楊 莉， 李 坪， 吳海鷹， 楊方林， 楊怡然， 揭 娟， 錢傳云

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是急診常見損傷相關(guān)性疾病[1]，世界范圍內(nèi)每年有約5000萬人罹患TBI[2]，占用大量寶貴的急診醫(yī)療資源。TBI的原發(fā)性損傷不可逆轉(zhuǎn)[3]，繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡是TBI病理生理機制和潛在的治療靶點[4]，減少神經(jīng)元死亡是治療TBI繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵策略之一。有研究針對氧化應(yīng)激、凋亡和自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡對TBI進(jìn)行干預(yù)，而取得的成就有限，TBI的臨床治療依然是一個待攻克的難點[5]。鐵死亡是新近提出的程序性細(xì)胞死亡方式，有研究[6-7]表明，鐵死亡可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病密切相關(guān)，但關(guān)于鐵死亡在TBI中，尤其是自由落體損傷性TBI中的作用及價值，目前研究還很少。鐵死亡(Ferroptosis)以特征性形態(tài)學(xué)及生物學(xué)改變有別于其他類型的程序性細(xì)胞死亡，其特征有細(xì)胞膜破裂、線粒體萎縮、ROS含量升高和鐵離子聚集等[8]。雖然目前關(guān)于鐵死亡分子機制的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但鐵死亡在TBI繼發(fā)性損傷中的具體過程、相關(guān)機制仍然不清楚。本研究采用改良Feeney自由落體法建立大鼠TBI模型[9]，通過普魯士藍(lán)(Perl′s)染色、透射電鏡、熒光定量PCR、轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析等方法，探索鐵死亡在大鼠TBI中的發(fā)生，篩選與鐵死亡密切相關(guān)的基因，以期進(jìn)一步完善TBI的病理生理機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，年齡8～12周。實驗方案通過昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(kmmu2021148)，實驗過程嚴(yán)格遵照實驗動物倫理要求，最大限度地減輕動物的痛苦。

1.2動物模型制備與分組 將SD大鼠隨機分為對照組(Sham組)和TBI組(每組n=15)，其中每組3個樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，3個樣本制備組織切片進(jìn)行Perl′s染色，3個樣本進(jìn)行透射電鏡檢測，6個樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測。根據(jù)改良Feeney自由落體法制備重型TBI大鼠模型[9]。使用七氟烷吸入聯(lián)合10%水合氯醛(280 mg/kg)腹腔注射麻醉，頭部備皮后固定于腦立體定位儀，消毒后取正中切口，切開頭皮，分離至右側(cè)顱骨完整暴露，以冠狀縫后3 mm、矢狀縫右3 mm為圓心，鉆一直徑約5 mm的骨窗，從25 cm高度將40 g砝碼自由落下，打擊腦組織，隨后止血、縫合。Sham組只開骨窗，不做自由落體損傷。造模完成后將大鼠置于溫箱復(fù)蘇，再放回更換有新墊料的籠中飼養(yǎng)。

1.3Perl′s染色 將切片放入二甲苯20 min×2次，無水乙醇5 min×2次，75%乙醇5 min，隨后蒸餾水洗3遍。擦干水分后放入染液中染色約30 min，隨后蒸餾水洗2遍。擦干水分后在組織上滴DAB 顯色液，染色5～10 min，顯微鏡下觀察控制顯色程度，染色結(jié)束后傾去染液用0.01 mol/L的PBS 溶液浸洗切片1次，蒸餾水洗3次。使用蘇木素染核 1 min，隨后自來水沖去染液，將切片放入鹽酸酒精中分化30 s，隨后放入氨水中返藍(lán)。最后，切片放入無水乙醇脫水5 min×3次，二甲苯浸洗切片5 min×2次，使其透明。封片，待干燥后鏡檢分析。

1.4透射電鏡掃描 TBI致傷24 h后大鼠腦組織活體取材(每組n=3)，將損傷周圍皮質(zhì)用鋒利的刀片修整為1 mm3的組織塊，保存于電鏡固定液中，后續(xù)檢測委托武漢賽維爾生物科技有限公司完成。

1.5差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 TBI大鼠致傷24 h后取損傷區(qū)域周圍皮質(zhì)(每組n=3)，轉(zhuǎn)錄組測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，得到的數(shù)據(jù)集命名為自有數(shù)據(jù)集。對數(shù)據(jù)集進(jìn)行質(zhì)量控制、匹配、量化和標(biāo)準(zhǔn)化，得到mRNA表達(dá)矩陣，使用“edgeR”軟件包，將篩選閾值設(shè)定為P<0.05，篩選出TBI組中差異表達(dá)的mRNA。

1.6公共數(shù)據(jù)集獲取 從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載GSE111452數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含TBI后24 h及Sham組大鼠頂葉皮質(zhì)測序數(shù)據(jù)各4個，在GPL2740平臺上生成測序數(shù)據(jù)，與自有數(shù)據(jù)集結(jié)果進(jìn)行比對分析，得到共有DEGs。

1.7鐵死亡相關(guān)基因獲取 從Ferrdb數(shù)據(jù)庫(http://www.zhounan.org/ferrdb/)獲取鐵死亡相關(guān)基因，與共有DEGs進(jìn)行比對分析。

1.8熒光定量PCR 取TBI組和Sham組大鼠損傷周圍腦組織樣本(每組n=6只)，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄完成后配置擴增體系，設(shè)置參數(shù)如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s(共40個循環(huán))；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。反應(yīng)完成后，以GAPDH的Ct值為參照，采用2-△△Ct法計算每個基因的相對表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計分析。研究中使用的引物見表1。

表1 本研究中使用的引物列表

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Graphpad Prism 8.3.0軟件。使用差異倍數(shù)和P值篩選組間差異表達(dá)的mRNAs，將差異倍數(shù)對數(shù)的絕對值≥1且P<0.05 作為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，對差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行聚類分析，并繪制聚類熱圖。兩組間DEGs的mRNA表達(dá)水平使用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TBI大鼠腦組織神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡 Perl′s染色結(jié)果顯示，TBI組大鼠腦組織損傷周圍皮質(zhì)鐵沉積情況較Sham組明顯。透射電鏡掃描結(jié)果顯示，Sham組中，神經(jīng)元線粒體形態(tài)及體積正常，膜連續(xù)性好，內(nèi)嵴顯示清晰。TBI組大鼠腦組織神經(jīng)元的線粒體萎縮變小，基質(zhì)顏色較深，膜增厚致密度高，部分外膜模糊并破損，伴有內(nèi)嵴擴張、減少，提示TBI組大鼠腦組織神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡。見圖1。

注：A為Perl′s染色顯示大鼠腦組織損傷周圍區(qū)域皮質(zhì)鐵沉積情況，白色箭頭所示為鐵沉積區(qū)域(標(biāo)尺：40×為1 mm，400×為100 μm)；B為透射電鏡掃描顯示大鼠腦組織損傷周圍皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡；紅色方框標(biāo)識觀察區(qū)域M為線粒體(標(biāo)尺：低倍為1 μm，高倍為5 μm)；Sham組為對照組，TBI組為創(chuàng)傷性腦損傷組

2.2基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和公共數(shù)據(jù)集分析TBI大鼠腦組織中DEGs 將TBI組和Sham組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、比對，共發(fā)現(xiàn)2786個DEGs，其中1426個為上調(diào)基因，1360個為下調(diào)基因。在GEO數(shù)據(jù)庫查詢到GSE11452數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包括4個TBI樣本和4個Sham樣本，為重型TBI后24 h大鼠頂葉皮質(zhì)組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果。在GSE11452數(shù)據(jù)集中，以P<0.05為差異表達(dá)基因篩選依據(jù)，發(fā)現(xiàn)TBI組中共有2552個DEGs，其中1110個上調(diào)基因，1442個下調(diào)基因。將轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與GSE11452取交集，共得到241個共有DEGs，其中135個為上調(diào)基因，106個為下調(diào)基因。見圖2。

注：A為轉(zhuǎn)錄組測序DEGs熱圖；B為GSE111452中DEGs熱圖；C為轉(zhuǎn)錄組測序的DEGs和GSE111452中DEGs取交集的結(jié)果

2.3DEGs與鐵死亡相關(guān)基因交集分析 將241個共有DEGs與鐵死亡相關(guān)基因(來自FerrDb數(shù)據(jù)庫，http://www.zhounan.org/ferrdb/index.html)取交集，發(fā)現(xiàn)4個共有DEGs同時也為鐵死亡調(diào)控基因(見圖3)，分別為Slc7a5、Fancd2、Rb1和Pebp1。

圖3 TBI大鼠腦組織中DEGs與鐵死亡基因取交集的結(jié)果

2.4熒光定量PCR驗證與鐵死亡相關(guān)DEGs mRNA表達(dá) 通過熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)與測序結(jié)果一致，TBI組中Slc7a5和Rb1 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，F(xiàn)ancd2 mRNA表達(dá)量也上調(diào)，但與Sham組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Pebp1 mRNA在TBI腦組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)。見圖4。

圖4 兩組大鼠與鐵死亡相關(guān)的DEGs mRNA表達(dá)量統(tǒng)計

3 討論

鐵死亡的概念[10]于2012年提出，目前，雖然鐵死亡的確切病理和生理功能還在研究中，但鐵死亡在人類疾病中的作用已經(jīng)確定。大量研究[11]表明，通過抑制或刺激這種獨特的細(xì)胞死亡方式可能對某些疾病產(chǎn)生顯著的臨床益處。本研究已證明，鐵死亡參與了TBI的繼發(fā)性損傷過程。有學(xué)者[12]發(fā)現(xiàn)，TBI小鼠模型腦組織中出現(xiàn)鐵沉積現(xiàn)象，并且與鐵死亡相關(guān)的基因表達(dá)被上調(diào)；另一項研究[13]則發(fā)現(xiàn)，HT22神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型和小鼠TBI模型中均出現(xiàn)鐵死亡。本研究結(jié)果與此一致，大鼠遭受TBI后24 h內(nèi)腦組織即出現(xiàn)顯著鐵沉積現(xiàn)象，同時透射電鏡發(fā)現(xiàn)，線粒體萎縮，膜結(jié)構(gòu)破損及內(nèi)嵴減少等典型的鐵死亡形態(tài)學(xué)特征變化，證實鐵死亡與TBI的病理生理過程密切相關(guān)。

細(xì)胞死亡是TBI患者遺留神經(jīng)功能障礙的主要原因之一，同時也是TBI后發(fā)生退行性疾病的關(guān)鍵驅(qū)動因素，本研究結(jié)果表明，調(diào)控鐵死亡或許是未來TBI治療方法的研究方向之一。雖然文獻(xiàn)已證實鐵死亡參與了多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但具體機制，尤其是鐵死亡在TBI中的機制研究較少。目前，關(guān)于鐵死亡的機制研究主要圍繞半胱氨酸和谷胱甘肽代謝，以及磷脂過氧化物酶GPX4阻止過氧化脂質(zhì)積聚等方面[14]，相關(guān)的分子標(biāo)志物則有鐵轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)分子FTH1、細(xì)胞色素p450還原酶[15-16]等。此外，在腫瘤模型中，p53和Nrf2介導(dǎo)的信號通路還可以通過Slc7a11干擾氨基酸轉(zhuǎn)運誘導(dǎo)鐵死亡[17]。

本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析的方法發(fā)現(xiàn)，鐵死亡相關(guān)基因Slc7a5、Fancd2和Rb1在TBI組高表達(dá)，Pebp1則低表達(dá)。Slc7a5是溶質(zhì)載體(solute carrier, SLC)是家族成員之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要存在于血腦屏障(BBB)內(nèi)皮細(xì)胞，負(fù)責(zé)氨基酸、甲狀腺激素的轉(zhuǎn)運，影響神經(jīng)細(xì)胞生長[18]。Slc7a5突變可能與運動、社交和語言功能發(fā)育遲緩有關(guān)，出現(xiàn)自閉癥樣癥狀和癲癇[19]。有研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，敲除Slc7a5使顆粒細(xì)胞胞體萎縮，軸突分枝變少，甚至細(xì)胞死亡，說明Slc7a5對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與修復(fù)至關(guān)重要。本研究中，Slc7a5在TBI后顯著上調(diào)，是否與BBB被破壞，內(nèi)皮細(xì)胞中的Slc7a5大量釋放有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。Fancd2是DNA損傷修復(fù)相關(guān)核蛋白，文獻(xiàn)[22]證實, Fancd2保護骨髓基質(zhì)細(xì)胞免受鐵死亡所致的損傷，F(xiàn)ancd2缺乏使細(xì)胞對鐵死亡更敏感，提示Fancd2在骨髓瘤中是一種鐵死亡抑制性因子。此外，F(xiàn)ancd2高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌和膀胱癌預(yù)后不良相關(guān)[23-24]，但Fancd2如何調(diào)控TBI后腦組織鐵死亡，目前文獻(xiàn)[25]較少。Rb1可以負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期，Rb1缺失導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌耐藥，可能與鐵死亡有關(guān)。本研究中TBI組Rb1 mRNA表達(dá)上調(diào)，可能參與鐵死亡的發(fā)生。Pebp1是一種蛋白激酶級聯(lián)的支架蛋白抑制劑，通過調(diào)控脂質(zhì)過氧化物的生成觸發(fā)鐵死亡[26]。支持Jiao等[27]發(fā)現(xiàn)，中成藥逍遙散通過Pebp1/Gpx4途徑調(diào)控小鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡，說明上調(diào)Pebp1能夠減輕神經(jīng)元鐵死亡。本研究結(jié)果中TBI組Pebp1表達(dá)水平下降，從而誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)一致。

本研究通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)分析的方法，證實TBI大鼠腦組織發(fā)生鐵死亡，鐵死亡的發(fā)生可能與腦組織中Slc7a5、Fancd2、Rb1和Pebp1基因表達(dá)譜的改變密切相關(guān)，豐富了TBI的病理生理過程。