張 玉

（海南科技職業(yè)大學(xué)，海南 海口 571126）

引 言

食品工業(yè)技術(shù)水平的不斷提升，帶給人們種類繁多的食品和藥品，讓人們的物質(zhì)生活更加地富足，與此同時(shí)人們的生活也開始依賴這些食品和藥品，因此，人們也越來越重視產(chǎn)品的安全性[1]。最近幾年以來，國內(nèi)外關(guān)于食品安全和藥品安全的意外事件不斷發(fā)生，使人們更加關(guān)注產(chǎn)品的主要組成成分，如哪些藥品的組成是安全的，哪些是有害的，哪些食品的成分是完全無毒無害的[2]。如今，人們開始追求回歸自然和健康養(yǎng)生，對于純天然產(chǎn)物的需求不斷地增多，給自然產(chǎn)物市場帶來了商業(yè)化的改變。隨著人們對關(guān)注的重點(diǎn)話題的深入研究，人們開始意識到，目前的技術(shù)水平不足以支撐天然產(chǎn)物分析與檢測是制約該行業(yè)發(fā)展的主要因素之一，如何獲取先進(jìn)的處理技術(shù)直接關(guān)系到分析結(jié)果的優(yōu)劣[4]。超聲臨界萃取天然產(chǎn)物活性成分分析與研究可為天然產(chǎn)物的分析檢測提供代表性的樣品，為后期的研究提供有利的理論支持。

利用超聲臨界萃取法獲取天然產(chǎn)物的活性成分，是對天然產(chǎn)物提取和分離的過程[5]。農(nóng)藥是影響人類、環(huán)境和水系統(tǒng)健康的化合物，通過超聲臨界萃取法可以有效提取自然界中的農(nóng)藥殘留化學(xué)物質(zhì)，有效檢測和測定化合物的微量水平濃度[6]。超聲臨界萃取法是利用超聲波對天然產(chǎn)物的物理成分進(jìn)行分離，再利用特殊的超聲波模具實(shí)現(xiàn)對萃取物的提取。超聲波只能在均勻的介質(zhì)中才能實(shí)現(xiàn)定向地傳播，當(dāng)超聲波的頻率變高時(shí)，說明它的衍射能力逐漸變差[7]。采用超聲輔助提取技術(shù)，通過振蕩波的形式對天然產(chǎn)物的活性成分進(jìn)行分離，可以有效從天然原料中提取活性成分[8]。天然產(chǎn)物中的活性成分十分復(fù)雜，采用高效液相色譜法通過超聲波萃取天然產(chǎn)物活性成分并進(jìn)行分析研究[9]，對于超聲臨界萃取法在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

選擇臘梅鮮花作為實(shí)驗(yàn)材料，利用超聲臨界萃取法將臘梅鮮花中的活性物質(zhì)萃取出來。實(shí)驗(yàn)用的臘梅鮮花采摘于竹山縣，將采摘的鮮花清洗去雜，放在低溫的條件下保存，等待后期使用。

實(shí)驗(yàn)所用試劑：HCl 和H2SO4（分析純），化學(xué)科技(武漢)有限公司；苯酚、冰醋酸、氯仿、無水乙醇和三氯甲烷（均為分析純），瑞威爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

實(shí)驗(yàn)過程中使用的主要儀器設(shè)備如表1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備Table 1 The experimental instruments

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本的制備與處理

取出低溫條件下保存的臘梅鮮花，開始脫水處理，保持含水量為40%以下，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：壓力35MPa、萃取時(shí)間3.5h、溫度45℃，經(jīng)過超聲臨界萃取后獲取臘梅花干和初級精油。采取膜濃縮的方式對初級精油進(jìn)行蒸餾、分離等程序的二次加工，得到濃縮液、液態(tài)精油和固態(tài)精油。

當(dāng)完成超聲臨界萃取之后，迅速將臘梅花干取出來，攤放在一個(gè)平面上烘干處理，去除花干表面的水分磨碎處理[10]，放置在零下20℃的環(huán)境下儲存，準(zhǔn)備測試。

精油濃縮液處理：在萃取物中提取200mL 精油濃縮液，放入500mL 樣品瓶中，取200g 硫酸鈉固體放入樣品瓶中，在5℃的環(huán)境中靜置1d，將上層清液轉(zhuǎn)移到20mL 的萃取瓶中，密封保存在5℃的環(huán)境中，等待測試。

液態(tài)精油處理：將100μL 的液態(tài)精油放入20mL的萃取瓶中，與10mL 二氯甲烷漩渦處理30s，待兩者充分混合之后，密封保存[11]，放在5℃的環(huán)境中等待測試。

固態(tài)精油處理：將50g 固態(tài)精油放入濾筒中，將300mL 二氯甲烷與固態(tài)精油混合，并對其進(jìn)行提取，直到無色為止，將提取得到的混合液轉(zhuǎn)移到500mL的量瓶中，密封保存，在室溫環(huán)境下存放等待測試[12]。

1.3.2 超聲臨界萃取精油的活性成分分析

經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到三種臘梅精油的色譜條件，分別為：精油濃縮液色譜條件：總流量為6.3mL/min，分流比為2.0，以10℃/min 的速度將溫度升高到90℃，接著以3℃/min 的速度將溫度升高至110℃，5min后以相同速度將溫度升高至177℃，維持7min[13]。

液態(tài)精油色譜條件：30m×0.25mm×0.25μL 的色譜柱，進(jìn)樣方式和溫度分別為液體進(jìn)樣和230℃，總流量為14.5mL/min，分流比為11.0，以15℃/min的速度將溫度升高到70℃，接著以2℃/min 的速度將溫度升高到80℃，保持7min，再以1℃/min 的速度將溫度升高到84℃，持續(xù)1min，最后在10℃/min速度下，將溫度升高到160℃，保持2min[14]。

固態(tài)精油色譜條件：30m×0.25mm×0.25μL 的色譜柱，載氣選擇高純氦氣、流速為1mL/min，柱箱溫度40℃，進(jìn)樣方式和溫度分別為液體進(jìn)樣和230℃，總流量為19.9mL/min，分流比為15.5，以15℃/min的速度將溫度升高到120℃，再以1℃/min 的速度將溫度升高到146℃，保持4min，最后以3℃/min 的速度將溫度升高到270℃，保持10min[15]。

2 結(jié)果分析

2.1 蠟梅花干與鮮花基本化學(xué)成分的對比分析

利用超聲臨界萃取法，對臘梅花干的基本化學(xué)成分進(jìn)行萃取，并與鮮花的基本化學(xué)成分進(jìn)行對比，得到下表。

表2 臘梅花干與鮮花主要成分含量Table 2 The contents of main ingredients of the dried and the fresh flowers of chimonanthus praecox

由上表可以看出，臘梅花干與鮮花的基本化學(xué)成分進(jìn)行對比，除了都存在的灰分和粗纖維的占比有明顯的增高，其他的化學(xué)成分的占比都有所下降。其中，多酚的占比和下降比例最大，由14.96mg 下降至8.27mg，同比減少了44.71%；并且臘梅花干中的氨基酸也有明顯的下降，由138.71mg下降至81.25mg，同比減少了41.42%；可溶性總糖也有明顯的下降，同比減少了30.03%，蛋白質(zhì)的占比下降最多，由原有的，283.62mg 下降至194.38mg，同比減少了89.24mg，占比下降了31.46%；還原糖和總黃酮都有明顯的下降為21.33%和13.88%；粗脂肪的成分變化不大，由72.94mg 減至62.87mg，減少了13.81%；多糖只有細(xì)微的變化，由19.24mg 減至19.00mg，減少了1.25%。超聲臨界萃取后的蠟梅花干，雖然其基本化學(xué)成分都有一定的下降，但臘梅花干的主要化學(xué)成分組成變化不大，使得進(jìn)行超聲臨界萃取后的蠟梅花干仍具有大量的可利用成分。

對臘梅花干和鮮花進(jìn)行基本化學(xué)成分超聲臨界萃取過程中，其基本成分存在差異的原因，可能是在對鮮花進(jìn)行超聲臨界萃取的過程中大部分的活性成分轉(zhuǎn)化到精油中。其中的蛋白質(zhì)和可溶性糖的減少比例不大，對原本的化學(xué)成分構(gòu)成影響不大。而灰分和粗纖維含量在超聲臨界萃取過程中含量變多，可能是對這兩種活性成分進(jìn)行萃取的過程中，不易溶于精油中，造成萃取后的化學(xué)成分含量增加。

2.2 超聲臨界萃取天然產(chǎn)物活性成分分析結(jié)果

對預(yù)處理后的三種精油進(jìn)行分析，得到不同狀態(tài)下精油的總離子色譜圖，如圖1 所示。

圖1 不同狀態(tài)下精油的總離子色譜圖Fig. 1 The total ion chromatograms of essential oils in different states

根據(jù)圖1 可知，精油濃縮液、液態(tài)精油和固態(tài)精油總離子色譜圖由許多峰組成，這些峰出峰先后是按照色譜出峰先后順序進(jìn)行排列的，具有不同的離子流強(qiáng)度。總離子色譜圖的峰即為蠟梅花精油的活性成分化學(xué)物質(zhì)，離子強(qiáng)度越高證明化學(xué)物質(zhì)越單一，純度也越高。在15s，28s 和43s 時(shí)精油濃縮液提取純度較優(yōu)，15s 和43s 時(shí)液態(tài)精油提取純度較優(yōu)，32s 和43s 時(shí)固態(tài)精油提取純度較優(yōu)。

綜上所述，為了對超聲臨界萃取天然產(chǎn)物活性成分進(jìn)行分析，在時(shí)間為43s 時(shí)提取萃取后的精油濃縮液、液態(tài)精油和固態(tài)精油作為分析對象，由此得到了256 種臘梅花精油的活性成分化學(xué)物質(zhì)。其中，臘梅花精油濃縮液的活性成分種類為95 種，臘梅花液態(tài)精油中的活性成分有54 種，臘梅花固態(tài)精油中活性成分的種類為107 種?；钚晕镔|(zhì)種類組成：脂類物質(zhì)58 種，醛類物質(zhì)32 種，烷烴類物質(zhì)25種，醇類物質(zhì)23 種，其他物質(zhì)54 種。對三種精油的活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 臘梅精油物質(zhì)種類及含量Fig. 2 Types and content of winter plum essential oil

根據(jù)圖2 的結(jié)果，對臘梅精油中部分組分的香氣特征進(jìn)行了分析，如表3 所示。

表3 臘梅精油中部分組分的香氣特征Table 3 The fragrance characteristics of some ingredients in chimonanthus praecox essential oil

基于表3 的特征，分析了臘梅精油經(jīng)過超聲臨界萃取之后的天然產(chǎn)物活性成分。

2.2.1 醛類物質(zhì)

超聲臨界萃取后得到的醛類物質(zhì)，其活性成分中化學(xué)物質(zhì)占比較高，能夠與自然界的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，所以超聲臨界萃取后的天然產(chǎn)物中的醛類物質(zhì)含量較少。萃取之后含有的醛類物質(zhì)的精油，具有特殊的香味，是構(gòu)成天然產(chǎn)物中香味的主要化學(xué)物質(zhì)。3 種精油共檢測出32 種醛類物質(zhì)，精油濃縮液中醛類物質(zhì)的含量最少，含有7 種，含量2.15%，其中包括：3- 苯基-α- 甲苯基腙丙烯醛0.29%，苯乙醛0.14%；液態(tài)精油中的醛類物質(zhì)含量占有10 種，含量8.95%，其中包括：壬醛3.94%、庚醛2.25%；固態(tài)精油中含有的醛類物質(zhì)占有量最高，共有15 種，含量15.53%，其中包括：硬脂醛4.13%、壬醛7.97%等。庚醛具有較好的化學(xué)活性成分，可應(yīng)用于香水和化妝品中；硬脂醛具有多種香味，可應(yīng)用于多種調(diào)味料中；低濃度的硬質(zhì)醛具有水果香，可以用作食品的調(diào)香成分。

2.2.2 烷烴類物質(zhì)

超聲臨界萃取后的烷烴類物質(zhì)，其活性成分中的化學(xué)成分較穩(wěn)定，其中含有的碳原子活性較低，不易與其他化學(xué)物質(zhì)相溶。低碳原子是一種具有可燃性的特殊氣味氣體，當(dāng)碳原子數(shù)量增多時(shí)，會由氣體轉(zhuǎn)化為固態(tài)。3 種精油共檢測出30 種烷烴物質(zhì)，其中：精油濃縮液烷烴5 種，含量2.04%；液態(tài)精油烷烴10 種，含量3.42%；固態(tài)精油烷烴15 種，含量4.10%。超聲臨界萃取過程中，精油形態(tài)發(fā)生變化，烷烴內(nèi)含碳原子的數(shù)量不斷增多，由于本身具有特殊氣味且具有刺激性，濃度過高會對人體產(chǎn)生危害，對精油有副作用，需要控制其含量，并利用超聲臨界萃取法對其進(jìn)行分離。

2.2.3 醇類物質(zhì)

醇類物質(zhì)具有特殊的香氣，是植物精油中香氣定位的主要組成。其命名原則是由碳原子數(shù)決定的，其活性成分的物化性質(zhì)由羥基數(shù)決定。精油濃縮液含有42 種，含量27.43%，其中包括順-Α,Α-5- 三甲基-5- 乙烯基四氫化呋喃-2- 甲醇16.42%，（E）-2,6- 二甲基-3,7- 辛二烯-2,6- 二醇6.58%等多支鏈醇；液態(tài)精油含有11 種，含量6.59%，其中包括芳樟醇、桉油烯醇、Α- 畢橙茄醇等鏈狀萜烯醇；固態(tài)精油含有27 種，含量8.10%。液態(tài)精油中含有的芳樟醇，不僅具有玫瑰木的香氣，還具有鎮(zhèn)痛和抗菌等諸多藥理活性成分，是目前應(yīng)用最廣泛的精油活性物質(zhì)之一。精油濃縮液內(nèi)含有的香葉醇，具有玫瑰花的香氣，是生產(chǎn)維生素E 的主要原材料；固態(tài)精油中含有的豆甾醇，由于其本身的特性，主要被應(yīng)用在食品等方面。

2.2.4 脂類物質(zhì)

脂類物質(zhì)對精油的香氣具有一定的影響，部分不溶于水和任何溶劑，主要成分是脂肪酸和醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后的衍生物。3 種精油共檢測出32 種脂類物質(zhì)，精油濃縮液含有8 種，含量1.47%；液態(tài)精油含有10 種，含量4.31%；固態(tài)精油含有14 種，含量7.91%。進(jìn)行超聲臨界萃取后的脂類物質(zhì)大多呈液體狀，且具有一定的香氣，如：十八酸乙酯、十六酸乙酯等；也有一部分脂類物質(zhì)呈氣體狀，且具有特殊香味，如2- 甲基戊酸乙酯具有清甜果香味道，酸香葉酯類有玫瑰、水果清香氣味；十二酸苯甲酯具有淡脂蠟清香。脂類物質(zhì)大多具有化學(xué)香氣，因此在工業(yè)香料中被廣泛地應(yīng)用。

3 結(jié)束語

本文進(jìn)行了超聲臨界萃取天然產(chǎn)物活性成分的分析與研究，以臘梅鮮花為研究對象，采用超聲臨界萃取法獲取臘梅鮮花的活性成分。利用膜濃縮的方式對經(jīng)過超聲臨界萃取后獲取的初級精油進(jìn)行二次加工，采用離心分離得到濃縮液、液態(tài)精油和固態(tài)精油三種不同狀態(tài)的臘梅花精油產(chǎn)物。萃取后的天然產(chǎn)物在43s 時(shí)提取純度較優(yōu)，通過分析發(fā)現(xiàn)臘梅鮮花的天然產(chǎn)物活性成分主要為醛類物質(zhì)、烷烴類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和脂類物質(zhì)。其中，由于臘梅鮮花活性成分中的羥基數(shù)較高，所以醇類物質(zhì)占比為42.12%，活性成分中的醛類物質(zhì)會與自然界物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，所以醛類物質(zhì)占比為26.63%，脂類物質(zhì)主要是化學(xué)反應(yīng)后的衍生物，占比為13.69%，烷烴類物質(zhì)由于其化學(xué)成分較穩(wěn)定，所以占比較低為9.56%。通過本文的研究可以證明超聲臨界萃取可以有效獲取天然產(chǎn)物活性成分，對后續(xù)的超聲臨界萃取方法研究提供了理論支持。