張靜嫻，杜桂林,3，史吉平,3，馬治國，袁辰陽,3，劉相岑，張保國

(1中國科學院 上海高等研究院，上海 201210; 2中國科學院大學，北京 100049； 3上?？萍即髮W 生命學院，上海 201210)

隨著人口數(shù)量增加、人民生活水平逐漸提高，一系列社會問題日益凸顯，比如農(nóng)業(yè)和食品加工業(yè)的固體廢棄物驟增帶來的環(huán)保壓力，耕地面積銳減導致糧食和飼料用地競爭、飼料成本上升[1-2]。水稻和蔬菜是維持人類營養(yǎng)需求的兩大類主要作物，據(jù)統(tǒng)計我國每年因生產(chǎn)和銷售產(chǎn)生的蔬菜廢棄物及水稻秸稈約8億和9億t[2-3]，蔬菜廢棄物通常含水率高,易腐爛，比如甘藍、花椰菜、莧菜；而水稻秸稈含水量低，降解速度慢。據(jù)報告我國每年約有20%作物秸稈和70%蔬菜廢棄物未被合理利用，而是采用焚燒或者掩埋方式處理，從而引起大氣和土壤污染、溫室氣體排放、病原體傳播等環(huán)境污染問題，所以這兩類農(nóng)業(yè)固體廢棄物的減量化和資源化利用方式亟待開發(fā)[2,4-6]。這兩類作物廢棄物的產(chǎn)生具有季節(jié)性、區(qū)域性的特點，利用兩者含水率互補的特點將其飼料化利用是一種被普遍認可的資源化方式[1,3,7-9]。事實上，蔬菜廢棄物干物質(zhì)中富含維生素、粗脂肪，而作物秸稈富含反芻動物能夠消化利用的多糖，所以蔬菜廢棄物和作物秸稈可作為廉價的飼料原料來應對飼料短缺、成本高的問題；此外將二者混合貯存不僅可以有效延長飼料貯藏時間，而且還可以有效降低飼料原料附生的病原菌、改善感官品質(zhì)和營養(yǎng)成分[7,10]。因此，研究甘藍尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵方式，對于緩解農(nóng)業(yè)固廢帶來的環(huán)境壓力和飼料短缺問題具有重要意義。

混合青貯是一個厭氧固體發(fā)酵過程，通常伴隨著微生物群落演替、新陳代謝，從而改變飼料原料的理化特性。發(fā)酵良好的青貯飼料往往是以乳酸菌為優(yōu)勢和關鍵物種，通過同型乳酸發(fā)酵降低原料pH和病原菌含量，使干物質(zhì)含量不變[10]。據(jù)報道，新鮮青貯飼料原料中的乳酸菌數(shù)量達到105CFU/g，可有效保留飼料中的養(yǎng)分[2-11]。在青貯過程中，附生乳酸菌將水溶性碳水化合物代謝為有機酸(如乳酸、乙酸、丁酸)，以迅速降低pH值并抑制有害微生物以及青貯過程不需要的其他微生物。然而，還有一些附生病原體(如腸桿菌屬Enterobacter、曲霉菌屬Aspergillus)和產(chǎn)孢細菌(如梭狀芽孢桿菌Clostridium、芽孢桿菌屬Bacillus)可以存在于酸性和厭氧環(huán)境中，導致微生物毒素積累和乳酸發(fā)酵生產(chǎn)效率降低[10,12-13]。系統(tǒng)地研究青貯飼料發(fā)酵過程中的微生物群落演替、多樣性及其表型功能,可以促進對青貯飼料生產(chǎn)過程的了解。前人在分析微生物多樣性時應用了多種分子生物學的方法，如16S rRNA克隆建庫、變性梯度凝膠電泳技術(PCR-DGGE)、限制性片段長度多樣性(T-RFLP)等[14]。目前，新一代高通量測序技術在微生物多樣性分析中應用較多，其直接根據(jù)樣品中提取的DNA，同時進行幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，不僅能夠分析樣品中的微生物種類以及相對豐度(RA)，而且能夠?qū)颖局械奈⑸飳崿F(xiàn)精準的分類，挖掘分析樣品中低豐度的菌群，最大限度地保留樣品中微生物的信息[14-15]。與此同時，新一代測序技術(如16S rRNA基因克隆文庫、宏基因組學)和生物信息學注釋工具(如BugBase、FUNGuild)的開發(fā)使得環(huán)境微生物研究更加方便[16-20]，例如Du等[21]在甘藍尾菜厭氧發(fā)酵過程中，基于OTU測序數(shù)據(jù)首次利用BugBase和FUNGuild注釋工具預測微生物群落功能多樣性。研究報道，生態(tài)環(huán)境中微生物群落的演替以及環(huán)境因子的變化主要受到關鍵物種而非優(yōu)勢物種的影響[20,22]，而在青貯飼料領域很少有學者關注關鍵物種的作用機制。

本研究將蔬菜廢棄物甘藍尾菜與干水稻秸稈混合貯存厭氧發(fā)酵30 d，分析厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵指標、營養(yǎng)成分、微生物群落演替和表型功能變化，同時探究影響微生物群落演替及其青貯性能的關鍵微生物物種，旨在為甘藍尾菜和干水稻秸稈飼料化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

干水稻秸稈購自長遠秸稈加工廠(中國安徽)，均勻粉碎至長度為1～2 cm。甘藍(BrassicaoleraceaL.)尾菜收集于上海市浦東新區(qū)北蔡農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場，切碎至大小為2 cm×2 cm。玉米粉購自河北保定淶水縣金谷糧油食品有限公司。3種原材料的主要理化特性(以干物質(zhì)計)見表1。

表1 3種原材料的主要理化特性Table 1 Physicochemical parameters of the three raw materials

EM菌劑(產(chǎn)品編號：OKH0601；糞腸球菌≥10億 CFU/g，枯草芽孢桿菌≥100億CFU/g)購自洛陽歐科拜克生物技術股份有限公司(中國河南)，主要包括泛菌屬Pantoea和腸球菌屬Enterococcus。

1.2 青貯試驗設計

將10.0 g EM菌劑和100 mL無菌8.0 g/L NaCl溶液于500 mL錐形瓶中混合，30 ℃恒溫條件下振蕩1 h，獲得液體接種劑。每袋混貯發(fā)酵樣品由180 g甘藍尾菜、40 g干水稻秸稈、40 g玉米粉和5 mL上述液體接種劑組成，自然pH值和含水率。將混合原料裝入青貯發(fā)酵袋(23 cm×30 cm，PET塑料)中，用真空封口機抽盡空氣并封口，共15個平行，將青貯發(fā)酵袋置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光厭氧發(fā)酵30 d。在發(fā)酵的第0，3，7，15，30天取樣，每次取樣3個平行，并于-20 ℃冰箱保存。

1.3 分析樣本的制備

第一份浸提液沉淀的收集：將20.0 g青貯樣品與180 mL無菌8.0 g/L NaCl溶液在500 mL錐形瓶中混合，30 ℃恒溫條件下振蕩1 h，之后將上述溶液用4層無菌醫(yī)用紗布抽濾，將濾液在4 ℃、10 000×g離心20 min，收集沉淀物用于微生物群落分析。

第二份浸提液的上清液收集：收集方法與第一份浸提液類似，只是用無菌水代替無菌8.0 g/L NaCl溶液，于4 ℃、10 000×g離心20 min后收集上清液，用于分析后續(xù)的理化指標(水溶性碳水化合物(WSC)、pH、乙酸、丁酸、乳酸、乙醇、氨氮、總氮含量)[23]。

1.4 理化特性分析

1.4.1 發(fā)酵品質(zhì) 取100 g左右混貯發(fā)酵樣品于65 ℃下干燥72 h以測定干物質(zhì)(DM)含量。參考Gu等[24]的方法，使用島津20AVP液相色譜系統(tǒng)(日本京都島津公司)檢測有機酸(乳酸、乙酸、丁酸)和乙醇含量。使用數(shù)字pH計(美國Sartorius PB-10)測定pH值。使用納氏試劑(美國Hach公司)測定氨氮含量，使用元素分析儀(Perkinelmer系列Ⅱ 2400，英國)檢測總氮含量，銨態(tài)氮含量用氨氮與總氮含量之比計算。WSC含量采用蒽酮法[25]測定。

1.4.2 營養(yǎng)成分 取100 g左右混貯發(fā)酵樣品于65 ℃下干燥72 h，之后將樣品用小型粉碎機粉碎后過孔徑0.037 mm篩，并用自封袋保存于干燥避光處，用于測定營養(yǎng)成分(粗蛋白(CP)、粗脂肪(CF)、酸性洗滌纖維素(ADF)、中性洗滌纖維素(NDF))含量，具體檢測方法參考張麗英的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術》[26]進行分析。

1.5 樣品DNA的提取和PCR擴增

稱取0.25 g第一份浸提液沉淀，參考E.Z.N.A.?soil DNA Kit (Omega Bio-Tek,Norcro-ss,GA,USA)說明書提取基因組DNA，DNA樣品的純度和濃度用NanoDrop 2000 UV-vis spectrophotometer (Thermo Scientific,Wilmington,USA)檢測，所有DNA樣品均保存在-80 ℃冰箱。以上述基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增原核生物16S的V3-V4可變區(qū)域和真核生物的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-ITS2,使用的引物分別為帶有條形碼融合引物的338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC-TAAT-3′)以及ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGA-GGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物，操作流程參考AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說明書進行。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina文庫構建和Illumina MiSeq平臺(Illumina,San Diego,USA)測序，具體流程參考任海偉等[5]的方法進行。本研究中的所有原始序列集已上傳到NCBI(BioProject ID：PRJNA686717，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)。

1.6 生物信息學分析

使用QIIME(版本1.9.1，http://qiime.org/)對原始Illumina fastq文件進行解復用、質(zhì)量過濾和分析。使用UPARSE(版本7.1)將質(zhì)量過濾后的序列聚類作為操作分類單元(OTU)，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。用UCHIME去除嵌合序列，使用RDP Classifier2.2將測序序列與數(shù)據(jù)庫silva138 (https://www.arb-silva.de/)和Unite 8.0(https://unite.ut.ee/)中的序列進行比對和物種注釋，置信閾值為70%。質(zhì)控后的序列以OTU為最小分類單元進行抽平，每個OTU對應序列數(shù)除以總序列數(shù)即為該OTU對應的相對豐度(RA)。生物信息學分析均在Majorbio云平臺上(https://www.majorbio.com)進行操作。青貯過程中細菌和真菌的Alpha多樣性指數(shù)(Coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù))使用Mothur 1.30.2分析。青貯過程中微生物物種的差異使用PCoA和Adonis檢驗(OUT水平999個隨機排列，Bray-Curtis相異)進行評估。用BugBase(https://bugbase.cs.umn.edu/)預測和分析細菌表型[17],利用FUNGuild(http://www.funguild.org/)對真菌的表型、營養(yǎng)模式和生態(tài)公會進行注釋[18]?；谖锓N屬水平的相對豐度，分析物種之間Spearman相關性，并構建共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖，使用Gephi 0.9.2繪制其共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖，紅色和綠色的點(nodes)分別代表細菌屬和真菌屬，紅色和綠色的邊(edges)分別代表相連的兩個屬的正相關和負相關關系，共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖僅展示RA>1%的屬之間的相關性(Spearman相關性系數(shù)>0.7，P<0.05)[27]。利用冗余分析(RDA，Canoco 5)評估甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中樣品理化指標與微生物優(yōu)勢物種間相關性，并計算了理化指標pH、CF、WSC等對微生物優(yōu)勢物種變化的解釋度[28]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 26.0軟件計算和分析數(shù)據(jù)，Origin 2021繪制圖形，Excel 2019繪制表格。數(shù)據(jù)之間的差異性用單因子ANOVO模型分析，并用Tukey事后檢驗進行多重比較分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化

甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化如表2所示。

表2 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵不同時間后發(fā)酵品質(zhì)的變化Table 2 Variation of fermentation characteristic indicators with different fermentation times in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

表2顯示，與發(fā)酵前(第0天)相比，發(fā)酵結束時(30 d)pH、干物質(zhì)和水溶性碳水化合物含量顯著下降，乳酸、乙酸、丁酸和乙醇含量顯著積累(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間的增加，干物質(zhì)含量逐漸降低，發(fā)酵結束時為270.4 g/kg，干物質(zhì)含量保留了87.5%。pH值由初始的弱酸性5.9迅速降低到4.6(第3天)，并于腐熟階段(第30天)降低至4.0。與發(fā)酵前相比，第3～15天銨態(tài)氮含量顯著增加，但在發(fā)酵結束時降低到5.9%。微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物有機酸和乙醇含量的變化趨勢與銨態(tài)氮相似，即發(fā)酵前期迅速增加而發(fā)酵結束時明顯降低。上述結果表明甘藍尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中，發(fā)酵品質(zhì)明顯改善，但15 d之后發(fā)酵品質(zhì)會略有下降。

2.2 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化

甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分的變化如表3所示。表3顯示，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵結束時粗脂肪、粗蛋白、酸性洗滌纖維素含量無顯著變化(P>0.05)，而中性洗滌纖維素含量顯著上升(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間的增加，粗脂肪含量總體上先降低后增加，粗蛋白含量無明顯變化，酸性洗滌纖維素和中性洗滌纖維素含量總體上均先增加后降低。

表3 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵不同時間后營養(yǎng)成分的變化Table 3 Variation of nutrition indicators with different fermentation times in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw g/kg

2.3 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落演替的變化

微生物Alpha多樣性指數(shù)(Coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù))可以反映物種的多樣性，其中Coverage指數(shù)表示測序和處理后的數(shù)據(jù)是否能代表樣本中微生物群落的真實情況；Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；Chao1指數(shù)越大，說明群落豐富度越高。甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落演替的變化見表4和表5。

表4 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵不同時間后微生物群落Alpha多樣性指數(shù)的變化Table 4 Variation of Alpha diversity indicators of microbial community with different fermentation times in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

表5 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落門水平上的物種相對豐度比較Table 5 Comparison of species RA differences of microbial communities at the phylum level in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

由表4可知，細菌和真菌群落的Coverage指數(shù)為0.99～1.00，說明研究結果準確地反映了貯存過程中的微生物群落的變化。細菌群落的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)均于發(fā)酵第3天之后顯著下降(P<0.05)，真菌群落的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著變化，可知與真菌群落相比，混貯發(fā)酵過程對細菌群落的影響更顯著。

表5顯示，發(fā)酵前(0 d)門水平上的優(yōu)勢物種(RA>5%)包括細菌界的厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)和真菌界的子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)。與發(fā)酵前(0 d)相比，發(fā)酵過程中(3～30 d)細菌界優(yōu)勢物種放線菌門和變形菌門相對豐度顯著下降(P<0.05)，厚壁菌門相對豐度顯著增加(P<0.05)；真菌界的優(yōu)勢物種子囊菌門和擔子菌門相對豐度無顯著變化(P>0.05)。

表6顯示，發(fā)酵前(0 d)屬水平上的優(yōu)勢物種(RA>5%)包括細菌界的泛菌屬(Pantoea，RA 33.42%)、芽孢菌屬(Bacillus,RA 18.98%)、腸桿菌屬(Enterobacter，RA 10.15%)和真菌界的節(jié)擔菌屬(Wallemia，RA 20.14%)、鐮孢菌屬(Fusarium，RA 44.28%)、曲霉屬(Aspergillus，RA 19.53%)、未分類的酵母目(unclassified_o__Saccharomycetales，RA 13.77%)。與發(fā)酵前(0 d)相比，發(fā)酵過程中(3～30 d)細菌界的片球菌屬(Pediococcus)、未分類的腸桿菌科(unclassified_f__Enterobacteriaceae)、腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、未分類的乳桿菌科(unclassified_f__Lactobacillaceae)相對豐度均顯著增加(P<0.05)，泛菌屬、芽孢菌屬和葡萄球菌屬(Staphylococcus)相對豐度均顯著下降(P<0.05)；發(fā)酵過程中真菌界的unclassified_f__Dipodascaceae相對豐度顯著增加，鐮孢菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、未分類的酵母目(unclassified_o__Saccharomycetales)、帚枝霉屬(Sarocladium)相對豐度均顯著下降(P<0.05)。

表6 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落屬水平上的物種相對豐度比較Table 6 Comparison of species RA differences in microbial communities at the genus level in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

2.4 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落功能多樣性的變化

微生物群落組成的變化可能引起其功能多樣性的變化?；诩毦?6S的V3-V4可變區(qū)域和真核生物的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-ITS2的測序結果，對甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落的功能表型進行注釋，結果見圖1。圖1顯示，9種細菌功能表型被注釋，包括耐氧性(需氧型、厭氧型、兼性厭氧型)，革蘭氏陽性/革蘭氏陰性，形成生物膜，包含移動原件，潛在致病型，氧化脅迫耐受；同時12種真菌功能表型被注釋，包括未定義的腐生型、土壤腐生型、植物致病型、動物致病型、未知型以及致病型1～7。初始階段(第0天)，原材料中細菌群落的主要類型包含兼性厭氧型(RA 81.1%)、需氧型(RA 18.8%)、厭氧型(RA 0.2%)、形成生物膜(RA 66.3%)、革蘭氏陰性(RA 59.5%)、潛在致病型(RA 74.5%)；發(fā)酵過程中，需氧型、形成生物膜、潛在致病型、革蘭氏陰性細菌相對豐度總體上均顯著降低(P<0.05)，并在第30天時相對豐度分別為8.0%，31.5%，31.8%，31.3%。發(fā)酵0 d時，原料中富集兩類真菌群落，分別為未定義的腐生型真菌(RA 54.60%)和動物致病型-植物內(nèi)生型-地衣寄生型-植物病原型-土壤腐生型-木腐型(致病型4，RA 44.28%)，發(fā)酵過程中致病型真菌相對豐度顯著下降，未定義的腐生型真菌顯著富集(P<0.05)；青貯第30天時，真菌群落的表型主要包括動物致病型(RA 15.64%)和未定義的腐生型真菌(RA 80.55%)。

2.5 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落間的互作關系

為了觀測微生物群落演替過程中物種間的互作關系，基于物種屬水平相對豐度的變化構建了共現(xiàn)性網(wǎng)絡，結果見圖2。圖2顯示，共現(xiàn)性網(wǎng)絡由38個點(代表細菌屬或真菌屬)和91條無向的邊(代表相連細菌屬或真菌屬之間的相關性)組成，包含72個顯著較強的正相關關系和19個顯著較強的負相關關系；網(wǎng)絡直徑為7.0，平均維度4.8，模塊性0.424，僅1個連接的組分。片球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、未分類的乳桿菌科4類乳酸菌與其他物種多呈負相關關系；節(jié)擔菌屬Wallemia和unclassifi-ed_f__Dipodascaceae2類腐生型真菌與其他物種多呈負相關關系。細菌屬的維度(單個屬具有的相關性)普遍高于真菌屬，尤其是鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、短桿菌屬Brevibacterium、芽孢桿菌屬Bacillus。優(yōu)勢物種片球菌屬與泛菌屬Pantoea、葡萄球菌屬Staphylococcus、曲霉菌屬Aspergillus呈負相關關系，與unclassified_f__Dipodascaceae呈正相關關系。乳桿菌屬Lactobacillus與未定義的酵母目unclassified_o__Saccharomycetales、假單胞菌屬Pseudomonas、曲霉屬Aspergillus呈負相關關系，與假絲酵母屬Candida呈正相關關系。腸球菌屬Enterococcus與短狀桿菌屬Brachybacterium、小單胞菌屬Micromonospora、短桿菌屬呈負相關關系，與魏斯氏菌屬Weissella、未分類的乳桿菌目unclassified_o__Lactobacillales呈正相關關系。未分類的乳桿菌科unclassified_f__Lactobacillacea與泛菌屬、Lapillicoccus呈負相關關系。優(yōu)勢真菌節(jié)擔菌屬Wallemia與類芽孢桿菌屬Paenibacillus、鞘氨醇單胞菌屬、短狀桿菌屬呈負相關關系；優(yōu)勢真菌unclassified_f__Dipodascaceae與Methylobacterium-Methylorubrum、葡萄球菌屬、鐮孢菌屬Fusarium、曲霉屬呈負相關關系，與片球菌屬、假絲酵母屬Candida呈正相關關系。

2.6 甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物優(yōu)勢物種與理化指標的相關性

利用冗余分析(RDA)研究混貯發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物物種相對豐度與理化指標的相關性，以及理化指標對優(yōu)勢物種變化的解釋度,結果見圖3。圖3顯示，RDA前兩個軸共解釋了86.76%的優(yōu)勢物種的變化，此外pH、WSC、CF是影響微生物優(yōu)勢物種演替的關鍵理化因子，分別解釋了微生物優(yōu)勢物種演替的73.7%，10.2%，4.7%。pH、CF、WSC、DM之間呈正相關，其與微生物代謝產(chǎn)物有機酸(乳酸、乙酸、丁酸)以及乙醇和銨態(tài)氮含量之間呈負相關。pH、WSC與優(yōu)勢物種鐮孢菌屬、曲霉屬、泛菌屬、腸桿菌屬相對豐度之間呈正相關關系，與片球菌屬、未分類的腸桿菌科unclassified_f__Enterobacteriaceae的相對豐度之間呈負相關關系。CF與優(yōu)勢物種腸球菌屬、節(jié)擔菌屬相對豐度之間呈負相關關系。

3 討 論

3.1 混貯發(fā)酵過程中理化指標的變化

混貯發(fā)酵過程中充足的DM (>200 g/kg)和WSC (>50 g/kg)是反映青貯飼料品質(zhì)優(yōu)劣的基礎指標[29]。本研究中，甘藍尾菜與干水稻秸稈發(fā)酵0 d時DM(309.0 g/kg)和WSC含量(71.9 g/kg)均達標，發(fā)酵結束時(30 d)DM、WSC含量以及pH均顯著下降，可能是因為微生物降解了原料中的碳水化合物，尤其是易降解的WSC代謝產(chǎn)生了乙醇、銨態(tài)氮和有機酸(LA、AA和BA)。pH值是評價青貯飼料品質(zhì)優(yōu)良的重要指標[5]。一般優(yōu)良青貯飼料的適宜pH為3.8～4.2。本試驗中，pH值在發(fā)酵15 d時為4.1，發(fā)酵結束時為4.0，在適宜pH范圍內(nèi)。Cao等[11]發(fā)現(xiàn)，蔬菜廢棄物貯存過程中，有機酸的積累會導致pH迅速下降，并且抑制霉菌、腸桿菌、芽孢桿菌的富集，這與本研究結果一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)良品質(zhì)的青貯飼料中銨態(tài)氮含量應低于10%，而青貯飼料中銨態(tài)氮是由粗蛋白和多肽降解產(chǎn)生的，過高的銨態(tài)氮含量可能表征青貯飼料中蛋白質(zhì)和多肽水解反應迅速，營養(yǎng)流失過快[7]。本試驗中，銨態(tài)氮含量在青貯3～15 d過程中較高，表示青貯前半階段飼料中蛋白質(zhì)和多肽流失較快;青貯結束時銨態(tài)氮含量保持在5.9%，達到適宜銨態(tài)氮含量范圍。本試驗中，與發(fā)酵15 d相比，發(fā)酵結束(30 d)時乳酸含量顯著下降，可能是酵母菌與乳酸菌存在共生機理作用，酵母菌可以分泌水解酶代謝脂肪、蛋白質(zhì)和乳酸鹽，產(chǎn)生乳酸，為乳酸菌代謝提供了更多的底物[30-31]。本研究中，隨著發(fā)酵時間的增加，CF含量總體上先降低后增加，CP含量無明顯變化，ADF和DNF含量總體上均先增加后降低?？赡苁且驗槲⑸飪?yōu)先代謝易降解的營養(yǎng)成分，如CP、CF、WSC，而ADF和NDF在厭氧條件下難以分解，所以在混貯發(fā)酵過程中ADF和DNF含量會略有上升。

3.2 混貯發(fā)酵過程中微生物群落的演替

微生物群落的演替及其代謝作用在青貯過程中起到至關重要的作用，尤其是關鍵乳酸菌可以將底物中的碳水化合物代謝為乳酸，并抑制病原菌在發(fā)酵過程中的富集。Alpha多樣性指數(shù)可以反映微生物物種的多樣性。本試驗中，真菌和細菌群落Coverage指數(shù)均大于0.99，表示測序結果準確地反映了貯存過程中的微生物群落變化；細菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)在混貯發(fā)酵過程中均顯著下降(P<0.05)，真菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)在整個混貯發(fā)酵過程中無顯著變化(P>0.05)，說明本試驗中發(fā)酵過程對細菌群落影響較大，對真菌群落影響較小。

混貯發(fā)酵樣品的品質(zhì)與微生物菌群結構有密切聯(lián)系。本試驗中，發(fā)酵結束時優(yōu)勢細菌(RA>5%)由初始的泛菌屬、芽孢菌屬、腸桿菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗峋?片球菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬、未分類的乳桿菌科)和腸桿菌類(未分類的腸桿菌科、腸桿菌屬)。據(jù)報道，乳桿菌屬、片球菌屬、腸球菌屬和魏斯氏菌屬是青貯飼料中常見的乳酸菌，與發(fā)酵過程中有機酸的積累密切關聯(lián)[2,32]；而腸桿菌類細菌由于其具有較低的產(chǎn)有機酸效率和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)銨態(tài)氮能力，通常被認為是非理想菌群。在本試驗中，主要的乳酸菌和腸桿菌類細菌平均相對豐度分別是72.3%和22.2%，而相對豐度較高的腸桿菌類細菌可能造成干物質(zhì)損失和銨態(tài)氮積累，所以為了提高青貯品質(zhì)，建議選用更適用的接種物，比如植物乳桿菌Lactobacillusplantarum[2]。本研究中，發(fā)酵結束時真菌群落的優(yōu)勢物種由腐生型的節(jié)擔菌屬、曲霉屬、未分類的酵母目以及致病型的鐮孢菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)楦偷墓?jié)擔菌屬、致病型的鐮孢菌屬，其中致病型的鐮孢菌屬和腐生型的曲霉屬相對豐度在發(fā)酵過程中顯著下降，可能是因為較低的pH不利于其生長。Keshri等[16]發(fā)現(xiàn)，在小麥秸稈青貯曝氣過程中乳酸的降解和pH上升會導致鐮孢菌屬、曲霉屬2類霉菌顯著富集，造成混貯發(fā)酵樣品養(yǎng)分流失[16]。本試驗中，青貯厭氧條件良好，混貯發(fā)酵樣品發(fā)酵特征指標良好，發(fā)酵結束時鐮孢菌屬、曲霉屬的相對豐度也明顯下降。unclassified_f__Dipodascaceae屬于酵母目，在混貯發(fā)酵過程中相對豐度顯著增加，而原材料中的未分類的酵母目unclassified_o__Saccharomycetales相對豐度顯著下降，這2個屬都是腐生型真菌，不具備致病性。

3.3 混貯發(fā)酵過程中微生物群落功能的變化

在以往研究中，由于微生物群落較為復雜，故研究優(yōu)勢物種的功能表型效率很低，而BugBase、FUNGuild、PICRUSt2等生物信息學工具的開發(fā)，使預測微生物群落功能表型的效率得到明顯提高，且準確性更高。本試驗中，與發(fā)酵前(第0天)相比，發(fā)酵結束(30 d)時需氧型、形成生物膜、革蘭氏陰性、潛在致病型細菌相對豐度均顯著下降(P<0.05)，同時動物致病型的真菌群落的相對豐度也顯著下降(P<0.05)。據(jù)前人報道，如果新鮮蔬菜廢棄物中乳酸菌的含量低于105CFU/g 新鮮原料，或者新鮮原料需氧型細菌含量大于106CFU/g ，可能會造成發(fā)酵過程中低效率的乳酸發(fā)酵和好氣性敗壞[2,10-11]，其中能形成生物膜的細菌可以緊密吸附到材料表面并且抵抗惡劣的外界環(huán)境，比如高溫、低pH和抗生素環(huán)境，這類細菌本身不一定具有致病性，但會給一些致病菌提供適宜的生長和傳播環(huán)境，從而引起寄主的一系列侵襲性疾病[33]。革蘭氏陰性細菌往往是潛在致病菌，由于其外膜上帶有的內(nèi)毒素會在細胞裂解后釋放出來，對于反芻動物以外的動物來說，飼料中富集這類細菌可能會造成動物的食物中毒反應[10]。而對于動物致病性真菌，例如鐮孢菌屬在青貯過程中通常會產(chǎn)生鐮刀霉毒素，會嚴重影響畜牧行業(yè)動物的生長性能和產(chǎn)品品質(zhì)[12]。本試驗中，上述幾類非理想微生物的相對豐度明顯下降，推測可能與混貯發(fā)酵過程中產(chǎn)有機酸的乳酸菌和產(chǎn)乙醇的酵母菌的富集有關[10]。

3.4 微生物優(yōu)勢物種與理化指標間的互作關系

微生物群落的演替不僅受到生物物種間的相互作用，同時發(fā)酵底物理化指標的變化也會影響微生物菌群結構。Banerjee 等[20]認為，微生物共現(xiàn)性網(wǎng)絡中，物種間顯著的相關性可能代表了物種間的協(xié)助共生作用,或物種間具有共同的捕食者、負相關的底物競爭關系。本試驗中，正相關普遍存在于相對豐度較低的微生物之間，比如芽孢桿菌、泛菌屬，推測可能是這些物種在混貯發(fā)酵過程中被優(yōu)勢物種顯著抑制從而具備正相關關系；一些乳酸菌和腐生型真菌與其他物種之間存在明顯的負相關關系，推測這些物種在混貯發(fā)酵過程中改善了青貯飼料品質(zhì)并抑制病原菌的富集。然而很少有學者同時研究青貯飼料中細菌、真菌群落的互作關系以及關鍵物種的作用。研究表明，在環(huán)境微生物群落中關鍵物種不一定是優(yōu)勢物種[18-19]，有些優(yōu)勢物種與微生物群落演替和發(fā)酵品質(zhì)改善沒有明顯的相關性。本研究中，節(jié)擔菌屬真菌在混貯發(fā)酵過程中一直保持較高的相對豐度(11.5%～95.9%)，但其對于有機酸、乙醇的積累和木質(zhì)纖維素的降解等未起到明顯作用，反而降低了粗脂肪含量；此外，片球菌屬和未分類的腸桿菌科可能促進了WSC轉(zhuǎn)化為有機酸(LA、AA、BA)，同時降低了pH值和鐮孢菌屬、曲霉屬、泛菌屬、腸桿菌屬的相對豐度，但一般認為腸桿菌類產(chǎn)LA效率較低，實際生產(chǎn)中應該降低該物種的豐度[10]。本研究中，unclassified_f__Dipodascaceae抑制了鐮孢菌屬、曲霉屬富集，與片球菌屬相互促進，該結果與共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖中的結果一致。綜上所述，片球菌屬、unclassified_f__Dipodascaceae是甘藍尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中改善青貯品質(zhì)的關鍵物種。

4 結 論

與發(fā)酵前相比，甘藍尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵后發(fā)酵品質(zhì)明顯改善，營養(yǎng)成分無明顯改善，干物質(zhì)含量被有效保存。貯存過程中細菌群落的多樣性和豐富度顯著下降，乳酸菌群和腐生型真菌作為優(yōu)勢物種顯著富集，并有效抑制非理想菌群(尤其是需氧型和潛在致病微生物)的積累。此外，片球菌屬、unclassified_f__Dipodascaceae是甘藍尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中改善青貯品質(zhì)的關鍵物種。混貯發(fā)酵是資源化處理甘藍尾菜與干水稻秸稈的有效方式。