賈久滿, 粟雙婷, 黃慧靈, 黃鴻期, 唐 冬, 周 琦, 余柳俊, 陳金文, 賈玉珍, 韋莉念, 廖永巖

基于鱟試劑生產(chǎn)的中國鱟血液質(zhì)量監(jiān)測方法研究

賈久滿, 粟雙婷, 黃慧靈, 黃鴻期, 唐 冬, 周 琦, 余柳俊, 陳金文, 賈玉珍, 韋莉念, 廖永巖

(廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室 北部灣大學海洋學院, 廣西 欽州 535011)

為了研究中國鱟血液質(zhì)量的監(jiān)測方法, 實驗選擇9只中國鱟檢測其血液中銅含量、血細胞數(shù)量、血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指標, 并進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明, 中國鱟血液中銅含量與血細胞數(shù)相關(guān)性=0.917, 與血漿蛋白含量相關(guān)性=0.995, 與血淋巴蛋白含量相關(guān)性=0.983, 均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性。中國鱟血液中銅含量與血細胞數(shù)的相關(guān)關(guān)系為1=6.14+0.86(2=0.840), 與血漿蛋白含量的相關(guān)關(guān)系為2=2.08+0.78(2=0.989), 與血淋巴蛋白含量的相關(guān)關(guān)系為3=1.87+0.62(2=0.966)。中國鱟血液中銅含量不但能夠直接反映血藍蛋白的含量, 而且可以反映血細胞數(shù)、血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量。因此, 以中國鱟血液中銅含量作為監(jiān)測血液質(zhì)量的指標, 可以推動中國鱟可持續(xù)采血技術(shù)的發(fā)展與完善, 對中國鱟的利用與保護具有重要意義。

中國鱟; 血液質(zhì)量; 監(jiān)測方法; 銅含量

鱟(Horseshoe crab), 隸屬于節(jié)肢動物門(Arfh-ro-poda)、肢口綱(Merostomata)、劍尾目(Xiphosura), 世界上只有中國鱟和美洲鱟可以生產(chǎn)鱟試劑, 所以按來源鱟試劑可分為兩種, 一種是中國鱟試劑(Tachy-pleus amebocyte lysate, 縮寫為 TAL), 原材料為中國鱟血液; 另一種是美洲鱟試劑(Limulus amebocyte lysate, 縮寫為 LAL), 提取自美洲鱟的血液[1]。中國鱟是我國生產(chǎn)鱟試劑重要的海洋藥用生物資源。目前采集鱟血比較常規(guī)的方式主要是人們趁著鱟靠近海岸交配時將其捕獲, 采集1/5～1/3的血量, 每只鱟大約采100 mL血液, 采完血的鱟在當天帶到距被捕地大約120 km的地方放生, 防止短時間再次被捕采血。研究顯示適量采血不會影響鱟的生活和生殖能力, 但需要足夠的時間才能使采血鱟恢復(fù)健康[2]。即便在操作較為規(guī)范的美國, 對鱟的生存依然存在較大的影響。研究人員在馬薩諸塞州的海灣針對美洲鱟做了實驗, 采血即便不會致命, 但也會影響美洲鱟活動水平、運動速度和潮汐節(jié)律表現(xiàn), 這些變化可能會干擾美洲鱟的活動以及產(chǎn)卵, 也會讓雌鱟降低交配幾率, 并追蹤到有18%的美洲鱟在采血后死亡。與美洲鱟相比, 中國鱟面臨著更大的威脅, 采血不規(guī)范、放生保護措施不到位、過度取血, 甚至直接把鱟血抽干, 這些殺雞取卵式的采血方法造成很多被采血的中國鱟難逃一死。中國鱟從受精卵至性成熟需要13～15年的時間[3], 種群數(shù)量恢復(fù)緩慢, 由于市場對鱟試劑巨大的需求, 導(dǎo)致中國鱟的種群數(shù)量持續(xù)下降。

中國鱟的一些種群已經(jīng)從它們原來的活動范圍內(nèi)消失了, 包括中國的臺灣、香港、浙江、福建以及日本的海岸線[4-5]。珠江口以北的海域已很難發(fā)現(xiàn)中國鱟, 北部灣海域成為中國鱟最后的棲息地, 但數(shù)量也在快速減少。1990年以前北部灣海域成年中國鱟的數(shù)量可達60～70萬對, 到2000年已降至約30萬對[6]。根據(jù)廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室的調(diào)查, 目前, 廣西北部灣海域成年的中國鱟數(shù)量僅為1萬對左右, 資源幾近枯竭。2019年3月23日, 中國鱟在世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄里的等級從原本的數(shù)據(jù)缺乏(DD)更新為瀕危(EN)[7]。作為瀕危物種, 同時又面對巨大的市場需求, 改變傳統(tǒng)的采血方式, 開展人工養(yǎng)殖條件下的中國鱟可持續(xù)性采血已勢在必行。這就需要把在自然海域捕獲的中國鱟馴養(yǎng)在池塘中, 然后定期定量對鱟進行采血, 并確保鱟的成活率, 提高鱟的利用率, 實現(xiàn)可持續(xù)性多次采血, 從而減少中國鱟的捕獲量, 以保護中國鱟的種群數(shù)量不再減少。

由于中國鱟在養(yǎng)殖與采血過程中會受到氣候、水質(zhì)、攝食等多種因素的影響, 血液的再生與恢復(fù)并非總是一樣的, 如果采血以后中國鱟的血液沒有得到很好的恢復(fù)而繼續(xù)按照原來的計劃定期定量采血, 勢必直接影響到中國鱟的健康甚至造成其死亡。因此, 針對人工養(yǎng)殖條件下的中國鱟可持續(xù)性采血, 亟須建立一種簡便、高效、快捷的基于連續(xù)采血的中國鱟血液質(zhì)量監(jiān)測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中國鱟

把從北部灣海域捕獲的中國鱟暫養(yǎng)在海邊的水塘中2星期, 然后隨機捕撈9只體長30 cm左右、體重300 g左右、年齡大約4～5歲的雄性中國鱟轉(zhuǎn)移至實驗室的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 分別標記為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9。養(yǎng)殖用水取自廣西三娘灣海域的海水, 鹽度25, 養(yǎng)殖溫度26～28 ℃, 每周投喂魚肉2次。

1.1.2 試劑

雙縮脲法蛋白含量檢測試劑盒BC3185: 規(guī)格100管/96樣, 購買自北京索萊寶科技有限公司。

Cu(GSBG62024-90)、Fe(GSBG62020-90)、Zn (GSBG62025-90)、Mn(GSBG62019-90)、Cd(GSB04- 1721-2004)、Cr(GSBG62017-90)、Pb(GSB04-1742-2004)標準溶液: 規(guī)格50 mL, 元素含量1 000 μg/mL購買自國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總部。

抗凝劑: 用茶堿(≥98%)和NaCl配制鹽度25、茶堿物質(zhì)的量濃度0.5 mol/L的溶液作為抗凝劑。

1.2 方法

1.2.1 取樣

中國鱟在實驗室靜養(yǎng)4周后進行取樣, 把中國鱟放入經(jīng)紫外線滅菌的超凈臺內(nèi), 用碘伏消毒液對其背側(cè)胸腹連接處的心門位置消毒處理, 然后用75%的乙醇擦去碘伏。取20 mL的無菌注射器先吸入10 mL的抗凝劑, 用注射針頭從胸腹關(guān)節(jié)處刺入心門, 抽取血液10 mL, 混勻備用。

1.2.2 血細胞計數(shù)

血細胞計數(shù)板及相關(guān)用品180 ℃烘干6 h, 取鱟血樣品經(jīng)抗凝劑稀釋后滴入血細胞計數(shù)板, 在顯微鏡下計數(shù), 重復(fù)3次, 取平均值得中國鱟血細胞數(shù)量(BBC)。

1.2.3 血漿蛋白與血淋巴蛋白的檢測

多功能酶標儀預(yù)熱30 min以上, 調(diào)節(jié)波長至540 nm, 蒸餾水調(diào)零。取中國鱟血樣品1 mL放入經(jīng)滅菌處理的離心管10 000 r/min離心10 min, 按照雙縮脲法蛋白含量檢測試劑盒說明書的要求, 制備空白管、標準管, 用鱟血和血漿分別制備測定管, 每個樣品制備3個測定管, 然后用酶標儀測定并計算蛋白含量, 取3個重復(fù)的平均值, 即為血漿蛋白含量(PPC)。取中國鱟血樣品直接按上述方法檢測, 即為血淋巴蛋白含量(BPC)。

1.2.4 微量元素和重金屬的測定

精確稱取鱟血樣品10 mL, 把樣品放入坩堝中, 在電爐上小火加熱, 炭化至無煙, 轉(zhuǎn)移至馬弗爐中, 500 ℃恒溫灰化5 h, 然后加入適量1︰1的鹽酸溶解后定容至10 mL, 用AA-7000系列原子吸收光譜儀火焰法測定銅元素含量。

1.2.5 統(tǒng)計分析

采用WPS2019表格對實驗數(shù)據(jù)進行整理、統(tǒng)計, 采用SPSS22進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國鱟血液質(zhì)量指標檢測結(jié)果

中國鱟血液質(zhì)量指標檢測結(jié)果見表1, 中國鱟血液中Cu含量為0.94～18.00 mg/L, 平均(8.33±5.82) mg/L; 血細胞數(shù)為2.80×103～22.00×103個/mL, 平均(13.31± 5.46)×103個/mL; 血漿蛋白含量為2.26～15.42 mg/mL, 平均(8.54±4.54) mg/mL; 血淋巴蛋白含量為2.54～ 12.99 mg/mL, 平均(7.07±3.70) mg/mL。

2.2 中國鱟血液質(zhì)量指標相關(guān)性分析

中國鱟血液質(zhì)量指標相關(guān)性與顯著性見表2, 中國鱟血液中銅元素含量、血細胞數(shù)、血漿蛋白含量以及血淋巴蛋白含量等4種血液質(zhì)量指標相互間均呈極顯著相關(guān)。

表1 中國鱟血液質(zhì)量指標檢測結(jié)果(n=9)

表2 中國鱟血液質(zhì)量指標相關(guān)性與顯著性(n=9)

注: **表示相關(guān)性極顯著; —表示不作顯著性分析

2.2.1 血液中銅含量與血細胞數(shù)的相關(guān)關(guān)系

由表1、2和圖1可知, 中國鱟血液中銅含量與血細胞數(shù)呈極顯著相關(guān), 其換算關(guān)系為:

1=6.14+0.86, (1)

式中,1為中國鱟血細胞數(shù)(×103/mL),為中國鱟血液中銅含量(mg/L)。

圖1 中國鱟血液中銅含量與血細胞數(shù)的相關(guān)關(guān)系

2.2.2 血液中銅含量與血漿蛋白含量的相關(guān)關(guān)系

由表1、2和圖2可知, 中國鱟血液中銅含量與血漿蛋白含量呈極顯著相關(guān), 其換算關(guān)系為:

2=2.08+0.78, (2)

式中,2為中國鱟血漿蛋白含量(mg/mL),為中國鱟血液中銅含量(mg/L)。

圖2 中國鱟血液中銅含量與血漿蛋白含量的相關(guān)關(guān)系

2.2.3 銅含量與血淋巴蛋白含量的相關(guān)關(guān)系

由表1、2和圖3可知, 中國鱟血液中銅含量與血淋巴蛋白含量呈極顯著相關(guān), 其換算關(guān)系為:

3=1.87+0.62, (3).

式中,3為中國鱟血淋巴蛋白含量(mg/mL),為中國鱟血液中銅含量(mg/L)。

圖3 中國鱟血液中銅含量與血淋巴蛋白含量的相關(guān)關(guān)系

3 討論

3.1 中國鱟血液質(zhì)量監(jiān)測方法可以推動可持續(xù)采血技術(shù)的發(fā)展與完善

在鱟試劑的研究報道中, 一方面在鱟試劑對內(nèi)毒素的作用機理與鱟試劑的生產(chǎn)等研究領(lǐng)域, 周海鈞報道了鱟試劑對內(nèi)毒素凝集作用的機理, 說明用東方鱟試劑代替常規(guī)的家兔法檢測注射液中的熱原在理論上是可行的[8]。劉端華等報道了東方鱟試劑質(zhì)量和中試工藝的研究[9]。李桂香等開展了鱟試劑法對血液保養(yǎng)液熱原的檢測, 取得良好效果[10]。王志光等建立了一種從商品化中國鱟試劑中快速分離凝固蛋白原的方法[11]。孫萍等比較了鱟試劑法與家兔法測定刺五加注射液熱原, 結(jié)果證明鱟試劑法不僅快速、簡單、準確靈敏, 而且經(jīng)濟方便[12]。羅茵等報道了細菌內(nèi)毒素分析儀利用從東方鱟血液中提取 C因子、G因子和凝固酶原等活性成分, 分別于血液細菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖產(chǎn)生凝聚反應(yīng), 判斷革蘭氏陰性細菌和真菌感染程度, 鱟試劑已成為細菌內(nèi)毒素檢查法的重要試劑[13]。

另一方面, 對于中國鱟的人工養(yǎng)殖與定期采血制取鱟試劑的研究也有部分報道, 吳偉洪等的實驗表明把捕捉到的中國鱟進行人工飼養(yǎng), 定期抽血制備鱟試劑是可行的[14]。李建鑫研究了鱟的人工養(yǎng)殖及鱟試劑的制備[15]。顧功超嘗試了在人工飼養(yǎng)條件下連續(xù)抽血制取鱟試劑是可行的[16]。梁廣耀等經(jīng)過16個月的人工養(yǎng)殖和反復(fù)抽血, 表明只要抽血量合理和抽血間隔時間恰當, 鱟的存活率和變形細胞數(shù)都比較接近對照組的數(shù)據(jù), 說明完全可以達到反復(fù)采血抽取鱟試劑的目的[17]。劉端華等用人工飼養(yǎng)的鱟抽血制備鱟試劑, 在第一次抽血后, 血液中變形細胞就有減少的趨勢, 經(jīng)三次抽血后變形細胞數(shù)顯著減少, 同時血液顏色變淡, 甚至變成白色, 這意味著無法多年人工飼養(yǎng)抽血[18]。到目前為止, 尚未見到在鱟試劑生產(chǎn)過程中對中國鱟血液質(zhì)量進行監(jiān)測的相關(guān)報道。由于對中國鱟是否能夠連續(xù)采血存在完全相反的結(jié)論, 所以, 建立基于鱟試劑生產(chǎn)的中國鱟血液質(zhì)量的監(jiān)測方法, 不但可以減少不當采血對中國鱟健康造成的影響, 而且可以推動中國鱟可持續(xù)采血技術(shù)的發(fā)展與完善, 促進鱟試劑生產(chǎn)向更加科學、規(guī)范的方向發(fā)展, 對中國鱟的利用與保護具有重要意義。

3.2 中國鱟血液質(zhì)量監(jiān)測指標的選擇

中國鱟的血液通常稱為血淋巴, 血淋巴由血細胞和血漿組成。血細胞包括兩種, 即占比達99%的血細胞和少量的血藍細胞, 血細胞也稱顆粒細胞, 成年鱟只含有血細胞。鱟的血細胞中含有能與內(nèi)毒素起凝集作用的酶系統(tǒng), 可以用于生產(chǎn)鱟試劑, 因此, 鱟血中的血細胞數(shù)量不但反映了鱟的血液恢復(fù)狀態(tài), 也決定了鱟試劑生產(chǎn)的效率。血漿是血細胞的載體, 對內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起著決定性作用。血漿蛋白包括血藍蛋白、α2-巨球蛋白、C-反應(yīng)蛋白, 其中血藍蛋白是一種可溶性的呼吸蛋白, 占血漿蛋白的90%～ 95%。銅元素是血藍蛋白的重要組成成分, 血藍蛋白的每個氧結(jié)合位點有2個銅離子, 血液中銅的含量能夠準確反映血藍蛋白的含量。因此, 選擇中國鱟血液中銅元素含量、血細胞數(shù)、血漿蛋白含量以及血淋巴蛋白含量作為監(jiān)測中國鱟的血液質(zhì)量指標。

3.3 中國鱟血液中銅含量作為質(zhì)量監(jiān)測指標的可行性

中國鱟的血細胞具有容易凝集的特點, 在進行中國鱟血細胞計數(shù)時要求全程無菌操作, 實驗條件較為苛刻, 稍有不慎就可能影響實驗結(jié)果。即使嚴格地執(zhí)行無菌操作, 如果多次采血, 中國鱟的血細胞也同樣可能出現(xiàn)凝集, 影響血細胞計數(shù)。而血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量的檢測需要購買試劑盒進行生化反應(yīng), 對實驗設(shè)備和實驗條件要求較高, 同時需要消耗大量的試劑盒等材料, 還要付出人力成本和時間成本。銅元素是血藍蛋白的重要組成成分, 血藍蛋白的每個氧結(jié)合位點有2個銅離子, 血液中銅的含量能夠準確反映血藍蛋白的含量。但是, 如果在生產(chǎn)鱟試劑的過程中全部監(jiān)測上述4種指標, 無疑會給生產(chǎn)企業(yè)造成沉重的負擔。既能準確反映中國鱟血液質(zhì)量的變化情況, 又能簡化流程, 減少人力、物力以及財力的消耗就顯得尤其重要。

在本實驗中, 中國鱟血液中銅元素含量、血細胞數(shù)、血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量等數(shù)值均出現(xiàn)了較大波動, 可能是由于實驗所用的中國鱟經(jīng)歷了從大海到池塘、從池塘到實驗室的不同的養(yǎng)殖環(huán)境, 由于不同個體對新的環(huán)境適應(yīng)能力不同而造成了的差異。但各指標之間的相關(guān)關(guān)系均呈極顯著相關(guān), 說明這種數(shù)量的波動是中國鱟個體差異造成的, 而不是實驗誤差的影響。

血液中銅含量不但能夠直接反映血藍蛋白的含量, 而且由于銅含量與血細胞數(shù)、血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指標均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性, 可以換算成血細胞數(shù)、血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量。與上述幾種指標的檢測方法相比, 銅元素的檢測不會受到血液變質(zhì)、細胞凝集等因素的干擾, 檢測方法除了原子吸收光譜法以外, 還可以采用電化學分析法, 檢測設(shè)備價格更低, 檢測條件更容易實現(xiàn)。所以, 選擇血液中銅含量來監(jiān)測中國鱟血液質(zhì)量是可行的。

4 結(jié)論

中國鱟血液中銅含量不但能夠直接反映血藍蛋白的含量, 而且由于銅含量與血細胞數(shù)、血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指標均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性, 可以換算成血細胞數(shù)、血漿蛋白含量、血淋巴蛋白含量。因此, 以中國鱟血液中銅含量作為監(jiān)測血液質(zhì)量的指標, 具有簡便、高效、快捷、省時、省力和省錢的特點。在鱟試劑生產(chǎn)中對中國鱟血液質(zhì)量進行監(jiān)測可以減少不當采血對中國鱟健康造成的影響, 對中國鱟的利用與保護具有重要意義。

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Blood quality indexes infor the production of Tachypleus amebocyte lysate

JIA Jiu-man, SU Shuang-ting, HUANG Hui-ling, HUANG Hong-qi, TANG Dong, ZHOU Qi, YU Liu-jun, CHEN Jin-wen, JIA Yu-zhen, WEI Li-nian, LIAO Yong-yan

(Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation, College of Marine Sciences, Beibu Gulf University, Qinzhou 535011, China)

To study the different blood quality indexes inand their relationships with each other, nine animals were selected. Their blood was assayed for its copper content, cell count, plasma protein content, and lymphatic protein content, and a correlation analysis was performed. Copper content was found to be correlated with cell count (0.917), plasma protein content (=0.995), and lymphatic protein content (=0.983). The relationship of copper content with these three parameters was established to be1=6.14+0.86(2=0.840),22.08+ 0.78X (2=0.989), and3=1.87+0.62(2=0.966), respectively. The blood copper content not only directly reflects the hemocyanin content but also the cell count, plasma protein content, and lymphatic protein content. Therefore, blood copper content can be used as an index to monitor blood quality in. The implications of our study can promote the development and perfection of sustainable blood collection methods for, which can help protect these animals.

; blood quality; monitoring method; copper content

Aug. 10, 2020

P745

A

1000-3096(2022)12-0177-06

10.11759/hykx20200810003

2020-08-10;

2020-10-08

北部灣大學海洋科學廣西一流學科(DRC001); 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室(北部灣大學)自主課題(2022ZB02)

[Marine Science Guangxi First-Class Subject, Beibu Gulf University, No. DRC001; Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation, Beibu Gulf University, No. 2022ZB02]

賈久滿(1968—), 男, 河北遷西人, 碩士, 教授, 主要研究方向為動物營養(yǎng)與飼料, E-mail: jiajm12@163.com; 廖永巖(1965—),通信作者, 男, 湖南保靖人, 碩士, 教授, 主要研究方向為海洋生物學, E-mail: rock6783@126.com

(本文編輯: 楊 悅)