豬圓環(huán)病毒2型和3型雙重PCR方法的建立及在藏豬豬圓環(huán)病毒檢測中的應用

朱家平， 肖 琦， 錢雯嫻， 趙霞玲， 張馮禧， 尹力鴻， 溫立斌， 索朗斯珠， 何孔旺

(1.西藏農牧學院動物科學學院，西藏林芝 860000；2.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所/農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇南京 210014)

豬圓環(huán)病毒(PCV)為單鏈負股環(huán)狀且無囊膜的DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，結構為20面對稱體，是現(xiàn)已知的最小的動物病毒。豬圓環(huán)病毒可分為4個型：1974年由Tischer等首次分離得到的無致病性的豬圓環(huán)病毒1型(PCV-1)；Ellis等在加拿大西部豬群中分離得到的 PCV-2；2015年美國北卡羅來納州學者在豬群中發(fā)現(xiàn)的PCV-3；2019年在湖南病豬中發(fā)現(xiàn)的新的圓環(huán)病毒，暫定為豬圓環(huán)病毒4型(PCV-4)。其中，PCV-2能夠引起嚴重的豬圓環(huán)病毒病，損害機體免疫系統(tǒng)，增大混合感染的概率，且PCV-3與豬圓環(huán)病毒相關性疾病的發(fā)生聯(lián)系緊密。在我國，于2000年郎洪武等首次分離得到PCV-2；PCV-3于2017年首次被發(fā)現(xiàn)，之后在遼寧省、江西省、江蘇省均有報道。豬圓環(huán)病毒病在世界各個國家都有報道，我國也是感染較為嚴重的國家，且存在PCV-2與PCV-3混合感染的情況。但目前檢測PCV-2和PCV-3的PCR方法局限于單一PCR，雙重PCR同時檢測PCV-2和PCV-3的報道還很少。藏豬是主要分布于我國青藏高原的小型豬種，具有適應性強、抗病耐粗的特點；目前很少有關于西藏地區(qū)藏豬圓環(huán)病毒的報道。因此，建立一種快捷、靈敏、可靠的雙重PCR方法檢測并區(qū)分PCV-2和PCV-3，對臨床診斷和防控豬圓環(huán)病毒病具有深遠意義。本試驗旨在建立一種具有較高靈敏度的、能夠同時檢測PCV-2與PCV-3的雙重PCR方法，并對西藏地區(qū)臨床健康藏豬進行檢測，從而為西藏地區(qū)PCV的流行病學調查提供依據。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株與臨床樣品

大腸桿菌Trans5α、PCV-2和PCV-3陽性病料、PCV-1、豬瘟病毒(CSFV)、豬呼吸道疾病綜合征(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等常見豬源病原均由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。47份藏豬糞便樣品于2020年6月采集于西藏林芝周邊地區(qū)。

1.2 試驗時間及地點

本試驗于2020年7—10月在江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所、農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室完成。

1.3 主要試劑

Green Taq Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL-2000 DNA marker、pClone007 Simple Vector Kit、瓊脂糖購自北京擎科生物科技有限公司(南京)；DNA提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自美國Omega公司；引物合成和測序均由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

1.4 引物的設計與合成

用筆者所在實驗室已有的引物序列檢測 PCV-2 和PCV-3，PCV-2檢測引物為PCV-2-SF(5′-G G T T A G A C G G A T A T T G T A G T C C-3′)和 PCV-2-SR(5′-C G T T T C C G C A G A A G A A G A C A C-3′)，擴增長度為630 bp；PCV-3檢測引物為PCV-3-A2-U(5′-C A G C T G T G G G C C T C C T A A T G A A T-3′)和 PCV-3-A2-L(5′-C C C C C G T G G C T T G A A A T A C A G-3′)，擴增長度為932 bp。

1.5 臨床樣品處理與病毒DNA提取

取適量糞便裝入干凈的EP管中，向管中加入2倍體積的0.01 mol/L無菌PBS(pH值7.0)，制成懸浮液，反復凍融3次；將凍融的樣品于4 ℃下 10 000離心5 min，取上清于EP管中，用Magen生物公司的組織DNA抽提試劑盒，按說明書中的步驟提取樣品核酸作為模板。

1.6 單一PCR擴增

以提取的DNA為模板，用PCV-2-SF、PCV-2-SR、和PCV-3-A2-U、PCV-3-A2-L引物進行PCR擴增。2型最適PCR體系為25 μL：2 μL模板，1 μL的上游引物，1 μL的下游引物，2×mix 12.5 μL，無菌水8.5 μL；最適反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。3型最適PCR體系為25 μL：1 μL模板，1 μL的上游引物，1 μL 的下游引物，2×mix 12.5 μL，無菌水9.5 μL；最適反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，53.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸65 s，擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察擴增結果。

1.7 PCV-2和PCV-3陽性質粒的制備

用引物PCV-2-SF、PCV-2-SR、和PCV-3-A2-U、PCV-3-A2-L陽性樣品進行PCR擴增，得到相應的特異性條帶，將目的條帶進行切膠回收，用pClone007 Simple Vector Kit 進行TA克隆，將克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序，并將含有目的片段的質粒作為陽性質粒。

1.8 雙重PCR擴增條件篩選

在單重PCR的基礎上，篩選雙重PCR的最適退火溫度、循環(huán)數(shù)、引物濃度，確定雙重PCR的最適反應條件，并驗證其特異性和敏感性。

1.9 雙重PCR的敏感性試驗

計算PCV-2、PCV-3的初始質粒濃度，并將其進行倍比稀釋，用已建立好的最適單重PCR條件和雙重PCR條件對不同濃度的陽性標準物進行檢測，來確定雙重PCR的敏感性。

1.10 雙重PCR的特異性試驗

用建立的方法對PCV-2、PCV-3和PCV-2與PCV-3混合物以及實驗室保存的其他常見病原進行檢測，驗證此方法的特異性。

1.11 雙重PCR重復性試驗

在摸索雙重PCR最適條件時，不同條件均做3組重復，降低試驗結果出現(xiàn)偶然性，并用建立的方法對3份PCV-2陽性樣品DNA、3份PCV-2陰性樣品DNA、3份PCV-3陽性樣品DNA、3份PCV-3陰性樣品DNA等一些其他病原檢測1次/周，重復檢測3次，驗證雙重PCR的重復性。

1.12 臨床檢測與統(tǒng)計分析

收集2020年6月西藏林芝市周邊地區(qū)藏豬糞便47份，用Magen生物公司的DNA抽提試劑盒按照說明書對其進行DNA提取，用單重PCR和建立的雙重PCR的方法對樣品中PCV-2和PCV-3進行檢測，并用Rstudio 1.2.5033軟件對檢測結果進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 PCV-2和PCV-3陽性質粒的制備

用PCV-2和PCV-3的引物對病料核酸進行PCR擴增，分別得到630、932 bp特異性條帶，與預期相符。切膠回收后進行TA克隆、質粒提取，再次PCR驗證均可獲得特異性條帶，表明成功構建 PCV-2 和PCV-3陽性質粒(圖1)。

2.2 雙重PCR擴增條件優(yōu)化

2.2.1 雙重PCR退火溫度的優(yōu)化 以PCV-2和PCV-3單重PCR檢測方法為基礎，選取合適的模板濃度，設置4個溫度(53、54、55、56 ℃)作為退火溫度進行雙重PCR的擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增，結果發(fā)現(xiàn)雙重PCR在54 ℃時PCV-2和PCV3的擴增效果最好，故確定最適退火溫度為 54 ℃(圖2)。

2.2.2 雙重PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 以54 ℃為雙重PCR的退火溫度，選取合適的模板濃度，設置3個不同循環(huán)(30、35、40)對雙重PCR最適循環(huán)數(shù)進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)在循環(huán)數(shù)為40時條帶亮度較為合適，因此選用40個循環(huán)為PCR的最適循環(huán)數(shù)(圖3)。

2.2.3 雙重PCR引物濃度的優(yōu)化 設置0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 μL等5個引物量(上下游引物濃度均為1×10pmol/μL)對PCV-2/3單重PCR的最適引物量進行摸索。結果發(fā)現(xiàn)，PCV-2和 PCV-3 均在引物量為0.5、1.0、1.5 μL時條帶已足夠亮(圖4、圖5)。以0.5、1.0、1.5 μL為雙重PCR的引物量，以棋盤滴定法找到雙重PCR中 PCV-2 與PCV-3初始最適引物體積比例為2.0、0.5 μL(圖6)。并按照該引物體積比例設置3組引物量(1.2 μL ∶0.3 μL；1.6 μL ∶0.4 μL；2.0 μL ∶0.5 μL)確定雙重PCR中PCV-2與PCV-3的最終最適引物體積比例為1.6 μL ∶0.4 μL(圖7)。

2.3 雙重PCR敏感性試驗結果

將70.7 ng/μL PCV-2、62.5 ng/μL PCV-3的陽性質粒均稀釋成10拷貝數(shù)/μL，按比例混合稀釋為10拷貝數(shù)/μL，之后進行倍比稀釋來進行PCR的敏感性試驗。經敏感度測定發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的雙重PCR敏感度和其單一PCR的敏感度相同，均為10拷貝數(shù)/μL，說明建立的雙重PCR檢測方法具有很高的敏感度(圖8、圖9、圖10)。

2.4 雙重PCR特異性試驗

以優(yōu)化后的雙重PCR對PCV-2、PCV-3、PCV-2+ PCV-3以及PCV-1、CSFV、PPV、PRV、PRRSV、PEDV進行檢測。結果顯示，本試驗建立的方法對PCV-2、PCV-3、PCV-2+PCV-3均能擴增出目的條帶，對其余病原均無特異性目的條帶，雖PRV出現(xiàn)較弱非特異性條帶，但與目的條帶距離較大，并不影響對PCV-2與PCV-3的判定結果。表明建立的雙重PCR的方法具有較好的特異性(圖11)。

2.5 雙重PCR重復性試驗

在摸索雙重PCR最適條件時，3組重復均大致相同，且利用建立的雙重PCR方法分別對PCV-2陽性樣品DNA、PCV-2陰性樣品DNA、PCV-3陽性樣品DNA、PCV-3陰性樣品DNA以及其他病原進行檢測，3次重復結果一致，說明建立的PCV-2、PCV3雙重PCR方法具有很好的重復性。

2.6 臨床檢測與統(tǒng)計分析

以單重PCR和建立的雙重PCR分別對采集的47份臨床樣品進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)雙重PCR與單重PCR結果一致。利用RStudio對結果進行分析并做可視化處理，PCV-2、PCV-3的陽性率分別為38.30%(18/47)、12.77%(6/47)，混合感染率為10.64%(5/47)，單患PCV-2率為27.7%(13/47)，單患PCV-3率為2.1%(1/47)，PCV-2和PCV3雙陰性率為59.6%(28/47)(圖12)。

3 討論與結論

自PCV-2和PCV-3報道以來，國內外均有豬群感染的情況，且感染率居高不下，存在混合感染現(xiàn)象。PCV-2和PCV-3在臨床上均表現(xiàn)為繁殖障礙、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、豬皮炎腎病綜合征(PNDS)、能夠引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、仔豬先天性震顫、增生性壞死性肺炎(PNP)等，在臨床上無法明確區(qū)分PCV-2和PCV-3。另有報道在無臨床癥狀的豬和犬中檢測到PCV-3，且PCV-3能跨種間傳播，在牛、蜱、鼠中亦能檢測到，但PCV-2和PCV-3無交叉免疫保護，PCV-2的疫苗無法防止PCV-3的感染，豬圓環(huán)病毒不僅給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重損失，也可為其他動物的健康帶來嚴重威脅，增加防控難度。因此，建立敏感性高、特異性強、重復性好的診斷方法對PCV-2和PCV-3臨床檢測與防控具有重要意義。

PCR為實驗室檢測的常用技術，肖琦等分別建立了PCV-2和PCV-3 PCR檢測技術，但單重PCR技術1次只能檢測1種病原。多重PCR方法于1988年提出，該方法在疾病混合感染方面具有快速、省時、省力的優(yōu)勢，既具有單項PCR的敏感性和特異性，又可節(jié)省試劑，1次檢測多個病原體或多個基因型，具有很高的實用性。季程遠等建立的雙重PCR方法中PCV-2和PCV-3檢測敏感度分別為1×10、1×10拷貝數(shù)/μL，6.1×10、8.0×10拷貝數(shù)/μL。本研究通過對PCR不同條件的優(yōu)化和反復試驗，最終建立了簡單快速、靈敏穩(wěn)定、準確可靠的PCV-2和PCV-3雙重PCR方法，其靈敏度和單重PCR相同均為1×10拷貝數(shù)/μL，且高于已報道的PCV-2、PCV-3雙重方法的敏感度。

目前，我國PCV-2和PCV-3在很多省份均有報道。PCV-2感染率為23.53%～81.40%(青海省為23.53%、云南省為36.05%、江蘇省為38.00%、吉林省為38.50%、京津冀為56.70%、廣西壯族自治區(qū)為65.10%、新疆維吾爾自治區(qū)為70.71%、四川省為74.48%、河南省為81.40%)；PCV-3感染率為11.10%～38.3%(廣西壯族自治區(qū)為11.10%、四川省為11.19%、江蘇省為12.67%、云南省為17.44%、青海省為18.38%、新疆維吾爾自治區(qū)為20.00%，河南省為30.23%，京津冀為38.30%)，混合感染率為 6.64%～30.23%(廣西壯族自治區(qū)為7.90%，京津冀為17.50%，青海省為7.35%，河南省為30.23%，四川省為6.64%，云南省為15.12%)。本研究建立的雙重PCR方法對臨床健康的藏豬糞便進行豬圓環(huán)病毒檢測，結果PCV-2感染率為38.3%(18/47)，PCV-3感染率為12.8%(6/47)，混合感染率為10.6%(5/47)。從目前我國PCV-2和PCV-3的感染類型來看，PCV-2、PCV-3 陽性率大致為53%、20%，混合感染率為14.12%左右，可見PCV-2、PCV-3在我國已普遍流行，且PCV-3多與PCV-2以混合感染的形式存在。從PCV-2和PCV-3感染地區(qū)來看，中國北部地區(qū)PCV-2和PCV-3陽性率較高，這可能與南北方氣候差異有關。本試驗以西藏林芝周邊臨床健康豬為檢測對象，對其糞便進行檢測。整體來看，西藏林芝地區(qū)PCV-2和PCV-3感染率相對較低，這可能與藏豬的散養(yǎng)模式、耐受能力和高原氣候有關，且PCV-3多與PCV-2混合感染，但也存在PCV-3單獨感染的現(xiàn)象，存在隱性感染的可能，因此西藏養(yǎng)殖戶應加強對豬圓環(huán)病毒的防控意識。