王同振，徐 榮，劉麗曉，郝瑞榮，李清宏

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

腸道內(nèi)棲息著數(shù)量龐大且代謝活躍的微生物菌群，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。腸道菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝和健康免疫起到重要的作用，影響腸道菌群變化的因素主要包括宿主自身健康狀況、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式等。研究表明，日糧是引起腸道微生物數(shù)量和組成變化的主要因素，其作用方式更為直接迅速。而日糧中的蛋白質(zhì)作為后腸微生物發(fā)酵利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)腸道微生物區(qū)系的改變更為明顯。

早期斷奶仔豬由于自身消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，加之飼糧、環(huán)境和心理等多種因素改變?nèi)菀滓饠嗄虘?yīng)激，造成仔豬腸道微生物區(qū)系紊亂、免疫功能降低，仔豬極易出現(xiàn)腹瀉、生長(zhǎng)遲緩甚至死亡。腹瀉是導(dǎo)致斷奶仔豬死亡的重要原因，以往通過(guò)在飼料中添加大量的抗生素以預(yù)防仔豬腹瀉，加強(qiáng)仔豬抗病能力。當(dāng)前在飼用抗生素禁用的背景下，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能和腸道健康水平已成為大勢(shì)所趨。研究表明，低蛋白水平日糧對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響但可以降低仔豬腹瀉率，減少毒性物質(zhì)(如氨和胺類)對(duì)腸道的損傷，促進(jìn)腸道健康；復(fù)合酸化劑(Compound acidifier，CA)可以降低胃腸道pH，刺激消化酶活性、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制有害微生物定植，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)。目前，對(duì)于低蛋白水平日糧和CA對(duì)斷奶仔豬腸道健康影響的研究絕大部分是單獨(dú)進(jìn)行的，而對(duì)兩者的配合使用鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)(Illumina MiSeq)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法探究低蛋白水平日糧添加CA對(duì)仔豬后腸微生物菌群及其代謝組學(xué)的影響，以期為低蛋白水平日糧和CA在豬生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)，為緩解斷奶仔豬應(yīng)激的營(yíng)養(yǎng)措施提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選用體況相似、胎次相近的28日齡斷奶的“杜洛克×長(zhǎng)白×大白”三元雜交仔豬27頭，按體重相近(9.87±0.14 kg)的原則，隨機(jī)分為3個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭豬。對(duì)照組飼喂正常蛋白水平日糧(NP，粗蛋白水平20%)，試驗(yàn)組分別飼喂中等蛋白水平日糧+復(fù)合酸化劑(MP+CA，粗蛋白水平18%，復(fù)合酸化劑添加水平8 g/kg)和低蛋白水平日糧+復(fù)合酸化劑(LP+CA，粗蛋白水平16%，復(fù)合酸化劑添加水平8 g/kg)。預(yù)飼期3 d，正式期28 d。

1.2 試驗(yàn)日糧

以玉米-豆粕型日糧為基礎(chǔ)，參照NRC(2012)11～25 kg階段豬營(yíng)養(yǎng)需要配制成粉狀配合飼料。對(duì)照組日糧蛋白水平為20%，處理組日糧蛋白水平分別為18%和16%。為了準(zhǔn)確配制不同蛋白水平日糧，并使日糧滿足NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)回腸可消化氨基酸(SIDAA)水平，在處理組日糧中補(bǔ)充賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸4種必需氨基酸以滿足仔豬斷奶后的生長(zhǎng)需要，同時(shí)補(bǔ)充大豆油使得3組之間消化能一致。試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。復(fù)合酸化劑購(gòu)自安徽五糧泰生物工程股份有限公司，主要組分為檸檬酸(≥35%)、乳酸(≥5%)、乙酸、丙酸和丁酸等。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Ingredients and nutrient levels of the experimental diets

1.3 飼養(yǎng)管理

動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)于2019年8月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心進(jìn)行，采用全封閉式管理，所有試驗(yàn)豬均在同一豬舍內(nèi)分欄飼養(yǎng)。豬舍地面為全漏縫塑料地板，每個(gè)飼養(yǎng)欄都配有不銹鋼乳頭式自動(dòng)飲水器和硬質(zhì)塑料料槽。在進(jìn)豬前對(duì)豬舍進(jìn)行消毒處理。保持豬舍衛(wèi)生干凈整潔。豬舍溫度控制在25～27 ℃，相對(duì)濕度控制在70%左右。試驗(yàn)期間，豬舍消毒與仔豬驅(qū)蟲(chóng)、免疫均按豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行。

1.4 樣品采集

于試驗(yàn)第28天清晨對(duì)仔豬進(jìn)行稱重、采血, 按照屠宰順序提前2 h飼喂以確保仔豬后腸道充盈，便于食糜收集。從每個(gè)重復(fù)挑選1頭接近該重復(fù)平均體重的仔豬進(jìn)行屠宰，待胸腹腔打開(kāi)后，結(jié)扎各個(gè)腸段，取相同部位盲腸、結(jié)腸食糜，裝入滅菌的2 mL凍存管中，立即放入液氮中速凍并隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中貯存，用于腸道微生物測(cè)序和代謝物分析。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 16S rRNA高通量測(cè)序

1.5.1.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增 取盲腸和結(jié)腸食糜樣品各18份共36份，DNA提取和PCR擴(kuò)增參照Z(yǔ)hang等方法。使用E.Z.N.A.D4015 Stool DNA Kit(Omega Bio-tek，美國(guó))試劑盒提取樣品總DNA。本試驗(yàn)選擇細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)為測(cè)序區(qū)域，引物序列為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。擴(kuò)增體系如下： 5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶(TransGen，中國(guó))0.4 μL, DNA模板 10 ng，補(bǔ)充ddHO至20 μL。利用ABI GeneAmp9700(Applied Biosystem，美國(guó))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

1.5.1.2 Illumina Miseq測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒(Axygen，美國(guó))回收，采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega，美國(guó))進(jìn)行定量檢測(cè)。樣品在Miseq PE 300平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5.1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 使用FLASH(v.1.2.11)和Qiime(v.1.8.0)軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接、篩選和過(guò)濾等處理，數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù)參照劉晶的方法。使用UCHIME(v.4.2.40)軟件鑒定和去除PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合序列，獲得最終的有效數(shù)據(jù)。利用Mothur(v.1.31.2)軟件做Rarefaction分析，并基于樣品OTU水平進(jìn)行微生物Alpha多樣性分析，計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，并通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。利用R軟件進(jìn)行基于Bray-curtis距離的PCoA主坐標(biāo)分析。利用R軟件中Vegan包的ANOSIM分析檢驗(yàn)群落組間相似度，組間差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義。根據(jù)SILVA細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，根據(jù)分析結(jié)果，計(jì)算門(Phylum)和屬(Genus)兩個(gè)分類學(xué)水平上樣本的群落物種組成，用R語(yǔ)言工具繪制物種群落組成柱形圖。利用線性判別分析LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size)尋找各組間在豐度上有顯著差異的物種(LDA閾值大于3)。

1.5.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析

1.5.2.1 糞便樣本處理 待測(cè)樣品在冰上解凍后，稱量樣品50 mg轉(zhuǎn)移至離心管中，加入500 μL -20 ℃預(yù)冷的70%的甲醇水(含l μg/mL的2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo))，渦旋3 min，然后在冰水浴中超聲10 min，取出再渦旋1 min，靜置后在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液到對(duì)應(yīng)進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.5.2.2 色譜-質(zhì)譜條件 采用Shim-pack (SHIMADZU)超高效液相色譜儀，使用液相色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)對(duì)糞便樣品進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為超純水(0.04%的乙酸)，B相為乙腈(0.04%的乙酸)；流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。樣品質(zhì)譜參數(shù)參照WEI等所提方法。

1.5.2.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理 將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI 軟件中進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊，最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，然后參照曹青青的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。

1.5.2.4 篩選差異代謝物 首先對(duì)進(jìn)行差異比較的分組樣品進(jìn)行偏最小二乘分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA)，獲得變量重要性投影值(Variable Importance in the Projection，VIP)，然后結(jié)合Welch’s檢驗(yàn)中的-value來(lái)進(jìn)一步篩選出不同分組間的差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為VIP值>1且<0.05。

1.5.2.5 代謝通路分析 結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析和單變量分析選出差異代謝物，應(yīng)用MetaboAnalyst 5.0分析，對(duì)代謝物進(jìn)行可視化圖分析，通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異代謝物所在通路進(jìn)行富集分析，并做進(jìn)一步的篩選，找到與代謝物差異關(guān)聯(lián)性最高的關(guān)鍵代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 低蛋白水平日糧添加復(fù)合酸化劑對(duì)斷奶仔豬后腸微生物組成的影響

2.1.1 微生物測(cè)序質(zhì)量分析 利用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)斷奶仔豬盲腸和結(jié)腸36個(gè)樣品所提取的菌群DNA進(jìn)行16S rRNA基因V3～V4區(qū)測(cè)序，共得到1 987 885條有效序列數(shù)，序列平均長(zhǎng)度為419.62 bp。檢測(cè)樣品的Sobs指數(shù)稀釋曲線趨于平緩，不再隨序列的增加而變化，說(shuō)明測(cè)序深度已基本覆蓋樣本中的所有物種，測(cè)序質(zhì)量良好。

2.1.2 Alpha多樣性分析 由表2可知，在盲腸中，與NP組相比，MP+CA和LP+CA組Alpha多樣性指數(shù)均無(wú)顯著性差異(>0.05)。在結(jié)腸中，與NP組相比，MP+CA組Alpha多樣性指數(shù)均無(wú)顯著性差異(>0.05)；LP+CA組Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均顯著提高(<0.05)。結(jié)果表明，在低蛋白水平日糧中添加CA顯著提高了結(jié)腸微生物群落的豐富度，對(duì)盲腸和結(jié)腸微生物群落的多樣性沒(méi)有顯著影響。

表2 盲腸和結(jié)腸微生物的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of cecum and colon

2.1.3 PCoA分析 PCoA 散點(diǎn)圖(圖1)顯示NP組與MP+CA和LP+CA組盲腸和結(jié)腸樣本分布距離較遠(yuǎn)，組間樣本點(diǎn)沒(méi)有交集，主坐標(biāo)成分PC1和PC2分別占有36.11%、18.29%和34.44%、19.89%的樣本組成差異，表明NP組與MP+CA和LP+CA組樣本的微生物群落組成是可以相互區(qū)分的，通過(guò)相似性分析(ANOSIM)進(jìn)一步證實(shí)了MP+CA和LP+CA組后腸微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生極顯著改變(<0.01)。

圖 1 盲腸(A)和結(jié)腸(B)樣品基于Bray-curtis的PCoA分析Fig. 1 PCoA analysis of cecal (A) and colonic (B) samples based on Bray-curtis distance

2.1.4 物種組成及差異分析 在屬水平上，盲腸和結(jié)腸樣本中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌屬分別于有25和34個(gè)，其共有物種中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌屬有乳酸桿菌屬()、鏈球菌屬()、罕見(jiàn)小球菌屬()、嚴(yán)格梭菌屬1(___1)、埃希氏-志賀菌屬(-)等(圖2A，圖2B)。

圖2 盲腸(A)和結(jié)腸(B)微生物在屬水平上的物種組成Fig. 2 Species composition of cecal (A) and colonic (B) microbe at Genus level

基于LEfSe的多級(jí)物種差異判別分析表明，NP組與MP+CA組和LP+CA組盲腸和結(jié)腸樣品在門、科和屬等分類水平上均有相對(duì)豐度顯著差異的細(xì)菌。如在屬水平上，在盲腸中，與NP組相比，MP+CA組顯著差異的細(xì)菌有互營(yíng)球菌屬()、普雷沃氏菌屬_9(_9)和歐陸森氏菌屬()等；LP+CA組顯著差異的細(xì)菌有嚴(yán)格梭菌屬1、毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)和普雷沃氏菌科NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)等(圖3A)。在結(jié)腸中，與NP組相比，MP+CA組顯著差異的細(xì)菌有、互營(yíng)球菌屬、和克里斯滕森菌科R7群(Christensenellaceae_R_7_group)等；LP+CA組顯著差異的細(xì)菌有瘤胃菌科_UCG_014(Ruminococcaceae_UCG-014)、普雷沃氏菌科NK3B31群和克里斯滕森菌科R7群等(圖3B)。

圖3 盲腸(A)和結(jié)腸(B)微生物L(fēng)EfSe差異分析LDA分值圖Fig. 3 LDA score chart of cecal cecal (A) and colonic (B) microbe LEfSe difference analysis

2.2 低蛋白水平日糧添加復(fù)合酸化劑對(duì)斷奶仔豬后腸微生物代謝組的影響

2.2.1 差異代謝物篩選 如圖4所示，在盲腸中，NP組與MP+CA組和LP+CA組分別篩選出26和42種差異代謝物，其中共有的差異代謝物有7種，分別是三碘甲狀腺原氨酸(3,3',5-Triiodo-L-Thyronine)、2-甲基丁酰肉毒堿(2-Methylbutyroylcarnitine)、-(+)-蘋果酸(-(+)-Malic acid)、尿嘧啶核苷(Uridine)、核黃素(Riboflavin)、吲哚-3-甲醇(Indole-3-carbinol)和檸蘋酸(Citramalic Acid)核苷(Uridine)和核黃素(Riboflavin)等。在結(jié)腸中，NP組與MP+CA組和LP+CA組分別篩選出47和69種差異代謝物，其中共有的差異代謝物有16種，包括丁香酸(Syringic Acid)、鄰二甲苯(o-Xylene)、金合歡烯(Farnesene)、癸二酸(Sebacate)、2-乙?；?5-甲基呋喃(2-Acetyl-5-methylfuran)、壬二酸(Azelaic Acid)、奎寧(Quinine)、三碘甲狀腺原氨酸(3,3',5-Triiodo-L-Thyronine)、氧化芳樟醇(Linalyl oxide)、18-羥基皮質(zhì)(甾)酮(18-Hydroxycorticosterone)、2'-脫氧胞苷-5'-單磷酸(2'-Deoxycytidine-5'-Monophosphate)、辛二酸(Subericacid)、5-羥基己酸(5-Hydroxyhexanoic Acid)、DL-3,4-二羥基苯基二醇(DL-3,4-Dihydroxyphenyl glycol)、對(duì)苯二酚(Hydroquinone)和葡萄糖醛酸(D-Glucoronic Acid)等。

圖4 盲腸(A)和結(jié)腸(B)差異代謝物火山圖Fig. 4 The volcano map of the difference metabolites in the cecum (A) and colon (B)

2.2.2 代謝通路富集分析 分別對(duì)盲腸和結(jié)腸中篩選出的共有差異代謝物進(jìn)行KEGG功能富集分析。結(jié)果表明，盲腸中差異代謝物主要富集在核黃素代謝(Riboflavin Metabolism)、嘧啶代謝(Pyrimidine Metabolism)和甲狀腺激素合成(Thyroid hormone synthesis)等代謝通路上；而結(jié)腸中的差異代謝物則主要富集在甘油磷酸穿梭(Glycerol Phosphate Shuttle)、甲狀腺激素合成(Thyroid hormone synthesis)和核黃素代謝(Riboflavin Metabolism)等代謝通路上(圖5)。

圖5 盲腸(A)和結(jié)腸(B)代謝通路富集分析圖Fig. 5 Enrichment analysis diagram of metabolic pathways in the cecum (A) and colon (B)

3 討 論

關(guān)于低蛋白水平日糧對(duì)腸道微生物區(qū)系豐富度和多樣性報(bào)道并不一致，Peng等報(bào)道指出，適度降低日糧粗蛋白水平有利于腸道健康，增加了結(jié)腸細(xì)菌多樣性，減少了有害蛋白質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。Zhou等研究表明，降低日糧蛋白質(zhì)水平3個(gè)百分點(diǎn)并不影響盲腸和結(jié)腸微生物的豐富度和多樣性。在本研究中，在低蛋白水平日糧中添加復(fù)合酸化劑顯著提高了結(jié)腸微生物群落的豐富度，對(duì)盲腸和結(jié)腸微生物群落的多樣性沒(méi)有顯著影響。本研究相似性分析發(fā)現(xiàn)，NP組與MP+CA和LP+CA組微生物群落在PCoA散點(diǎn)圖上被清晰地分隔開(kāi)來(lái)，表明低蛋白水平日糧添加CA能夠改善仔豬后腸微生物區(qū)系。

豬腸道中的細(xì)菌主要以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門細(xì)菌為主，其中厚壁菌門和擬桿菌門約占整個(gè)菌群的90%，是腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌種。在本試驗(yàn)中，盲腸中以厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，而結(jié)腸中物種相對(duì)豐度最高的兩個(gè)細(xì)菌門類分別是厚壁菌門和擬桿菌門。研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門是主要的纖維素分解菌，能夠?qū)⒗w維素降解為揮發(fā)性脂肪酸供宿主利用，而擬桿菌門細(xì)菌主要參與日糧中碳水化合物和蛋白質(zhì)降解，在后腸微生物發(fā)酵及微生態(tài)平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究中，在低蛋白水平日糧中添加CA降低了結(jié)腸中厚壁菌門的相對(duì)豐度，提高了擬桿菌門的相對(duì)豐度，同時(shí)厚壁菌門和擬桿菌門的比值下降，這可能是因?yàn)榈偷鞍姿饺占Z影響了宿主的代謝過(guò)程。厚壁菌門和擬桿菌門的比值可以反映宿主的脂質(zhì)代謝情況，比值提高會(huì)引發(fā)與肥胖相關(guān)的代謝疾病，這與低蛋白水平日糧導(dǎo)致肥育豬背膘增厚、胴體無(wú)脂瘦肉率降低的現(xiàn)象一致。變形菌門的細(xì)菌大多為致病菌，包括大腸桿菌、志賀氏菌等，變形菌門細(xì)菌大多與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂或腸腔炎癥有關(guān)。在本試驗(yàn)中，低蛋白水平日糧添加CA顯著降低了盲腸和結(jié)腸中變形菌門的相對(duì)豐度，說(shuō)明日糧蛋白水平降低和CA的添加抑制了致病菌的繁殖，原因可能是蛋白水平降低減少了這些細(xì)菌的發(fā)酵底物，同時(shí)添加酸化劑所帶來(lái)的酸性環(huán)境對(duì)革蘭氏陰性菌具有抑制作用。因此，在低蛋白水平日糧中添加復(fù)合酸化劑有利于促進(jìn)動(dòng)物腸道健康。

瘤胃菌科和普雷沃氏菌是豬腸道內(nèi)主要的纖維降解菌，廣泛分布在后腸中，可以分解纖維素產(chǎn)生短鏈脂肪酸。此外，普雷沃氏菌還參與了宿主碳水化合物和氨基酸的代謝，促進(jìn)肝糖原儲(chǔ)存。在本試驗(yàn)中，與NP組相比，在低蛋白水平日糧中添加CA顯著提高了盲腸和結(jié)腸中嚴(yán)格梭菌屬_1、毛螺菌科NK4A136群、克里斯滕森菌科R7群、瘤胃菌科_UCG-014、瘤胃菌科NK4A214群等屬水平物種的相對(duì)豐度。其中，毛螺菌科廣泛存在于哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)，通常均被認(rèn)為是有益菌，能夠發(fā)酵纖維素產(chǎn)生SCFAs(如丁酸)，SCFAs能夠降低腸道pH，阻止有害微生物增殖，維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)，同時(shí)還可以抑制炎癥性結(jié)腸炎。本研究中毛螺菌科比例提高，可能是由于低蛋白水平日糧營(yíng)養(yǎng)成分中淀粉的含量明顯增加，因此可供毛螺菌科代謝的底物增多。

核黃素(Riboflavin)，又稱維生素B，廣泛參與生物體內(nèi)生物氧化與能量代謝，與碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸和脂肪的代謝有關(guān)，可提高機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的利用率，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明豬在生長(zhǎng)期核黃素缺乏會(huì)降低豬的日增重和抗氧化能力。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，低蛋白水平日糧添加CA組后腸中均檢測(cè)出差異代謝物核黃素，且都表現(xiàn)為顯著上調(diào)，對(duì)差異代謝物進(jìn)行的代謝通路分析也都富集在核黃素代謝通路上，這表明低蛋白水平日糧添加CA顯著影響了核黃素的代謝，核黃素表達(dá)量上調(diào)進(jìn)而影響了其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程，促進(jìn)了機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在低蛋白水平日糧中添加CA，顯著提高了斷奶仔豬后腸微生物群落的豐富度，對(duì)微生物群落的多樣性沒(méi)有顯著影響；在門水平上，顯著提高了后腸中厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度，降低了變形菌門的相對(duì)豐度；在屬水平上，顯著提高了后腸中互營(yíng)球菌屬、嚴(yán)格梭菌屬1、毛螺菌科NK4A136群、克里斯滕森菌科R7群、瘤胃菌科_UCG-014、瘤胃球菌科NK4A214群等菌屬的相對(duì)豐度，降低了鏈球菌屬和埃希氏-志賀菌屬等菌屬的相對(duì)豐度。此外，在低蛋白水平日糧中添加CA顯著影響了后腸中代謝物組成結(jié)構(gòu)。差異代謝物分析表明，低蛋白水平日糧添加CA主要影響了核黃素代謝通路。