■ 文｜深圳市漁業(yè)發(fā)展研究中心 黃浦江 徐遠(yuǎn)珍

羅非魚原產(chǎn)于非洲，包括亞種在內(nèi)共計(jì)100多種。羅非魚肉質(zhì)鮮美，無間刺，蛋白含量高，富含8種人體所需的必需氨基酸、不飽和脂肪酸等，素有“白肉三文魚”之稱。同時(shí)，因其具有生長快、食性雜、耐低氧、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，被評定為最具發(fā)展?jié)摿Φ牡厣珒?yōu)勢品種。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌抗菌肽在生物保鮮劑上具有廣闊的應(yīng)用前景，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽可使羅非魚片保質(zhì)期延長4d以上。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的抑菌代謝產(chǎn)物常見有：抑菌蛋白、蛋白酶、纖維素酶、氨肽酶、抑菌肽等，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在細(xì)菌病的治療和食物保鮮上具有廣闊的前景。本研究使用的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌采自于深圳某羅非魚養(yǎng)殖場羅非魚腸道，研究人員對其進(jìn)行了革蘭氏染色、16S rRNA鑒定及生化鑒定，旨在為今后篩選提高羅非魚抗病能力、促進(jìn)羅非魚健康生長的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌提供理論依據(jù)，從而為研發(fā)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在羅非魚及其他經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供參考。

材料與方法

1.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌分離純化

本次使用的羅非魚（200±50）g置于超凈工作臺中，用75%的酒精棉球擦拭魚體表面，解剖取出腸道。用無菌生理鹽水沖洗數(shù)遍，清除腸道內(nèi)容物，置于玻璃勻漿器中加入1mL生理鹽水進(jìn)行研磨，研磨充分后用三倍無菌生理鹽水連續(xù)稀釋，用渦旋攪拌機(jī)混勻，分別涂布于TSA、MRS、TPY、PDA平板上，每個(gè)平板涂布100μL，各種平板設(shè)置6個(gè)重復(fù)，其中3個(gè)置于30℃無氧條件中培養(yǎng)，另外3個(gè)置于30℃有氧條件中培養(yǎng)。48h后挑取單個(gè)菌落，反復(fù)劃線分離至獲得純菌株。通過革蘭氏染色、鏡檢，初步篩選出革蘭氏陽性桿菌。

2.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的鑒定

挑取上述從羅非魚腸道分離出的革蘭氏陽性菌株，提取其DNA，送公司測序。利用NCBI的Blast程序比對分析16S rRNA基因序列測序結(jié)果。利用最大簡約法和鄰接法進(jìn)行分析，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)為1000。

3.生化鑒定

菌株的生化鑒定主要通過HBI蠟樣芽孢桿菌生化鑒定條和單盒生化鑒定管來鑒定。鑒定方法遵照鑒定條（管）使用說明書中的方法，在超凈工作臺上操作，用酒精棉球擦拭鑒定條（管），鑒定條用打孔器打孔，鑒定管用鑷子打開鋁蓋，注入100μL菌懸液，封蓋培養(yǎng)，培養(yǎng)條件、時(shí)間及結(jié)果判定參照說明書。

結(jié)果與分析

1.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的分離

從羅非魚腸道中分離出1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，命名為TPS-A。分離得到的菌株革蘭氏染色為陽性，顯微鏡下觀察為桿狀（圖1）。

圖1 菌株TPS-A革蘭氏染色圖

2.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的鑒定

采用16sRNA PCR技術(shù)對該菌株進(jìn)行鑒定。經(jīng)廣州生工生物技術(shù)有限公司測序證實(shí)，菌株TPS-A的DNA bp值為1454（圖2），基因庫編號為MK130896。

圖2 泳道M：DNA marker DL 2000泳道1：TPS-A PCR 產(chǎn)物

系統(tǒng)發(fā)育分析表明（圖3），菌株TPS-A與B.methylotrophicus strain CBMB205、B.velezensis strain FZB42、B.siamensis strain PD-A10的相似性分別為99.79%、98.26%、95.34%，與B.methylotrophicus strain一類物種的親緣關(guān)系最高且聚為一支，所以推薦鑒定該菌種為B.methylotrophicus strain。

圖3 基于TPS-A 16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.生化鑒定結(jié)果

根據(jù)生化鑒定條（管）說明書提供的判定標(biāo)準(zhǔn)，得出菌株TPS-A的生理生化特性如表1。菌株TPS-A，淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽肉湯試驗(yàn)等試驗(yàn)均為陽性，溶酶菌肉湯試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)等試驗(yàn)均為陰性，糖發(fā)酵結(jié)果為，菌株TPS-A可以發(fā)酵葡萄糖，不能發(fā)酵肌醇等。

表1 羅非魚腸道分離芽孢桿菌TPS-A 的生化鑒定結(jié)果

結(jié)論

本次研究通過平板劃線分離、革蘭氏染色、鏡檢、16S rRNA以及生理生化鑒定等方法，成功從羅非魚腸道中分離得到了一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，因其不具有常用抗生素耐藥性基因，使得這菌株在耐藥性基因產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移等相關(guān)研究中具有廣闊的前景，也能為羅非魚源甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的篩選、鑒定、分析和應(yīng)用提供參考。