陳鏡如，邊鑫,楊楊,邢童林，王子軒，任麗琨，胡良術(shù)，何林陽(yáng)，張娜

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江省谷物食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

發(fā)酵是一種用于改善食品品質(zhì)和長(zhǎng)期保存食品的加工手段[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品通常憑借自然野生菌落發(fā)酵為主要生產(chǎn)方式。在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)通常會(huì)引入來(lái)自于原料和環(huán)境的多種微生物，而這些微生物可利用原料中的營(yíng)養(yǎng)成分通過(guò)三大代謝途徑——糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝改變食物本身的質(zhì)地及食用品質(zhì)，產(chǎn)生獨(dú)特的發(fā)酵香氣[2]。在我國(guó)幾千年的歷史進(jìn)程中，開(kāi)發(fā)了原料多樣、工藝復(fù)雜、種類(lèi)繁多的傳統(tǒng)發(fā)酵食品如發(fā)酵酒、酸菜、大醬、臘肉等，構(gòu)成了我國(guó)飲食文化重要的組成部分。由于在自然發(fā)酵的過(guò)程中微生物種類(lèi)和豐度存在差異，而且常伴有有害菌或致病菌的引入，這會(huì)嚴(yán)重影響傳統(tǒng)發(fā)酵食品的感官品質(zhì)、風(fēng)味和食用安全性[3]。因此，揭示傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物多樣性，探究菌群結(jié)構(gòu)和發(fā)酵過(guò)程中的核心微生物對(duì)科學(xué)安全地制作、調(diào)控發(fā)酵食品有著重要的指導(dǎo)作用，為傳統(tǒng)食品的發(fā)酵過(guò)程工業(yè)化、規(guī)?；⒎€(wěn)定安全化提供了理論基礎(chǔ)。本文重點(diǎn)綜述了現(xiàn)代高通量檢測(cè)方法，對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物特殊的多樣性結(jié)構(gòu)和主要核心作用微生物、中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的前景導(dǎo)向進(jìn)行了展望，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的加工工藝改良和品質(zhì)調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。

1 中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性研究方法

由于傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)方式所涉及到的微生物來(lái)源廣、種類(lèi)多、演替演化規(guī)律復(fù)雜，僅單純依靠傳統(tǒng)人工分離方法不能滿(mǎn)足當(dāng)下人們對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中復(fù)雜微生物系統(tǒng)的了解。近些年，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代測(cè)序技術(shù)正逐漸取代傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，廣泛應(yīng)用于微生物多樣性的分析。這些新一代測(cè)序技術(shù)一類(lèi)是擴(kuò)增子測(cè)序，例如一代測(cè)序：變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)；二代高通量測(cè)序：16S rDNA、ITS測(cè)序等;三代測(cè)序：16S rDNA全長(zhǎng)、宏基因組技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)每一條獨(dú)立的DNA分子進(jìn)行測(cè)序，從而分析得到微生物的物種注釋及代謝通路信息。這些技術(shù)在發(fā)酵酒肉制品、谷物食品等鑒定中都有廣泛的應(yīng)用[4]。

1.1 PCR-DGGE技術(shù)

傳統(tǒng)的平板分離培養(yǎng)方法過(guò)度依賴(lài)人工的操作及菌體的生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不確定性大。PCR-DGGE技術(shù)避開(kāi)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的弊端，采用特異性PCR擴(kuò)增從樣本中提取出來(lái)的基因組DNA，在DGGE技術(shù)有效分離和快速鑒定后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析從而獲取到樣品中菌群圖譜[5]。燕平梅等利用PCR-DGGE技術(shù)在不同品種酸菜樣品中檢測(cè)到8種微生物，而散裝酸菜的微生物多樣性更為豐富，同時(shí)，在經(jīng)16S rDNA測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)乳酸菌屬為酸菜中的核心微生物[6]。與傳統(tǒng)的測(cè)序方法對(duì)比，PCR-DGGE技術(shù)在對(duì)傳統(tǒng)方法未能培養(yǎng)出來(lái)的菌株進(jìn)行鑒定時(shí)，用時(shí)更短，準(zhǔn)確度更高，并可對(duì)大量樣本同時(shí)進(jìn)行測(cè)序工作，是研究發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)最常用的分子生物技術(shù)之一[7]。但該技術(shù)具有一定的局限性，當(dāng)對(duì)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究時(shí)，對(duì)豐度較低(低于1%)的微生物無(wú)法檢測(cè)出來(lái)[8]。

1.2 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)是基于高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)特定環(huán)境下的微生物，并結(jié)合生物與信息學(xué)來(lái)分析樣本中各種微生物物種種類(lèi)、物種豐度、種群結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)演變等相關(guān)信息。根據(jù)細(xì)菌和真菌間的序列差異，高通量測(cè)序可以化分為16S rDNA、18S rDNA和ITS測(cè)序。16S rDNA主要進(jìn)行原核微生物的物種鑒定，而18S rDNA和ITS測(cè)序主要用于真核微生物的鑒定。不同測(cè)定方法的檢測(cè)區(qū)域及主要目的見(jiàn)表1[9]。

表1 不同微生物多樣性測(cè)序方法功能對(duì)比

相比PCR-DGGE技術(shù)，高通量測(cè)序通過(guò)獲得大量測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)，能夠?qū)ωS度低于0.0001%的痕量菌準(zhǔn)確檢出，從而系統(tǒng)完整地解析樣品中微生物菌相組成。李欣蔚等通過(guò)16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)自然發(fā)酵酸菜樣品中的多樣性組成進(jìn)行了分析，與PCR-DGGE技術(shù)測(cè)定結(jié)果相吻合，證實(shí)了高通量測(cè)序的準(zhǔn)確性[10]。在真菌鑒定方面主要有ITS測(cè)序技術(shù)和18S rDNA技術(shù)兩種，18S rDNA雖然能有效地鑒定出真核微生物的存在并進(jìn)行物種注釋?zhuān)錅?zhǔn)確度往往較低，在實(shí)際測(cè)序中常有部分真菌不能被分類(lèi)。ITS測(cè)序技術(shù)較18S rDNA技術(shù)測(cè)序的準(zhǔn)確度更高，對(duì)真菌微生物的鑒定能力更強(qiáng)。然而，高通量測(cè)序技術(shù)由于針對(duì)局部DNA區(qū)域的鑒定，因此，只能完成微生物屬水平鑒定。隨著三代測(cè)序的蓬勃發(fā)展，全長(zhǎng)高通量序列測(cè)定可以彌補(bǔ)微生物在種水平鑒定上的空白。曹碧璇等利用16S rDNA基因全長(zhǎng)序列分析鑒定出自然發(fā)酵酸菜液樣品中有7個(gè)細(xì)菌菌屬及9個(gè)菌種，實(shí)現(xiàn)了微生物多樣性在種水平上的解析[11]。高通量測(cè)序是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序的革新式改變，也是目前最常見(jiàn)的測(cè)序方法，成本低廉，且令對(duì)發(fā)酵食品全部基因的深入分析成為可能。

1.3 宏基因組技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)促進(jìn)了組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相較于高通量測(cè)序，宏基因組基于對(duì)現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，其優(yōu)勢(shì)在于不僅可以準(zhǔn)確地對(duì)樣品進(jìn)行物種注釋?zhuān)铱梢赃M(jìn)行功能注釋?zhuān)诰虿糠治⑸锏墓δ芑驅(qū)ζ浯x途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)，這為開(kāi)發(fā)利用未知或未被培養(yǎng)的微生物、全面探究微生物基因功能性提供了研究基礎(chǔ)[12]。彭明芳等利用基因組技術(shù)對(duì)廣西酸菜進(jìn)行功能注釋?zhuān)Y(jié)果共注釋到17種在碳水化合物和氨基酸代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)功能上豐富的基因，如纖維素酶、果膠酶、淀粉水解酶和酯酶等，預(yù)測(cè)了微生物在酸菜發(fā)酵過(guò)程中可能發(fā)揮的作用[13]。Guo等利用宏基因組技術(shù)在白酒窖泥中發(fā)現(xiàn)了乳酸菌、芽孢桿菌和梭菌等細(xì)菌與乳酸、乙酸等有機(jī)酸及乙醇、酯類(lèi)等風(fēng)味化合物產(chǎn)生有關(guān)，而半乳酵母、青霉菌和曲霉菌等真菌微生物在白酒發(fā)酵中可以產(chǎn)生葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，這對(duì)糖酵解過(guò)程影響顯著并可將淀粉等大分子物質(zhì)降解為小分子糖[14]，但宏基因組測(cè)序?qū)?shù)據(jù)處理核心技術(shù)的要求極高，當(dāng)樣本數(shù)量極大時(shí)，需要進(jìn)行多次測(cè)序，且宏基因組測(cè)序方法的定義和算法還不完善，是目前微生物學(xué)家面臨的一大難題。

目前對(duì)于研究發(fā)酵食品常用的測(cè)序方法如上所述，不同的方法各有特點(diǎn)，比如PCR-DGGE技術(shù)的高效快速，高通量測(cè)序技術(shù)的精準(zhǔn)分析，基因組技術(shù)的功能基因注釋。在實(shí)際的應(yīng)用選擇中，要結(jié)合樣品的狀態(tài)、測(cè)序的目的、預(yù)期的深度以及性?xún)r(jià)比進(jìn)行合理選擇。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性及核心微生物研究進(jìn)展

近些年來(lái)，學(xué)者們對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物多樣性展開(kāi)了研究，產(chǎn)品主要涉及7大類(lèi)，分別為發(fā)酵谷物類(lèi)、豆類(lèi)、乳類(lèi)、蔬菜類(lèi)、肉類(lèi)、酸面團(tuán)類(lèi)和其他。每一類(lèi)都包含許多具有代表性的發(fā)酵食品，具體產(chǎn)品分類(lèi)見(jiàn)表2。本部分內(nèi)容針對(duì)上述類(lèi)別的中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性研究進(jìn)行了綜述。

表2 中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品分類(lèi)及代表產(chǎn)地

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品

中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品主要分為兩類(lèi)，分別是酸奶和奶酪，在新疆、內(nèi)蒙古、西藏等地有著深遠(yuǎn)的制作歷史。這些發(fā)酵乳制品的品質(zhì)往往因?yàn)榈乩憝h(huán)境因素以及人為因素而呈現(xiàn)出微生物菌群組成上的差異，見(jiàn)表3。中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的微生物組成復(fù)雜多樣，不同地域的微生物組成各有特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品微生物多樣性的解析，不僅可以更好地對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行調(diào)控還對(duì)乳制品同質(zhì)化以及有效溯源體制的建立有著重要的指導(dǎo)意義。

表3 不同產(chǎn)地發(fā)酵乳樣品微生物多樣性組成對(duì)比Table 3 The comparison of microbial diversity composition of fermented milk samples from different producing areas

2.2 傳統(tǒng)發(fā)酵谷物制品

2.2.1 發(fā)酵酒類(lèi)制品

我國(guó)的酒文化歷史深遠(yuǎn)，釀酒工藝傳承了幾千年，其中在釀酒過(guò)程中，發(fā)酵是一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。中國(guó)發(fā)酵酒要經(jīng)過(guò)獨(dú)特而復(fù)雜的系統(tǒng)發(fā)酵，由于原料不同，酒曲不同及發(fā)酵工藝不同等，衍生出不同種類(lèi)的發(fā)酵酒，其中最具代表性的是白酒、黃酒及米酒。大量研究發(fā)現(xiàn)不同酒曲的微生物菌群結(jié)構(gòu)差異較大，賦予了白酒和黃酒不同種香型，如清爽型、鳳香型、濃香型、芝麻香型等，見(jiàn)表4。

表4 不同香型發(fā)酵酒類(lèi)微生物多樣性

此外，學(xué)者們還對(duì)部分酒曲的白酒以及不同原料的黃酒和米酒中的微生物多樣性進(jìn)行了分析，其他酒曲的白酒及不同原料的黃酒和米酒中微生物種類(lèi)和核心微生物的情況見(jiàn)表5。運(yùn)用測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵酒微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析可以更好地區(qū)分不同種類(lèi)的酒以及工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)酒。

表5 不同酒曲及原料發(fā)酵酒類(lèi)微生物多樣性[24-30]Table 5 The microbial diversity of fermented wines with different kojis and raw materials

續(xù) 表

2.2.2 發(fā)酵醋制品

食醋在我們?nèi)粘＿M(jìn)行食物加工過(guò)程中是必備的酸性調(diào)味品之一。中國(guó)傳統(tǒng)醋的生產(chǎn)有固態(tài)、液態(tài)及靜態(tài)表面發(fā)酵之分。液態(tài)發(fā)酵具有更高的醋酸產(chǎn)量、更短的發(fā)酵時(shí)間和更低的成本，而固態(tài)發(fā)酵釀造的醋具有獨(dú)特的風(fēng)味和口感。其中差異來(lái)自于不同發(fā)酵方式下微生物菌群結(jié)構(gòu)與演替規(guī)律的差異。Jiang等對(duì)液態(tài)發(fā)酵制成的紅曲醋的微生物多樣性進(jìn)行了測(cè)定，共鑒定出10個(gè)細(xì)菌屬和13個(gè)真菌屬，其中乙酰耐受乳桿菌為紅曲霉醋的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，嗜鹽梗孢酵母為優(yōu)勢(shì)真菌屬[31]。聶志強(qiáng)等對(duì)天津老醋的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)乳酸菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，為固態(tài)發(fā)酵醋的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，但隨發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行，醋酸菌屬豐度也在逐漸升高，是重要的酸性產(chǎn)物代謝菌[32]。通過(guò)發(fā)酵醋制品菌群結(jié)構(gòu)的解析及其對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的影響分析，可以獲得用于發(fā)酵醋的優(yōu)良菌株，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)和風(fēng)味品質(zhì)的調(diào)控。

2.2.3 發(fā)酵豆制品

發(fā)酵豆制品往往以大豆為原料，在不同制作工序及菌群結(jié)構(gòu)的作用下成為不同的產(chǎn)品。不同發(fā)酵豆類(lèi)制品在原料、發(fā)酵時(shí)間以及發(fā)酵工藝上微生物存在的差異見(jiàn)表6。

表6 不同發(fā)酵豆類(lèi)制品核心微生物及其功能[33-37]Table 6 The core microorganisms in different fermented bean products and their functions

續(xù) 表

2.3 傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品

發(fā)酵是一種古老而廣泛使用的用來(lái)保存新鮮蔬菜的加工技術(shù)，如東北的酸菜、四川的泡菜和廣西的酸筍等。這些發(fā)酵蔬菜常因?yàn)榈乩韰^(qū)域與原材料的不同，經(jīng)不同發(fā)酵工藝而有著不同的菌落結(jié)構(gòu)，見(jiàn)表7。乳酸菌在大多數(shù)發(fā)酵蔬菜制品中廣泛存在，并起著關(guān)鍵的代謝作用和重要的功能性，許多研究也證實(shí)了乳酸菌在發(fā)酵蔬菜過(guò)程中產(chǎn)酸，形成醇、酯、醛等基礎(chǔ)風(fēng)味，抑制腐敗，延長(zhǎng)貨架期等[38]。

表7 常見(jiàn)發(fā)酵蔬菜優(yōu)勢(shì)微生物種類(lèi)[39-42]Table 7 The dominant microbial species of common fermented vegetables

2.4 傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)、肉制品

傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品通常采用較高濃度的鹽對(duì)原料進(jìn)行腌制發(fā)酵，不同地區(qū)的發(fā)酵肉制品因原料、產(chǎn)地以及工藝的不同，微生物組成上存在著明顯的差異。如浙江金華火腿的核心發(fā)酵菌屬為乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬等[43]，而云南宣威火腿多為孢囊放線菌屬、乳酸桿菌、棒狀桿菌屬、小單孢菌屬、鏈霉菌，這些微生物菌群結(jié)構(gòu)上的不同主要來(lái)源于樣品產(chǎn)地的差別[44]。此外，原料的不同造成了發(fā)酵肉制品微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異性并發(fā)揮著不同的功能，見(jiàn)表8。

表8 不同發(fā)酵肉制品主要核心微生物及功能[45-46]Table 8 The main core microorganisms and functions of different fermented meat products

2.5 傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)

中國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)制品主要以饅頭為主，傳統(tǒng)饅頭的制作大多以酵子為發(fā)酵劑。研究發(fā)現(xiàn)，酵子的來(lái)源決定了其微生物組成。楊可等發(fā)現(xiàn)關(guān)中不同地區(qū)的饅頭酵子中優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳酸菌屬，但不同地區(qū)的微生物組成差異較大。傳統(tǒng)酵子饅頭往往風(fēng)味之間存在差異，這也與酵子中微生物的組成和代謝有著密切聯(lián)系[47]。Suo等利用高通量測(cè)序方法研究了中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵的饅頭的微生物多樣性及風(fēng)味成分，結(jié)果顯示以乳酸桿菌和片球菌為主的優(yōu)勢(shì)菌屬在呈味方面發(fā)揮著重要的作用[48]。馬凱等在對(duì)傳統(tǒng)酵子細(xì)菌多樣性的研究中進(jìn)一步確定了乳酸菌中以魏斯氏菌屬與乳酸乳桿菌屬為主的優(yōu)勢(shì)地位，并明確與商業(yè)酵母相比，醇類(lèi)化合物的含量和種類(lèi)是區(qū)分傳統(tǒng)酵子發(fā)酵饅頭與商業(yè)酵母的關(guān)鍵[49]。

此外，學(xué)者們還對(duì)發(fā)酵茶如普洱茶、黑茶等[50-51]傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性進(jìn)行了研究，為提高產(chǎn)品加工效益和食用品質(zhì)提供了理論參考。

3 展望

中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類(lèi)多，微生物多樣性豐富，大多數(shù)仍停留在作坊式、家庭式的制作模式中，只有極少數(shù)發(fā)酵制品實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化發(fā)展。這就使我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品存在工藝缺乏創(chuàng)新、制作周期冗長(zhǎng)、安全穩(wěn)定性較差等原始問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化發(fā)展。未來(lái)我們不僅需要全面了解傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的菌群結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵微生物信息，還需要深入了解發(fā)酵過(guò)程中與風(fēng)味或品質(zhì)有關(guān)的功能性微生物的作用，對(duì)其發(fā)酵機(jī)理進(jìn)行挖掘，獲得發(fā)酵性能優(yōu)良的菌種，建立發(fā)酵食品菌種保藏庫(kù)，以期為人為調(diào)控中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵過(guò)程，使中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化、安全化生產(chǎn)。