班雯婷，胡彪，康佩姿，劉娟

(廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣州 510310)

隨著人們對(duì)健康的重視，國(guó)內(nèi)外對(duì)研發(fā)安全性高、無(wú)熱量、成本低、適于糖尿病與肥胖癥患者食用的甜味劑如低聚果糖的需求迫在眉睫。低聚果糖又稱蔗果低聚糖[1-4]，是由1～3個(gè)果糖基通過(guò)糖苷鍵與蔗糖分子相連構(gòu)成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。低聚果糖具有優(yōu)越的生理功能：調(diào)節(jié)腸道菌群， 降低血脂，增強(qiáng)免疫力，低熱量，抗齲齒，潤(rùn)腸通便，促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收。

低聚果糖的來(lái)源主要有兩種：一種來(lái)自植物，一種來(lái)自微生物酶法合成。微生物酶法合成是指以微生物發(fā)酵產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)低聚果糖的方法。果糖基轉(zhuǎn)移酶主要來(lái)源于酵母[5]和霉菌[6-7]。微生物發(fā)酵法不受季節(jié)性限制且成本低、效率高，是目前工業(yè)生產(chǎn)低聚果糖的主要方式。

法夫酵母是一種高附加值菌種，能發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖、胡蘿卜素、蝦青素等，為進(jìn)一步的聯(lián)產(chǎn)實(shí)驗(yàn)提供了支持，此外有報(bào)道證明[8]，法夫酵母在蔗糖培養(yǎng)基的生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生果糖基轉(zhuǎn)移作用而生成一種新型三糖，這種新型蔗果三糖被命名為新科斯糖(neokestose)，研究表明[9]，新科斯糖增殖雙歧桿菌的能力比一般商業(yè)用低聚果糖更優(yōu)越。

目前，法夫酵母生產(chǎn)新科斯糖的研究在國(guó)外較少涉及，國(guó)內(nèi)主要是江南大學(xué)進(jìn)行研究[10]，法夫酵母生物量最高達(dá)到11.46 g/L，發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖最高產(chǎn)量為 250.37 g/L，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%。

催化合成新科斯糖的酶是6G-果糖苷酶，研究表明[11]，底物濃度、底物pH、接種量、酶處理溫度和時(shí)間等單因素對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn)化和生成新科斯糖均有影響，溫度對(duì)6G-果糖苷酶產(chǎn)新科斯糖的現(xiàn)象與胞外半乳糖酶的類似[12]；過(guò)高的接種量使黏度增加，不利于酵母呼吸，抑制酵母生長(zhǎng)[13-16]；6G-果糖苷酶既有果糖基轉(zhuǎn)移作用又有水解作用，蔗糖濃度增加，水分活度降低，水解作用減弱，果糖基轉(zhuǎn)移作用增強(qiáng)，新科斯糖產(chǎn)量升高，但蔗糖增加，新科斯糖產(chǎn)率下降[17]；磷酸鹽和檸檬酸鹽對(duì)法夫酵母的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

目前新科斯糖的生產(chǎn)都采用微生物法，微生物法又可以分為酶法和全細(xì)胞法。由于游離全細(xì)胞可以避免固定化導(dǎo)致的酶活損失，且與固定化細(xì)胞相比，在產(chǎn)糖過(guò)程中糖的轉(zhuǎn)化不受質(zhì)量轉(zhuǎn)移限制，因此顯示了較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

金屬離子參與多種生化反應(yīng)[18-19]，可使底物結(jié)合到酶的活性部位，也可間接使酶的活性部位保持在易結(jié)合底物的構(gòu)象。金屬離子直接影響酶的活性，進(jìn)而影響發(fā)酵生物量，最終影響目標(biāo)產(chǎn)物的積累量。

真菌誘導(dǎo)子(fungal elicitor)是一類能誘導(dǎo)植物和微生物產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)，它一經(jīng)識(shí)別，將通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑中相關(guān)酶的活性，誘導(dǎo)特定次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。Wang等[20]研究表明真菌誘導(dǎo)子對(duì)法夫酵母生長(zhǎng)和類胡蘿卜素合成有一定影響。本文以此為依據(jù)，考察不同生物和化學(xué)誘導(dǎo)子對(duì)法夫酵母生長(zhǎng)和新科斯糖合成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

法夫酵母：購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

法夫酵母種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨0.5%，pH 7。

法夫酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，硫酸銨0.7%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0.03%，酵母粉0.2%，YNB 0.1%，pH 7。

生物誘導(dǎo)子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，氯化銨1%，磷酸二氫鉀0.4%，磷酸二氫鈉0.1%，硫酸鎂0.2%，pH 5。

1.3 真菌誘導(dǎo)子的制備

靈芝、平菇、秀珍菇、茶樹菇培養(yǎng)7 d后，分別收集20 g濕菌體，用蒸餾水、0.1 mol/L和0.5 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)分別洗滌3次，超聲破碎細(xì)胞，離心(4000 r/min，5 min)收集沉淀，用0.5 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌沉淀3次，重懸于蒸餾水中，121 ℃，20 min高壓蒸汽滅菌后，于-20 ℃保存。

1.4 化學(xué)誘導(dǎo)子的制備

金屬離子、硝酸鈰、氯化鎘、茉莉酸甲酯配成一定濃度備用。

1.5 細(xì)胞的制備

將法夫酵母接種于裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h作為種子液。然后以10%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，恒定pH 7.0，30 ℃下發(fā)酵 72 h，將菌體細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌2次，3000 g，10 min離心收集濕細(xì)胞。

1.6 新科斯糖的制備

將濕細(xì)胞加入1 L蔗糖溶液中，置于搖床中25 ℃，細(xì)胞濃度100 g/L，蔗糖濃度400 g/L，150 r/min振蕩反應(yīng) 6 h。反應(yīng)液于10000 g離心10 min，收集上清液，測(cè)定新科斯糖的產(chǎn)量。

1.7 法夫酵母生物量的測(cè)定

取5 mL菌液離心(4000 r/min，5 min)后用蒸餾水洗滌3次，在60 ℃烘箱中烘干至恒重后稱重。

1.8 新科斯糖含量的測(cè)定

采用HPLC分析上清液，條件為色譜柱：安捷倫5NH2-MS(4.6 mm×250 mm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：乙腈∶水為75∶25；流速：1 mL/min；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

在法夫酵母生長(zhǎng)和新科斯糖積累階段分別在培養(yǎng)基中添加不同真菌、化學(xué)誘導(dǎo)子，研究它們對(duì)法夫酵母生長(zhǎng)和新科斯糖合成的影響。

2.1 生物誘導(dǎo)子對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

2.1.1 靈芝添加量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

由圖1可知，添加靈芝作為真菌誘導(dǎo)子時(shí)，對(duì)法夫酵母生物量和新科斯糖積累量有一定的影響，當(dāng)靈芝添加量為10 mg/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值13.90 g/L，提高了12.50%；當(dāng)靈芝添加量大于或小于10 mg/L時(shí)，對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用并不明顯；當(dāng)靈芝添加量小于10 mg/L時(shí)，新科斯糖積累量逐漸升高；當(dāng)靈芝添加量為10 mg/L時(shí)，新科斯糖積累量達(dá)到219.23 g/L；相比對(duì)照組提高了11.85%；當(dāng)靈芝添加量大于10 mg/L時(shí)，新科斯糖積累量逐漸降低，可見誘導(dǎo)體系中靈芝作為真菌誘導(dǎo)子存在最適質(zhì)量濃度。

圖1 靈芝對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響Fig.1 The effect of Ganoderma lucidum on the biomass and neokestose accumulation

2.1.2 平菇添加量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

圖2 平菇對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖2可知，添加平菇作為真菌誘導(dǎo)子時(shí)，隨著平菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當(dāng)平菇添加量為20 mg/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值13.48 g/L，相比對(duì)照組提高了12.11%，然后生物量略有降低，但變化不大；隨著平菇添加量的增加，新科斯糖的積累量逐漸升高，當(dāng)平菇添加量為30 mg/L時(shí)，新科斯糖的積累量達(dá)到最大值224.56 g/L，相比對(duì)照組提高了15.08%，然后隨著濃度的繼續(xù)增加，新科斯糖的積累量降低，可見過(guò)高的質(zhì)量濃度反而影響了新科斯糖的合成。

2.1.3 秀珍菇添加量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

圖3 秀珍菇對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖3可知，添加秀珍菇作為真菌誘導(dǎo)子時(shí)，隨著秀珍菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當(dāng)秀珍菇添加量為5 mg/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值12.03 g/L，相比對(duì)照組提高了7.81%，雖然生物量有所增加，但是增加并不明顯，可見秀珍菇作為真菌誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用有限；但隨著秀珍菇添加量的增加，新科斯糖的積累量逐漸升高，當(dāng)秀珍菇添加量為10 mg/L時(shí)，新科斯糖積累量達(dá)到最大值232.70 g/L，相比對(duì)照組提高了19.03 %，然后隨著濃度的繼續(xù)增加，新科斯糖的積累量降低。

2.1.4 茶樹菇添加量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

圖4 茶樹菇對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖4可知，添加茶樹菇作為真菌誘導(dǎo)子時(shí)，隨著茶樹菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當(dāng)荼樹菇添加量為10 mg/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值12.06 g/L，相比對(duì)照組提高了7.99%；隨著茶樹菇添加量的增加，新科斯糖的積累量逐漸升高，當(dāng)茶樹菇添加量為20 mg/L時(shí)，新科斯糖的積累量達(dá)到最大值215.59 g/L，相比對(duì)照組提高了9.87%，然后隨著濃度的繼續(xù)增加，新科斯糖的積累量降低，相比其他真菌誘導(dǎo)子，茶樹菇對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和新科斯糖的積累都沒有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 化學(xué)誘導(dǎo)子對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

2.2.1 金屬離子對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

將2 mg/L的金屬離子分別添加到細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程和新科斯糖的積累過(guò)程中，其結(jié)果見圖5。

圖5 金屬離子對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖5可知，在培養(yǎng)基中添加Zn2+和Mn2+能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，法夫酵母生物量分別提高了26.71%和16.71%，添加K+、Ca2+、Al3+和Mg2+對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用并不明顯，添加Ag+離子后細(xì)胞生物量降低，可見酵母對(duì)重金屬Ag+離子的吸附作用抑制了其生長(zhǎng)。在新科斯糖積累過(guò)程中，Mg2+和Zn2+的作用最為明顯，新科斯糖積累量分別增加了8.49%和5.95%，可見Mg2+和Zn2+作為多種酶的激活劑，可顯著提高法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性，而其他金屬離子提高果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的作用并不明顯。

2.2.2 硝酸鈰添加量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

由圖6可知，添加硝酸鈰作為化學(xué)誘導(dǎo)子時(shí)，隨著硝酸鈰添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸降低，可見添加硝酸鈰會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而在新科斯糖積累過(guò)程中，當(dāng)硝酸鈰添加量為0.16 mg/L時(shí)，新科斯糖積累量最高，為211.23 g/L，相比對(duì)照組提高了9.97%，然后隨著硝酸鈰濃度的增加，新科斯糖的積累量顯著降低，可見硝酸鈰在添加量小于0.16 mg/L時(shí)，可以增強(qiáng)果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，當(dāng)濃度升高時(shí)，會(huì)抑制酶的活性。

圖6 硝酸鈰對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響

2.2.3 氯化鎘添加量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

圖7 氯化鎘對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖7可知，添加氯化鎘作為化學(xué)誘導(dǎo)子時(shí)，隨著氯化鎘添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸降低，可見添加氯化鎘會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而在新科斯糖積累過(guò)程中，當(dāng)氯化鎘添加量為0.12 mg/L時(shí)，新科斯糖的積累量最高，為218.72 g/L，相比對(duì)照組提高了14.08%，然后隨著氯化鎘濃度的增加，新科斯糖的積累量顯著降低，可見氯化鎘在添加量小于0.16 mg/L時(shí)，可以增強(qiáng)果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，當(dāng)濃度升高時(shí)，會(huì)抑制酶的活性。

2.2.4 茉莉酸甲酯添加量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

圖8 茉莉酸甲酯對(duì)生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖8可知，添加茉莉酸甲酯作為化學(xué)誘導(dǎo)子時(shí)，隨著茉莉酸甲酯添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當(dāng)茉莉酸甲酯添加量為0.08 mg/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值12.62 g/L，相比對(duì)照組提高了12.12%；在新科斯糖積累過(guò)程中，當(dāng)茉莉酸甲酯添加量為0.08 mg/L時(shí)，新科斯糖的積累量最高，為202.13 g/L，相比對(duì)照組提高了5.91%。

3 結(jié)論與討論

供試真菌誘導(dǎo)子對(duì)法夫酵母新科斯糖積累均有一定的促進(jìn)作用，靈芝、平菇、秀珍菇和茶樹菇制備的誘導(dǎo)子分別在添加濃度為10，20，5，10 mg/L時(shí)法夫酵母生物量最高，分別比對(duì)照提高了12.50%、12.11%、7.81%和7.99%；靈芝、平菇、秀珍菇和茶樹菇制備的誘導(dǎo)子分別在添加濃度為10，30，10，20 mg/L時(shí)新科斯糖含量最高，分別比對(duì)照提高了11.85%、15.08%、19.03%和9.87%?？梢?，在最佳濃度下，靈芝和平菇對(duì)法夫酵母細(xì)胞生長(zhǎng)比較有利，平菇和秀珍菇對(duì)新科斯糖的積累比較有利，推測(cè)真菌能夠促進(jìn)新科斯糖的生物合成是由于誘導(dǎo)子中含有促進(jìn)法夫酵母類生長(zhǎng)和新科斯糖合成的因子，它們能夠產(chǎn)生一些特殊的酶系而可利用木質(zhì)素生長(zhǎng)，但其機(jī)理尚不明確，還需要進(jìn)一步探究分析。

供試化學(xué)誘導(dǎo)子均有利于新科斯糖的積累，2 mg/L的Mn2+和Zn2+能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，法夫酵母的生物量分別提高了26.71%和16.71%，新科斯糖的積累量增加了9.56%和5.18%。

添加硝酸鈰和氯化鎘后，均會(huì)抑制法夫酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，可見硝酸鈰和氯化鎘對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的毒性，添加茉莉酸甲酯后，在最佳濃度0.08 mg/L下，生物量比對(duì)照組提高了12.12%，硝酸鈰、氯化鎘和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子在添加濃度為0.16，0.12，0.08 mg/L時(shí)，新科斯糖的積累量最高，分別比對(duì)照提高了9.97%、14.08%和5.91%，推測(cè)低濃度的硝酸鈰和氯化鎘能夠與影響法夫酵母中果糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的某些蛋白相互作用，其機(jī)理還需要進(jìn)一步研究，茉莉酸甲酯本身具有誘導(dǎo)作用，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和新科斯糖的積累。

綜上所述，生物誘導(dǎo)子能促進(jìn)法夫酵母的生長(zhǎng)，從而顯著提高新科斯糖的產(chǎn)量?；瘜W(xué)誘導(dǎo)子對(duì)生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)或抑制作用，但均可以提高新科斯糖的積累量。