組蛋白H3K79 甲基化轉(zhuǎn)移酶DOT1L 的功能研究進(jìn)展

陳曉晴，陳亮

（武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072）

組蛋白的翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM）是細(xì)胞調(diào)控染色質(zhì)功能的常見表觀遺傳機(jī)制之一，包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等.這些PTM 可以通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)或招募相應(yīng)下游功能蛋白來影響基因表達(dá)、DNA 復(fù)制等染色質(zhì)活動(dòng).其中，組蛋白甲基化是以S-腺苷-L-蛋氨酸（S-Adenosyl methionine，SAM）作為供體，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferase，HMT）將1 個(gè)、2 個(gè)或3 個(gè)甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白的賴氨酸或精氨酸殘基的過程.

Dot1（disruptor of telomeric silencing 1，也稱為KMT4）首次在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因篩選中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其過表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致端粒沉默缺陷.在哺乳動(dòng)物中，Dot1 保守的同源蛋白是DOT1L（Dot1-like），該酶被認(rèn)為是組蛋白H3 賴氨酸79 的唯一催化酶，能使H3K79 發(fā)生單甲基化、二甲基化和三甲基化[1].通常，將DOT1L 介導(dǎo)的H3K79 甲基化與活躍基因轉(zhuǎn)錄聯(lián)系起來.最近研究顯示，DOT1L參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和免疫應(yīng)答反應(yīng)，在生物體多種組織或器官發(fā)育中具有必不可少的作用，而其異常調(diào)控則與腫瘤發(fā)生與發(fā)展（如MLL基因重排白血?。┟芮邢嚓P(guān).目前，針對(duì)DOT1L 開發(fā)的小分子抑制劑已在癌癥的早期臨床實(shí)驗(yàn)中取得初步結(jié)果.

1 DOT1L 的催化活性及其調(diào)控機(jī)制

2002 年，F(xiàn)eng[2]等首次在人細(xì)胞中鑒定出DOT1L 蛋白，該蛋白在體外和體內(nèi)具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，能特異性催化組蛋白H3K79 位點(diǎn)的單、二或三甲基化修飾.2003 年，Min[3]等通過X 射線晶體衍射法解析出DOT1L 位于1-416 氨基酸殘基的催化結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包括碳和氮末端結(jié)構(gòu)域.兩者通過碳末端的長(zhǎng)α螺旋和氮末端的氨基酸殘基發(fā)生相互作用.

此外，Worden[4]等發(fā)現(xiàn)DOT1L 對(duì)底物核小體而非核心組蛋白或重組組蛋白H3 具有酶催化活性，表明DOT1L 催化H3K79 甲基化需其他組蛋白參與.在人類細(xì)胞中，DOT1L 催化功能依賴組蛋白H2B 賴氨酸120（H2BK120）的單泛素化，H2BK120 的突變導(dǎo)致H3K79 甲基化水平顯著下降.此外，組蛋白H4 氮末端的短堿性口袋與DOT1L 酸性口袋間的相互作用也為H3K79 甲基化所必需.2019 年，Worden[4]等通過冷凍電鏡技術(shù)解析了組蛋白H2B 泛素化和H4 尾部與DOT1L 催化H3K79 甲基化的動(dòng)態(tài)過程.DOT1L 與H2B-Ub核小體和SAM 的結(jié)合存在2 種不同狀態(tài)，暫?；蚧钴S狀態(tài).在暫停狀態(tài)下，H2B 泛素分子和由組蛋白H2A、H2B 形成的核小體酸性口袋與DOT1L 碳端結(jié)合，將DOT1L 碳端錨定在核小體上，而DOT1L 氮端處于動(dòng)態(tài)無序狀態(tài)，導(dǎo)致DOT1L 的活性位點(diǎn)距離H3K79 過遠(yuǎn).在活躍狀態(tài)下，DOT1L 氮端的溝槽和H4 尾部的堿性殘基（15-19）結(jié)合，將DOT1L 氮端固定在核小體另一端，最終使DOT1L 及其催化中心準(zhǔn)確定位在H3K79上方，保證該殘基的識(shí)別特異性.活躍狀態(tài)下的DOT1L 促進(jìn)核小體內(nèi)部H3K79 正亮氨酸環(huán)發(fā)生約90°旋轉(zhuǎn)，遠(yuǎn)離核小體表面并暴露H3K79 位點(diǎn)于DOT1L 催化中心.

除了H3K79，DOT1L 還催化其他底物，如前列腺癌中雄激素受體（androgen receptor，AR）K349 位的甲基化[5].

2 DOT1L 的生物學(xué)功能

2.1 DOT1L 與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

通常，認(rèn)為真核生物H3K79 甲基化與基因活躍轉(zhuǎn)錄相關(guān).在人CD4+T 細(xì)胞中，染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-Seq）顯示H3K79me2/me3 與基因活性呈正相關(guān).在小鼠細(xì)胞中，H3K79 甲基化被發(fā)現(xiàn)定位在活躍轉(zhuǎn)錄基因體內(nèi)，且其富集水平與基因表達(dá)水平正相關(guān)[6].相反地，在小鼠腎臟中，Reisenauer[7]等發(fā)現(xiàn)編碼上皮Na+通道亞基的αENaC基因表達(dá)被H3K79 甲基化抑制.DOT1L 缺失影響基因表達(dá)，且大部分基因顯示表達(dá)上調(diào)，但這些影響源于DOT1L 蛋白自身還是H3K79甲基化修飾，是直接還是間接調(diào)控目前尚無定論.

最近研究顯示，DOT1L 與人類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄延伸存在相關(guān)性.DOT1L 與RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，RNAPII）碳末端重復(fù)結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）、超延伸復(fù)合物（super elongation complex，SEC）亞基ENL、AF4、AF9、AF10 發(fā)生相互作用.RNAPII CTD 的Ser5 和Ser2 磷酸化修飾分別對(duì)應(yīng)RNAPII 在啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄和進(jìn)入有效轉(zhuǎn)錄延伸階段.SEC 可以通過磷酸化RNAPII CTD 調(diào)控RNAPII 從基因啟動(dòng)子近端暫停位點(diǎn)釋放進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延伸.另外，ENL 的敲低降低了全基因組H3K79me2 水平及轉(zhuǎn)錄延伸活性[8]49-50，這些證據(jù)暗示DOT1L 在轉(zhuǎn)錄延伸中的作用.通過BruDRB-seq 測(cè)量全基因組轉(zhuǎn)錄延伸速率發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的H3K79me2 水平與轉(zhuǎn)錄延伸速率正相關(guān)[9].DOT1L 調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄延伸可能不依賴H3K79 甲基化，因?yàn)橥蛔僁OT1L 催化活性位點(diǎn)未觀察到轉(zhuǎn)錄延伸速率的改變[10].DOT1L/H3K79 甲基化修飾對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

2.2 DOT1L 在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用

細(xì)胞周期是單向且不可逆的過程，確保細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行.研究發(fā)現(xiàn)，DOT1L 參與調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換.在人肺癌細(xì)胞和小鼠卵黃囊衍生的紅系祖細(xì)胞中，DOT1L 敲低或缺失會(huì)導(dǎo)致G1 期阻滯[11-12].在體外分化的小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）中，DOT1L 缺失引起細(xì)胞增殖缺陷并阻滯在G2/M期[13].在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，DOT1L 沉默或抑制則誘導(dǎo)細(xì)胞S 期阻滯[14].DOT1L 敲低或缺失造成不同細(xì)胞的差異影響可能與細(xì)胞周期中H3K79 甲基化水平相關(guān).如在小鼠ESC 中，G1/S 轉(zhuǎn)換期H3K79 甲基化水平變化不大，但在人肺癌細(xì)胞中H3K79me2 水平明顯升高，這暗示DOT1L 可能通過H3K79me2 調(diào)控肺癌細(xì)胞G1/S 期轉(zhuǎn)換[15].此外，盡管H3K79 甲基化的整體水平在細(xì)胞周期中沒有波動(dòng)，但其在特定染色質(zhì)區(qū)域的局部水平變化也可能是細(xì)胞周期調(diào)控差異的原因.

DNA 損傷引發(fā)細(xì)胞周期停滯，相應(yīng)的DNA 修復(fù)機(jī)制被啟動(dòng)以確保細(xì)胞周期進(jìn)程的順利進(jìn)行.DOT1L及其介導(dǎo)的H3K79 甲基化參與DNA 損傷修復(fù)過程.2004 年，Huyen[16]等發(fā)現(xiàn)人DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）修復(fù)蛋白53BP1 與H3K79me2 結(jié)合并被招募到DSB 處，H3K79 位點(diǎn)的突變、DOT1L 的缺失以及53BP1tudor 結(jié)構(gòu)域的突變都抑制了53BP1 向DSB 的募集.此外，DOT1L 也在紫外線輻射（ultraviolet，UV）引發(fā)的DNA 損傷修復(fù)及烷化劑引起的跨損傷合成（translesion synthesis，TLS）修復(fù)中發(fā)揮重要作用[8，17].鑒于DOT1L/H3K79 甲基化修飾與轉(zhuǎn)錄活動(dòng)密切相關(guān)，其在DNA 損傷修復(fù)中的作用是否有轉(zhuǎn)錄活動(dòng)參與值得未來研究.

2.3 DOT1L 在免疫應(yīng)答中的作用

最新多項(xiàng)研究顯示，DOT1L 調(diào)控免疫系統(tǒng)T 淋巴細(xì)胞的分化和功能.在條件性敲除T 淋巴細(xì)胞DOT1L的小鼠模型中，Scheer[18]等發(fā)現(xiàn)胸腺和脾臟中的CD4+T 細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且細(xì)胞凋亡增加.此外，DOT1L缺失還激活T 細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)傳導(dǎo)通路，降低TCR 負(fù)調(diào)節(jié)因子CD5 的表達(dá)，促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞的活化.初始CD4+T 細(xì)胞在遇到抗原后可以分化成不同的T 輔助（T helper，Th）細(xì)胞亞群，包括產(chǎn)生干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的Th1 細(xì)胞、產(chǎn)生白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4/5/13 的Th2 細(xì)胞和產(chǎn)生IL-17的Th17 細(xì)胞.敲除DOT1L 導(dǎo)致CD4+T 細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)升高，產(chǎn)生這種結(jié)果是因?yàn)镈OT1L 缺陷型Th2和Th17 細(xì)胞重編程為表達(dá)Th1 相關(guān)基因（IFN-γ）的細(xì)胞.另外，在抑制Th1 分化的轉(zhuǎn)錄因子基因上發(fā)現(xiàn)H3K79me2 水平下降.這些證據(jù)表明，DOT1L 可能通過抑制Th1 基因和激活負(fù)調(diào)節(jié)因子來控制Th1 分化.DOT1L 缺失會(huì)損害體內(nèi)Th2 反應(yīng)，暗示DOT1L 抑制劑在治療Th2 導(dǎo)致的過敏性疾病中的可行策略.

DOT1L 在B 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)中也具重要作用.Kealy[19]等發(fā)現(xiàn)，敲除B 細(xì)胞的DOT1L，小鼠骨髓和脾臟B 細(xì)胞數(shù)量減少.此外，特異性敲除成熟B 細(xì)胞的DOT1L 會(huì)導(dǎo)致流感病毒感染后的記憶B 細(xì)胞缺失以及骨髓漿細(xì)胞減少.研究表明，DOT1L 為生發(fā)中心（germinal center，GC）形成和產(chǎn)生有效GC 反應(yīng)所必需.在流感病毒感染后，DOT1L 缺陷下調(diào)B 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致活化的BCL6+B 細(xì)胞未能定位在卵泡內(nèi)形成GC，產(chǎn)生偏向于Th1 細(xì)胞的IgG1 或Th2 細(xì)胞的IgG2c 抗體明顯減少[20].總之，這些結(jié)果顯示DOT1L 是體液免疫反應(yīng)的調(diào)控蛋白.

除了調(diào)控T 和B 淋巴細(xì)胞的功能，DOT1L 還被報(bào)道參與流感病毒感染后的抗病毒反應(yīng).Marcos-Villar[21]等發(fā)現(xiàn)，敲低DOT1L 或抑制其酶活性損害了核因子NF-κB 入核，下調(diào)NF-κB 誘導(dǎo)的IFNβ、IFN 刺激基因56（ISG56）和干擾素誘導(dǎo)蛋白Mx1表達(dá)，最終促進(jìn)流感病毒復(fù)制.DOT1L 對(duì)病毒復(fù)制的影響依賴IFN 信號(hào)傳導(dǎo)通路，因?yàn)镈OT1L 抑制干擾素誘導(dǎo)病毒（如水皰性口炎病毒）增殖，但不改變非干擾素誘導(dǎo)的呼吸道合胞病毒擴(kuò)增[22].這些證據(jù)支持DOT1L 或H3K79 甲基化在調(diào)節(jié)干擾素誘導(dǎo)病原體抗病毒反應(yīng)中的作用.

2.4 DOT1L 在機(jī)體發(fā)育中的作用

DOT1L 在心臟和血管生成中發(fā)揮重要作用，DOT1L 缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡和心血管缺陷.Nguyen[23]等發(fā)現(xiàn)，特異性敲除小鼠心臟DOT1L 引起抗肌萎縮蛋白基因下調(diào)，出現(xiàn)心室擴(kuò)張和收縮障礙.此外，有研究表明，DOT1L 通過與轉(zhuǎn)錄因子ETS-1 協(xié)同作用刺激基因Vegfr2表達(dá)，促進(jìn)血管生成[24].DOT1L 在紅細(xì)胞生成方面也有重要作用，DOT1L 敲除的小鼠胚胎表現(xiàn)嚴(yán)重貧血和骨髓細(xì)胞不足.DOT1L 促進(jìn)紅細(xì)胞分化可能通過激活Gata2和抑制骨髓轉(zhuǎn)錄因子PU.1 實(shí)現(xiàn)[12]4488-4489.研究發(fā)現(xiàn)，DOT1L 在小鼠軟骨形成過程中高表達(dá)，在小鼠軟骨細(xì)胞中敲低DOT1L 會(huì)導(dǎo)致軟骨形成受損.另外，在敲低細(xì)胞中Wnt 靶基因表達(dá)下調(diào)，顯示DOT1L 可能通過調(diào)控Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)軟骨形成[25].DOT1L 是淋巴管發(fā)育和功能的調(diào)節(jié)蛋白，Tie2（+）內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）中DOT1L 的缺失下調(diào)H3K79me2 水平并抑制與發(fā)育和組織功能相關(guān)的重要基因表達(dá)，引起皮膚水腫、血液-淋巴混合、淋巴瓣和血管發(fā)育不全[26].綜上，DOT1L 在維持機(jī)體正常發(fā)育中具有重要作用，提示運(yùn)用DOT1L 抑制劑治療時(shí)可能出現(xiàn)發(fā)育相關(guān)的并發(fā)癥.

3 DOT1L 與MLL-r 白血病

急性白血病是最常見的癌癥之一，也是兒童癌癥死亡的主要原因.急性白血病主要包括急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓細(xì)胞白血病，染色體易位是導(dǎo)致2 種白血病發(fā)展的主要機(jī)制之一，最常見的是混合譜系白血病基因（Mixed Lineage Leukemia，MLL）易位.MLL基因的易位重排導(dǎo)致MLL 氮端與多種融合伴侶（>90個(gè)）碳端融合，產(chǎn)生的融合蛋白與DNA 或染色質(zhì)結(jié)合，并在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中誘導(dǎo)白血病轉(zhuǎn)化.研究發(fā)現(xiàn)，DOT1L 及其介導(dǎo)的H3K79me2 在MLL-r 白血病中發(fā)揮重要作用.DOT1L 通過與MLL 融合蛋白（如MLL-AF4，MLL-AF9，MLL-AF10，MLL-ENL）直接或間接作用，被異常招募至MLL 融合靶基因（如Hoxa家族和Meis1）啟動(dòng)子處，隨后DOT1L 催化的H3K79me2 激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)白血病轉(zhuǎn)化.DOT1L的催化活性是MLL重排白血病發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素，因?yàn)镈OT1L 的酶活缺陷能夠抑制MLL-r 細(xì)胞的生長(zhǎng).盡管DOT1L 在疾病本身中沒有發(fā)生基因突變，但其錯(cuò)誤定位的酶活性是致使MLL-r 患者發(fā)病的原因之一，這意味著DOT1L 酶活可以作為白血病治療的靶標(biāo)[27].據(jù)此研發(fā)出DOT1L 的小分子抑制劑EPZ004777，該化合物通過與DOT1L 甲基轉(zhuǎn)移酶活性所需的SAM 輔助因子競(jìng)爭(zhēng)而發(fā)揮作用.EPZ004777 能有效抑制細(xì)胞H3K79 甲基化，阻斷白血病基因表達(dá)并選擇性殺死MLL-r 細(xì)胞，但其藥理特性較差.第二代SAM 競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑EPZ5676 是EPZ004777 的衍生藥物，具有更高的底物特異性和效能，目前該藥處于臨床實(shí)驗(yàn)中，但其口服的生物利用率較低，需要腹腔給藥.最近，開發(fā)出了新的高效小分子抑制劑SGC0946 和SYC-522，這些藥物正在進(jìn)行功能和作用機(jī)制的研究中[28].此外，一些針對(duì)DOT1L 通路的替代藥物和聯(lián)合用藥方案也在積極探索中.

4 展望

近年來，因DOT1L 與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，逐漸成為癌癥預(yù)后評(píng)估和治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)，特別是MLL-r 白血病.目前，已經(jīng)開發(fā)出用以治療MLL-r 白血病的DOT1L 抑制劑，但這些抑制劑普遍存在生物利用率低和快速降解等問題.此外，DOT1L 對(duì)機(jī)體發(fā)育的重要作用也提示靶向DOT1L 的治療方法存在副作用風(fēng)險(xiǎn).因此，深入探索DOT1L 在不同發(fā)育過程和疾病中的作用機(jī)制，將有助于開發(fā)新的治療方案，如靶向DOT1L 調(diào)控蛋白或下游效應(yīng)蛋白，達(dá)到更優(yōu)的治療效果.