7,8]。肺主氣、司呼吸，主宣降，可通過宣發(fā)作用將體內(nèi)的代謝廢氣呼出體外，將脾傳至肺的水谷精微之氣散發(fā)至全身，外達皮毛；通過肅降作用吸入新鮮空氣，將津液和水谷精微向下散布全身，并將代謝產(chǎn)物和多余液體下輸于腎和膀胱[9]。肺宣發(fā)肅降不暢則會引起咳嗽、氣喘等癥狀。因此，對于熱毒壅盛喘咳證應以清宣肺熱、止咳平喘原則加以治療，麻杏石甘散治療該病便是基于此原則[10,11]。腫節(jié)風三清顆粒復方中腫節(jié)風清熱解毒，涼血化瘀，利咽和祛痰平喘的功能為針對治療主癥而設，故作為君藥；射干清熱解毒，降氣化痰、平喘為臣藥；甘草調(diào)和諸藥，兼具清熱解毒，化痰止咳之功，為使藥。3藥合用，共奏清熱解毒，涼血化瘀，止咳平喘之功。本試驗結(jié)果顯示，腫節(jié)風三清顆粒對雞熱毒壅盛喘咳證的治愈率有效率分別為91.7%和61.7%，明顯優(yōu)于麻杏石甘散86.7%和50.0%；腫節(jié)風三清顆?？娠@著降低血液中UA的含量(p<0.01%)，可以防止尿酸鹽的形成和在腎臟及腎小管中的沉積，從而發(fā)揮保護腎功能的作用。

4 結(jié)論

綜合臨床療效，試驗前后血液生化指標中的尿酸含量變化及試驗雞增重情況可得以下結(jié)論：腫節(jié)風三清顆粒和麻杏石甘散對自然感染雞熱毒壅盛喘咳證均具有良好的療效，但腫節(jié)風三清顆粒的臨床總體療效要優(yōu)于對照藥物麻杏石甘散；腫節(jié)風三清顆粒臨床推薦用藥方案，混飲，每天1.2g·kg-1體重，連用5d，是合理的。