周佳崢, 郭永軍, 全 峰, 梁 健, 李永仁, 黃亞冬, 梁 爽

不同水交換量下皺紋盤鮑轉(zhuǎn)錄組測序與分析

周佳崢1, 郭永軍1, 全 峰1, 梁 健1, 李永仁1, 黃亞冬2, 梁 爽1

(1. 天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院, 天津 300380; 2. 天津市海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司, 天津 300270)

養(yǎng)殖過程的循環(huán)水交換量能夠顯著影響皺紋盤鮑()的生理狀態(tài), 進而影響其養(yǎng)殖存活率和生長率, 然而不同循環(huán)水量對于皺紋盤鮑的生理狀態(tài)影響的分子機制尚不明確。本實驗以皺紋盤鮑()為研究對象, 將鮑分別置于循環(huán)水交換頻率為1次/d、2次/d、4次/d的條件下(編號為C0、T2和T4組)暫養(yǎng)3 d, 然后利用Illumina Hiseq 2500 技術(shù)測定不同處理組鮑魚的肌肉組織中轉(zhuǎn)錄組表達情況。結(jié)果表明, 單次換水組(C0)和多次換水組(T2和T4)間差異表達的基因個數(shù)較多, 分別為4 095和3 617個, 而T2與T4組之間的差異表達基因個數(shù)則較少, 僅為232個。對差異表達基因進行GO和KEGG功能分析顯示, 單次換水組(C0)和多次換水組(T2和T4)間差異表達的基因主要集中在能量代謝和免疫反應相關(guān)通路或基因, 隨機選取10個差異基因進行熒光定量PCR驗證, 定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果一致, 證實了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。本研究說明了更高的水交換量下, 鮑的代謝和免疫相關(guān)通路被激活, 可能有助于鮑魚維持較好的生理和免疫狀態(tài), 從而表現(xiàn)出更好的生長、存活等表型。

皺紋盤鮑; 水交換量; 轉(zhuǎn)錄組; 能量代謝; 免疫

在水產(chǎn)生物養(yǎng)殖過程中, 水交換量對養(yǎng)殖生物的生理狀態(tài)有顯著影響。通常情況下, 水交換量的增加能夠改善生物的生長和存活等狀態(tài)[1-2]。例如, 在皺紋盤鮑幼鮑的養(yǎng)殖過程中, 當水交換量率由流水、24 h/次、48 h/次和72 h/次逐漸降低時, 幼鮑的存活率和增重率也隨之下降[3]。提高水交換量被認為能夠顯著減少養(yǎng)殖生物在攝食、排泄等過程中產(chǎn)生的氨氮、亞硝酸鹽等自污染因子的濃度, 同時提高溶解氧、透明度等指標, 從而使水生生物維持一個較好的生理狀態(tài), 最終改善其生長、存活情況等[4-5]。例如, 研究換水頻率對刺參養(yǎng)殖水質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn), 日換水率由0、10%、20%、30%、100%逐步提高時, 刺參養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽的濃度逐漸降低[2]; 當換水頻率為10 d/月時, 則能維持優(yōu)良的刺參池塘養(yǎng)殖環(huán)境[6]。

轉(zhuǎn)錄組分析能夠了解特定條件下生物體內(nèi)不同基因的表達情況, 從而解析生物在生長發(fā)育過程中或外界環(huán)境因子影響下, 其體內(nèi)的生長發(fā)育、抗逆應激等相關(guān)基因的反應情況[7-9], 目前已被廣泛用于研究水產(chǎn)動物的生理功能(如水產(chǎn)動物毒理學、發(fā)育生物學、系統(tǒng)進化生物學等)及免疫功能(包括病毒病、細菌病、寄生蟲病免疫生物學)等研究[10-11]。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在研究水體自污染物質(zhì)(氨氮、亞硝酸鹽等)對水產(chǎn)動物的脅迫效應時也有應用[12]。例如, 氨氮脅迫下的日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示, 脅迫前后有887個基因呈差異性表達, 且主要富集在16條免疫相關(guān)通路中, 如補體和凝血級聯(lián)、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路與B細胞受體等通路[13]。

本課題組過去的研究發(fā)現(xiàn), 水交換量的變化能夠顯著影響皺紋盤鮑的成活率、攝食率和耗氧率情況, 具體表現(xiàn)為: 隨著水交換量由1次/d提升到4次/d, 鮑的存活率和攝食量均逐漸提高; 且隨著水交換量的提高, 鮑的耗氧率逐漸降低, 1次換水組的鮑耗氧率(0.47±0.05) mg/(g·h)顯著高于4 次換水組(0.37±0.05) mg/(g·h); 相應地, 1次換水組的水體溶解氧量則小于4次換水組。此外, 水交換量提升降低了鮑養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸氮等自污染因子的濃度[14]。然而, 水交換量變化影響鮑生理狀態(tài)的分子機制尚不明晰。本文擬采用轉(zhuǎn)錄組測序的手段, 研究皺紋盤鮑在不同水交換量的條件下, 其肌肉組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄本表達變化, 以闡明不同水交換量對于皺紋盤鮑的生理狀態(tài)影響的分子機制, 為皺紋盤鮑養(yǎng)殖條件的優(yōu)化提供理論支撐, 為貝類健康生態(tài)養(yǎng)殖的理論奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的皺紋盤鮑, 引自福建晉江某養(yǎng)殖公司。殼長(2.24±0.30) cm, 殼寬(1.44±0.21) cm, 殼高(1.32±0.19) cm。低溫空運至天津。實驗前進行7 d的暫養(yǎng), 暫養(yǎng)條件為鹽度33、pH 7.8、溫度(24±1) ℃。暫養(yǎng)期間按皺紋盤鮑體質(zhì)量的1%投喂鮑配合飼料。暫養(yǎng)期間每天早晚全量換水, 并及時清除死鮑以及殘餌糞便, 實驗前24 h暫停投喂餌料。

1.2 方法

1.2.1 不同水交換量處理

試由上述馴養(yǎng)的群體中, 隨機取180只皺紋盤鮑, 平均分成3組, 平均分配于9個100 L的PVC養(yǎng)殖箱中, 按換水頻率分為1次每天組、2次每天組、4次每天組(每天全量換水1次、2次、4次, 每組3個平行), 每個換水組實驗持續(xù)3 d, 實驗期間無鮑魚死亡。

1.2.2 樣品取樣

換水實驗結(jié)束后, 從每個換水處理組中的PVC整理養(yǎng)殖箱中各取9只鮑(每個平行箱3只), 對其進行肌肉組織的取樣: 使用已滅菌并去除RNA酶的剪刀、鑷子剪取100 mg左右的肌肉組織, 放入干凈的凍存管中, 然后迅速放入液氮中速凍, 之后轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱保存。

1.2.3 RNA提取

對保存的組織進行液氮研磨, 充分研磨后使用Trizol法[15]提取各換水組鮑魚肌肉組織的總RNA。對每個換水組的9個RNA樣品進行三三等量混合, 每組建立3個平行RNA混合樣品。各混樣總RNA利用Aligent 2000、Nanodrop、瓊脂糖凝膠電泳3種方法進行濃度及純度檢測。1次每天組、2次每天組、4次每天組的混合樣本分別標記為C0、T2和T4。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

轉(zhuǎn)錄組的建庫及測序工作委托北京百邁克生物科技有限公司完成, 每個換水組的鮑建立3個平行的轉(zhuǎn)錄組測序文庫(共建庫9個)并進行測序Illumina 2000雙端建庫測序。獲得原始測序序列(Sequenced reads)后, 進行以下生物信息學分析: Clean Data的分析; Unigene的拼接和功能注釋; Unigene功能注釋, 包括與NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫的比對進行; Unigene庫基因結(jié)構(gòu)分析主要包括SSR分析、CDS預測和SNP分析; 不同樣品中的基因進行基于FPKM的表達量分析; 基于基因在不同樣品中的表達量, DEseq識別鑒定差異表達基因; 對差異表達基因進行模式聚類、GO功能注釋以及KEGG富集分析。

1.2.5 熒光定量PCR驗證

從轉(zhuǎn)錄組結(jié)果里隨機選取10個差異基因進行qRT-PCR驗證, 根據(jù)所挑選的差異表達基因的序列, 遵循引物設(shè)計的原則, 使用引物設(shè)計軟件Beacon designer 7設(shè)計兩對定量引物。經(jīng)標準曲線法測定引物的擴增效率, 保證各定量引物的擴增效率類似, 且在95%～105%范圍內(nèi)。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板, β-actin基因為內(nèi)參[16], 在熒光定量PCR儀上進行定量PCR反應。反應體系包括: 1 μL的cDNA模板(10倍稀釋), 各1 μL的上下游引物(10pmol L-1), 10 μL的2×DNAmo ColorFlash Master Mix(Thermo, USA), 以及8 μL的滅菌超純水。反應程序設(shè)置為: 95 ℃ 7 min, (95 ℃ 20 s, 60 ℃ 60 s)×35, 72 ℃ 10 min, 每個反應后均檢查熔解曲線以確保產(chǎn)物單一性, 每個反應均設(shè)置3個重復。

2 結(jié)果與分析

對9個樣品進行Illumina 2000雙端建庫測序, 共得到207 435 516條原始測序序列, 測序正確率高達99.9%。對原始測序序列進行質(zhì)量篩選, 即截除Reads中的測序接頭、引物序列和低質(zhì)量值數(shù)據(jù)等, 共獲得61.81 Gb Clean data, 其中各樣品GC含量在46.60%～ 47.76%之間, Q30堿基百分比不小于94.39%, 表明測序數(shù)據(jù)完整性好, 質(zhì)量高(表1)。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

將得到的所有Unigene序列分別與七個數(shù)據(jù)庫對比, 比對結(jié)果如表2所示, 可知在COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、eggNOG七個數(shù)據(jù)庫中成功注釋的Unigene數(shù)量分別為6 518、7 750、9 116、12 139、15 772、11 014、16 863, 最終總共獲得20 480個至少在一個數(shù)據(jù)庫中有注釋信息的Unigene。其中長度大于等于1 000的Unigene數(shù)為16 025個, 長度介于300至1 000之間的Unigene數(shù)為4 455個。

表2 Unigene注釋統(tǒng)計

利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson’s correlation coefficient)對樣品間相關(guān)性的指標評估。如圖1所示, C0、T2、T4各組的生物學重復文庫之間的相關(guān)性均較高(2均大于0.98), 而C0和T2, C0和T4的樣品文庫之間的相關(guān)性則較低(2均小于0.25)。

圖1 樣品的相關(guān)性熱圖

如表3所示, C0和T2、C0和T4、T4和T2的差異表達基因數(shù)目分別為4 095、3 617、232, 且1次換水組與多次換水組間(C0和T2和C0和T4)的差異表達基因中, 上調(diào)基因的數(shù)目明顯小于下調(diào)基因的數(shù)目。

表3 差異表達基因數(shù)目

分別將單次換水組(C0)和多次換水組(T2和T4)的差異表達基因進行GO功能注釋, 按照GO三大類型再次進行分類, 共分為52個功能亞類, 如圖2所示, C0和T2和C0和T4的差異表達基因所注釋到的GO類群比較相似: 在生物學過程分類下, 主要富集在細胞學過程(cellular process)、定位(localization)、代謝過程(metabolic process)和單生物進程(single-organism process)等功能; 在細胞組分分類下, 主要富集在細胞(cell)、細胞部分(cell part)、細胞膜部分(membrane part)和細胞膜部分(membrane)等功能; 在分子功能中, 主要富集在催化活性(catalytic activi-ty)、附著(bin-ding)和運輸活性(transporter activity)等功能。

分別將單次換水組(C0)和多次換水組(T2和T4)的差異表達基因進行KEGG功能注釋, 以此獲知不同換水組之間的差異基因可能參與的生理生化代謝通路。結(jié)果如圖3所示, C0和T2的差異表達基因主要顯著富集于淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose meta-bolism), 溶酶體(lysosome), 糖胺聚糖降解(glycosa-minoglycan degradation), 戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化(pentose and glucuronate interconversions), 氨基酸和核苷酸糖的代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)等通路, C0和T4的差異表達基因主要顯著富集于淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism), 溶酶體(lysosome), 糖胺聚糖降解(gly-cosa-mi-no-glycan degradation), 半乳糖代謝(galactose meta-bolism), 氨基酸和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)等通路。

根據(jù)FPKM(表達量)值, 選取不同水交換量處理組之間差異表達最顯著的基因, 對其表達量及NR注釋信息進行分析、篩選和統(tǒng)計, 結(jié)果如表4和表5所示, 在C0和T2差異表達最顯著基因中, 與生物消化代謝(胰蛋白酶trypsin等)與組織構(gòu)成(透明質(zhì)蛋白perlucin, 黏液相關(guān)蛋白mucus-associated protein, 肌球蛋白myosin heavy chain等)等功能相關(guān)的基因顯著在多次換水組T2和T4中上調(diào)表達, 而在1次換水組C0中表達量較低; 而透明質(zhì)素樣蛋白(perlucin-like protein)海藻酸裂解酶(alginate lyase)內(nèi)切葡聚糖酶4樣亞型(endoglucanase 4-like isoform X1)等基因則在多次換水組中表達量較低(表4)。C0和T4差異表達最顯著基因中, 與組織構(gòu)成(睪蛋白testisin等), 生物消化代謝(胰蛋白酶trypsin等), 信號轉(zhuǎn)導(wnt信號通路受體frizzled 1, RyR受體ryanodine receptor-like等)在多次換水組T2和T4中上調(diào)表達, 而在1次換水組C0中表達量較低; 而透明質(zhì)蛋白(perlucin), 纖維素酶(cellulase), 黏蛋白(mucin-5AC-like isoform X3), 內(nèi)切葡聚糖酶(endo-glucanase 14-like)等基因則在多次換水組中表達量較低(表5)。

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫隨機選取10個差異基因進行熒光定量PCR驗證。運用2–ΔΔCt方法對不同水交換量組中的差異表達基因進行相對表達水平定量分析。結(jié)果表示, 選取的10個差異表達基因(Unigene編號c100088, c100118, c100155, c100277, c100299, c100496, c100761, c100829, c100882)在三個換水組鮑中的轉(zhuǎn)錄本表達量(以FPKM的對數(shù)表示)和熒光定量PCR表達量(以倍數(shù)變化FC的對數(shù)表示)一致(圖4), 表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是可靠的。

3 討論

隨著新一代高通分子測序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展與成熟, 轉(zhuǎn)錄組研究在水產(chǎn)生物生理過程機制的研究中愈發(fā)常見, 已有大量研究將轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)應用于水產(chǎn)生物疾病與免疫學研究[17-18], 繁殖和發(fā)育研究[19-20], 毒性和壓力過程研究[21-22], 生長和營養(yǎng)[23-24]等方面。本研究利用高通量測序平臺, 對在三種不同水交換量條件下養(yǎng)殖的皺紋盤鮑的肌肉進行轉(zhuǎn)錄組測序, 得到了質(zhì)量良好、結(jié)果可信的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果數(shù)據(jù)。比較C0和T2、C0和T4與T2和T4數(shù)據(jù), 分別檢測到4 095、3 617、232個差異表達基因, 說明隨著水交換量的增加, 尤其是由1次/d的水交換量提升至2次/d或4次/d時, 顯著改變鮑中相關(guān)基因的表達水平, 說明換水量的增加對鮑的生理生化過程產(chǎn)生了比較明顯的影響, 也印證了使用轉(zhuǎn)錄組的手段研究水交換量對于鮑的生理狀態(tài)的影響機制是可行的。

圖3 差異表達基因京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路富集散點圖

Fig. 3 Scatter diagram of the differentially expressed genes enriched in the KEGG pathways

表4 1次換水組和2次換水組差異表達最顯著基因功能和表達量

表5 1次換水組和4次換水組差異表達最顯著基因功能和表達量

圖4 熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)驗證結(jié)果

注: FC: 定量PCR差異倍數(shù); FPKM: 轉(zhuǎn)錄組表達量

本研究中, 通過對C0組和T2、T4組的差異表達基因進行GO和KEGG富集分析, 發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集到了與消化和代謝相關(guān)的基因通路上, 如淀粉和蔗糖代謝, 糖胺聚糖降解, 戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化, 氨基酸和核苷酸糖的代謝, 半乳糖代謝等通路。在對不同換水組之間的差異表達最顯著的基因進行功能分析時, 同樣發(fā)現(xiàn)了許多基因的功能屬于消化、代謝類, 如胰蛋白酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維素酶等。結(jié)合我們過去的研究, 在投喂顆粒狀飼料的鮑養(yǎng)殖水體中, 1次換水組、2次換水組、3次換水組、4次換水組的水體中的氨氮含量分別為(1.46±0.42) mg/L、(0.93±0.59) mg/L、(0.46± 0.11) mg/L、(0.39±0.26) mg/L[14]。說明了換水量的提高很有可能通過改善水質(zhì), 提升了鮑魚機體對于營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收效率。類似地, 日本沼蝦在應對不同濃度的氨氮脅迫時, 其糖酵解相關(guān)通路、蛋白質(zhì)消化和吸收相關(guān)通路也會發(fā)生相應的變化[13], 說明水生生物在水質(zhì)變化時, 其消化代謝相關(guān)生理過程的活性會發(fā)生變化, 從而從能量供給的角度幫助機體應對由水質(zhì)變化帶來的不利影響。

此外, 我們發(fā)現(xiàn)溶酶體相關(guān)通路和基因在不同換水組鮑中有顯著的變化。溶酶體是無脊椎動物免疫系統(tǒng)中一個關(guān)鍵性的酶復合體, 由多種抗體、受體和酶成分組成, 包括溶酶體酶、凝集素、抗菌肽等體液免疫因子, 它以殺菌、促進吞噬等方式參與貝類的免疫防御[25-26]。有研究表明, 皺紋盤鮑體內(nèi)的溶酶體凝集素能夠參與對外源病原的識別和消滅過程[27]。雜色鮑的溶酶體酚氧化酶活性在注射副溶血弧菌菌液24 h后顯著增加, 且顯著受到其他外部環(huán)境因子如溫度和溶解氧的影響[28-29]。結(jié)合本實驗的結(jié)果, 說明了不同水交換量不僅能夠影響皺紋盤鮑的消化代謝功能, 而且可能通過影響其溶酶體相關(guān)的免疫系統(tǒng)功能, 從而影響皺紋盤鮑整體的免疫生理狀態(tài), 最終使得鮑表現(xiàn)出更好的生理狀態(tài)。

4 結(jié)論

本文研究了不同循環(huán)水交換量對皺紋盤鮑()轉(zhuǎn)錄組表達的影響, 研究結(jié)果證實了不同水交換頻率下, 鮑魚的肌肉轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)顯著的差異性表達。這些差異表達的基因主要功能為能量代謝或免疫反應相關(guān), 預示更高的水交換量可能對皺紋盤鮑代謝和免疫相關(guān)通路的激活有利, 未來應進一步聚焦代表性差異表達基因的具體生物學功能。

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Sequencing and analysis of thetranscriptome under different water exchange rates

ZHOU Jia-zheng1, GUO Yong-jun1, QUAN Feng1, LIANG Jian1, LI Yong-ren1, HUANG Ya-dong2, LIANG Shuang1

(1. Fisheries College, Tianjin University of Agriculture, Tianjin 300380, China; 2. Tianjin Haisheng Aqua-cu-l-ture Limited Company, Tianjin 300270, China)

The rate of circulating water exchange can remarkably affect the physiology of abalone, including survival and growth. However, the molecular mechanism of this effect is unclear. In this study, abalones were placed under a circulating water exchange frequency of 1, 2, or 4 times/day (called C0, T2, and T4, respectively) for 3 days. Illumina Hiseq 2500 technology was used to investigate the transcriptome expression in the muscle tissues of abalone from the different water exchange groups. The results showed that many differentially expressed genes were detected between the single water exchange group (C0) and the multiple water exchange groups (T2 and T4), such as 4, 095 and 3, 617, respectively, while the number of differentially expressed genes between the T2 and T4 groups was relatively small at 232. The GO and KEGG functional analyses showed that the differentially expressed genes between the single water exchange group (C0) and the multiple water exchange group (T2 and T4) were mainly classified into energy metabolism and immune response-related pathways or genes. Ten differentially expressed genes were selected for verification by fluorescence quantitative polymerase chain reaction, and the results were consistent with the transcription profile results, confirming the reliability of the transcriptome sequencing results. This study shows that metabolism and the immune-related pathways of abalone were activated under the higher water exchange rate, which may help abalone maintain better physiological and immune status, thus leading to better growth, survival, and other phenotypes.

; water exchange rate; transcriptome; energy metabolism; immunity

Oct. 3, 2020

S966.9

A

1000-3096(2022)12-0159-10

10.11759/hykx20201003001

2020-10-03;

2020-11-09

天津市種業(yè)科技重大專項(19ZXZYSN00080); 天津市自然科學基金(18JCQNJC84500); 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室開放基金(GDKLHSA0806); 2020年天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(202010061010); 2020年現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS49)

[Tianjin Seed Industry Science and Technology Major Project No. 19ZXZYSN00080; Tianjin Natural Science Foundation, No. 18JCQNJC84500; Guangdong Key Laboratory of Aquatic Health and Safety Aquaculture Open Fund, No. GDKLHSA0806; Tianjin University Student Innovation and Entrepreneurship Project in 2020, No. 202010061010; Modern Special Fund for Construction of Agricultural Industrial Technology System, No. CARS49]

周佳崢(1999—), 男, 本科生, 水產(chǎn)養(yǎng)殖學專業(yè), E-mail: 3055912470@qq.com; 梁爽(1989—), 男,通信作者, 博士, 講師, 主要從事貝類養(yǎng)殖生理生態(tài)研究, E-mail: shuangliang@tjau.edu.cn

(本文編輯: 楊 悅)