固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明和酚酞

張志剛，鄭向華，陳燕，吳敏，林建忠，徐敦明，林立毅

（廈門海關技術中心，福建廈門 361013）

隨著社會的發(fā)展，人們生活水平不斷提高，因飲食高脂肪、高蛋白引起肥胖的人群越來越多。由肥胖導致的心腦血管疾病對身體健康構成了極大的危險，因此人們對減肥的需求日益增高。近年來，一些不良商家為了牟取暴利，以日常食品為載體，非法添加麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明或酚酞后，大肆宣稱其具有較好的減肥功效，以欺騙消費者。麻黃堿是一類中樞興奮藥［1］，能增加消耗能量，但服用后容易產(chǎn)生焦慮、興奮、失眠等不良反應；芬氟拉明、西布曲明屬于中樞神經(jīng)抑制劑，可抑制食欲，前者不良反應易引起成癮性、肺部高血壓等［2］，后者不良反應如肢體痙攣、思維異常、癲癇發(fā)作等［3］；酚酞屬于接觸性輕瀉藥，長期服用會誘發(fā)頑固性便秘、結腸炎、流產(chǎn)、大出血、腸癌等疾?。?-5］。由于這些藥物有嚴重副作用，因此已被多數(shù)國家撤銷或禁止，消費者在不知情的情況下長期食用添加違禁藥物的食品，將會對健康造成威脅。

2021 年市場監(jiān)管總局將嚴查非法添加非食用物質(zhì)和藥品的違法行為列入民生領域案件查辦“鐵拳”行動中，并在5 月27 日公布了第二批2021 年民生領域案件查辦“鐵拳”行動的典型案例，其中“網(wǎng)紅”減肥糖果非法添加西布曲明的有毒有害食品案引人關注［6］，因此建立食品中違禁添加藥物準確、快速的檢測方法勢在必行。

目前用于麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明、酚酞的檢測方法主要有薄層色譜法［7］、分光光度法［8-9］、毛細管電泳法［10］、高效液相色譜法［11-12］、離子遷移譜法［14］、氣相色譜-質(zhì)譜法［15-16］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［17-20］，分析的基質(zhì)主要集中在保健品［13］、功能或保健食品［14-17］上，普通食品鮮有報道［21］，尚未有食品中麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明和酚酞同時檢測的報道。筆者采用固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，以食品為研究對象，通過優(yōu)化檢測條件，建立了同時定量測定食品中麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明和酚酞的方法，并進行系統(tǒng)的方法學考察和實際樣品分析。該方法具有快速、靈敏、準確度高等特點，可實現(xiàn)食品中非法添加物麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明和酚酞的高快速測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 6470 型，配有電噴霧離子源，美國安捷倫科技有限公司。

固相萃取儀：57044 型，美國色譜科公司。

旋渦振蕩器：MS5 型，德國IKA 公司。

電子天平：PL403-IC 型，感量為0.01 g，瑞士梅特勒-托利多集團。

離心機：TGL-16G 型，上海安亭科學儀器廠。

全自動氮吹濃縮儀：Turbo Vap LV 型，美國Capiler LifeSciences 公司。

甲醇中的麻黃堿、酚酞、芬氟拉明、西布曲明標準溶液：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，CAS 號分別為50-98-6、77-09-8、458-24-2、125494-59-9，美國A ChemTek 公司。

固相萃取柱：Oasis HLB 型，3 mL/(60 mg)，美國沃特世公司。

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，德國默克公司。

樣品：共200 批次，分別購于當?shù)爻小⑸虉龊途W(wǎng)商，樣品類型有餅干、糕點、糖果、果凍、代用茶、代餐粉、蜜餞類、酵素類固體飲料等。實驗所用其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準儲備液

分別準確移取麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明、酚酞4 種化學藥物標準溶液各1.00 mL，均用甲醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL 的4種化學藥物的標準儲備液，置于-20 ℃條件下避光儲存。

1.2.2 混合標準中間液

分別準確移取1.00 mL 麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明、酚酞標準儲備液至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標線，配制成1.0 μg/mL 的混合標準中間液。

1.2.3 系列混合標準工作溶液

采用流動相（0.2 %甲酸水-甲醇）采用逐級稀釋的方法，配制成4 種化學藥物的質(zhì)量濃度均分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL 的系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

準確稱取2 g（精確至0.01 g）樣品，置于50 mL 離心管中，準確加入10 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液，渦旋振蕩1 min，超聲15 min，冷卻至室溫，以5 000 r/min 的轉速離心10 min，準確移取5 mL 上清液，待凈化。

1.3.2 凈化

分別采用3 mL 甲醇、3 mL 水對Oasis HLB 固相萃取柱進行活化，再將1.3.1 中待凈化的上清液轉移至活化后的固相萃取柱中，上樣后，用3 mL 10 mmol/L 的鹽酸溶液淋洗，抽至近干后，用9 mL 4%氨水甲醇（體積比）溶液分3 次洗脫。將洗脫液收集于10 mL 試管中，在40 ℃下氮吹濃縮至近干，用0.2%甲酸水溶液定容至1 mL，渦旋混勻后，過0.22 μm 微孔濾膜，供測定。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜

色譜柱：Agilent Eclipse Plus 3 C18柱[150 mm×2.1 mm，1.8 μm，安捷倫科技(中國)有限公司]；柱溫：30 ℃；流量：0.5 mL/min；流動相：A 為0.2 %甲酸溶液，B 為甲醇；進樣體積：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧電離（ESI）源；毛細管電壓：3.5 kV；霧化氣壓力：310.3 kPa；噴嘴電壓：500 V；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：10 L/min；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流量：8 L/min；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；待測物的母離子、子離子及對應的碰撞能量、碎裂電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明、酚酞的質(zhì)譜檢測參數(shù)

2 結果與討論

2.1 流動相的優(yōu)化

分別采用甲醇水溶液、乙腈水溶液、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇，0.2%甲酸水-乙腈，0.2%甲酸水-甲醇等多種流動相體系進行色譜分析，分別考察待測物的分離效果、色譜峰形、峰高及響應情況。結果表明，選用甲醇水溶液、乙腈水溶液作為流動相時，待測物的峰形拖尾明顯；采用0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇作為流動相時，待測物峰形較好，但靈敏度較低；當0.2%甲酸水-乙腈或0.2%甲酸水-甲醇作為流動相時，各組分化學藥物的離子化效率高，分離度和峰型好，響應值高?？紤]到標準物質(zhì)是用甲醇稀釋配制的，為了保持分析體系溶劑的一致性，最終確定0.2%甲酸水-甲醇作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進樣，選擇［M+H］+對母離子進行調(diào)諧，分別對碎裂電壓、碰撞能量等條件進行優(yōu)化，質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。優(yōu)化后麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明、酚酞的參考保留時間分別為3.805、5.688、7.896、7.907 min，4 種化學藥物的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 4 種化合物多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖

2.3 提取溶劑的選擇

由于麻黃堿、西布曲明、芬氟拉明中有仲胺或叔胺基團，酚酞有酯基團，均屬于極性化合物，因此可以選擇極性比較強的有機溶劑，有機（無機）酸溶液或有機溶劑和水的混合溶液作為提取溶劑。通過添加回收試驗的方法，分別采用甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水、0.5%甲酸水、1%磷酸水、0.1 mol/L鹽酸水溶液作為提取溶劑，考察各溶劑的提取效率并進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，0.1 mol/L 鹽酸溶液對被測物的提取效率較高且穩(wěn)定，4 種化學藥物的回收率均能達到90%以上，因此選擇提取溶劑為0.1 mol/L鹽酸溶液。

2.4 固相萃取凈化的選擇

2.4.1 萃取柱

由于食品基質(zhì)復雜，在液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進行定量測定時，需要對樣品進行凈化以降低背景干擾，減少基質(zhì)效應，提高檢測結果的準確性。有文獻報道用強陽離子固相萃取柱（Oasis MCX）對保健食品［16］及尿液中［18］的麻黃堿進行凈化，但未見其它固相萃取柱應用于4 種被測物檢測的報道。分別考察C18、HLB、WCX 和MCX 4 種固相萃取小柱對被測組分的萃取效率，麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明、酚酞在4 種固相萃取小柱上回收率的比較見圖2。

圖2 4 種化合物在4 種固相萃取小柱上回收率比較

由圖2 可知，MCX 小柱對西布曲明和酚酞的萃取效率低，僅有50%左右；WCX 小柱對酚酞、芬氟拉明和麻黃堿3 種物質(zhì)的萃取效率低于60%；C18和HLB 小柱對4 種被測物的萃取效率均較高，萃取效率可達到85%以上，因為HLB 萃取小柱回收率更加穩(wěn)定，因此最終選擇HLB 作為固相萃取凈化柱。

2.4.2 洗脫液種類及其用量

采用空白添加的方式對不同的洗脫劑以及洗脫劑體積進行比較。根據(jù)化合物性質(zhì)，選擇極性溶劑分別為甲醇、乙酸乙酯、乙腈、4%氨水甲醇作為洗脫劑，結果表明，以4%氨水甲醇溶液作為洗脫劑時不僅洗脫效率高，且凈化效果好。還考察了洗脫劑用量的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)當洗脫劑體積大于9.0 mL時，回收率趨于平穩(wěn)（大于95%），因此選擇洗脫溶液為9.0 mL 4%氨水甲醇。

2.5 線性方程和檢出限

采用甲醇溶液將標準儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為2.00、5.00、10.0、20.0、50、100、200 μg/L 的系列混合標準工作溶液，采用優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件，進行HPLC-MS/MS 分析。以4 種化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標（x），定量離子對的色譜峰面積為縱坐標（y）繪制標準工作曲線。在不含目標化合物的陰性樣品中添加標準溶液，在1.4 儀器工作條件下，以3 倍的信噪比計算檢出限，10 倍的信噪比計算定量限。4 種化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限見表3。

表3 線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

由表3 可知，麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明、酚酞4 種化合物的質(zhì)量濃度在2.00～200 μg/L 范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性，線性相關系數(shù)均大于0.999，檢出限為2.5 μg/kg，定量限為8 μg/kg，表明該方法靈敏度較高。

2.6 回收率與精密度試驗

以不含4 種違法添加物的糖果、果凍、蜜餞、代用茶、固體飲料5 種基體為試驗對象，采用空白樣品添加標準溶液的方法，分別在1、2 和10 倍方法定量限水平進行加標回收試驗，按1.3 方法進行樣品前處理，在優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件下進行測定，每個添加水平平行測定6 次，測定結果見表4。由表4 可知，各組分化學藥物的加標回收率為71.0%～99.5%，測定結果的相對標準偏差為2.1%～8.2%，表明該方法具有良好的準確度和精密度，可以滿足日常檢測分析需求。

表4 回收率與精密度試驗結果（n=6）

2.7 實際樣品檢測

采用所建實驗方法對市售宣稱具有減肥功效的食品進行檢測，其中包括餅干、糕點、糖果、果凍、代用茶、代餐粉、蜜餞類、酵素類固體飲料等食品共計200 批次樣品。檢測結果顯示，在1 批次果蔬糖果的樣品中檢測出西布曲明，檢測值高達4.06×106μg/kg，其它樣品中均未檢測出4 種非法添加物。

3 結語

建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食品中麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明和酚酞4 種非法添加化學藥物的分析檢測方法。該方法前處理操作簡便，對不同食品基質(zhì)凈化效果好，靈敏度、準確度和精密度高，回收率穩(wěn)定，可為食品中非法添加化學藥物的檢測工作提供有力技術支持，為打擊食品中非法添加減肥類化學藥物行為提供有力依據(jù)，從而保證消費者的合法利益。