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      番茄匍柄霉原生質(zhì)體的制備與再生體系構(gòu)建

      2022-03-03 12:56:02龔偉杰
      關(guān)鍵詞:原生質(zhì)細(xì)胞壁菌絲

      龔偉杰,劉 洪,黃 萍,王 慧,周 倩

      (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

      番茄匍柄霉()是一類世界性分布的重要植物病原物,可引起多種蔬菜病害,降低蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì),給菜農(nóng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。為深入研究番茄匍柄霉的致病機(jī)制與功能基因組學(xué),需建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化是最常用的轉(zhuǎn)化方法,其前提是制備大量可再生的原生質(zhì)體。目前很多病原真菌均已建立了成熟的PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系,包括稻瘟病菌、枯萎病菌、紋枯病菌、黑粉病菌、蘋果腐爛病菌等,但有關(guān)番茄匍柄霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系仍未見報(bào)道。原生質(zhì)體是通過酶裂解細(xì)胞壁獲得的裸露細(xì)胞,僅含一層質(zhì)膜為隔絕外界的唯一屏障,對(duì)外界環(huán)境的變化極為敏感。原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化體系現(xiàn)已被廣泛用于生理、生化、遺傳、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究。由于真菌的不同種屬甚至不同專化型菌株間生物學(xué)特性的不同,其制備原生質(zhì)體的方法和條件也不盡相同,因此,篩選并優(yōu)化制備原生質(zhì)體的條件,建立番茄匍柄霉有效的原生質(zhì)體制備與再生體系對(duì)研究番茄匍柄霉致病機(jī)理和功能基因組學(xué)至關(guān)重要。本研究通過探討菌齡、酶種類與濃度、酶組合、酶解溫度與時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響,以及原生質(zhì)體在不同培養(yǎng)基中的再生率,建立了高效的番茄匍柄霉原生質(zhì)體制備和再生體系,為今后番茄匍柄霉的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      1.1.1 供試菌株

      番茄匍柄霉菌株CS12由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

      1.1.2 培養(yǎng)基

      PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g,瓊脂20 g,葡萄糖20 g,去離子水定容至1 L;不加瓊脂為液體培養(yǎng)基。TB3培養(yǎng)基:酪蛋白水解物3 g,酵母提取物3 g,蔗糖200 g,瓊脂15 g,去離子水定容至1 L;不加瓊脂為液體培養(yǎng)基。YEPG培養(yǎng)基:酵母提取物3 g,蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉15 g,加水至1 L;YEPS培養(yǎng)基:酵母提取物3.5 g,蛋白胨5.0 g,蔗糖200.0 g,瓊脂粉15.0 g,加水至1 L。

      1.1.3 試劑

      裂解酶(Kitalase)、溶壁酶(lysing enzymes)、蝸牛酶(snailase)、崩潰酶(driselase)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。STC溶液:含1.2 mol·L山梨醇、10 mmol·LpH值7.5的Tris-HCl、50 mmol·LCaCl。酶解液:用預(yù)冷的0.7mol·LNaCl溶液配制,輕微搖晃混勻,0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾。

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1 原生質(zhì)體的制備

      將活化的CS12菌株接種于PDA中,于28 ℃、180 r·min搖床中培養(yǎng),待長(zhǎng)出菌絲后,用滅菌研缽研磨菌絲至不見明顯菌絲球,重新接種于新PDA中培養(yǎng)12~48 h,用滅菌紗布過濾,收集菌絲,用0.7 mol·LNaCl沖洗去除PDA,將菌絲置于5 mL酶解液中,28 ℃,80 r·min振蕩,每隔30 min鏡檢1次,酶解結(jié)束用無菌擦鏡紙過濾,穩(wěn)滲劑沖洗擦鏡紙15~20次,4 000×g離心濾液4~5 min,然后用移液槍吸去上清液,加入200 μL STC溶液重懸原生質(zhì)體,鏡檢。

      1.2.2 穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      用0.7 mol·LMgSO、1.2 mol·LMgSO、0.7 mol·LNaCl和1.2 mol·LNaCl溶液分別作為穩(wěn)滲劑,分別配置酶解液,試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)量。

      1.2.3 酶對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      采用上述試驗(yàn)篩選的最佳穩(wěn)滲劑,選擇菌齡為12 h的幼嫩菌絲,28 ℃酶解3 h,Kitalase裂解酶、溶壁酶、蝸牛酶、崩潰酶均配置5、10、15、20、25 mg·mL,用于酶解制備原生質(zhì)體。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量原生質(zhì)體數(shù)量。

      1.2.4 不同酶組合對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      采用酶解效率最高的濃度進(jìn)行組合,其中2種酶組合、3種酶組合、4種酶組合,共11種組合處理方式。穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl,試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)量。

      1.2.5 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      采用酶解效率最佳組合對(duì)12、18、24、30、36、42、48 h菌齡的菌絲進(jìn)行酶解,酶解時(shí)間為3 h,穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl,試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)量。

      1.2.6 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      采用上述試驗(yàn)中篩選的最佳條件分別在24、26、28、30、32 ℃進(jìn)行酶解,酶解時(shí)間為3 h,穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl,試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量原生質(zhì)體數(shù)量。

      1.2.7 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      采用上述試驗(yàn)中最佳條件,穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl,分別酶解2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量原生質(zhì)體數(shù)量。

      1.2.8 不同培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生的影響

      取100 μL原生質(zhì)體懸液輕輕涂布在PDA、YEPG、YEPS、TB3培養(yǎng)基上,試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4 d,記錄單菌落生長(zhǎng)數(shù)量。顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體懸液中的原生質(zhì)體數(shù)量();菌落長(zhǎng)出后統(tǒng)計(jì)平板菌落數(shù)()。

      1.3 數(shù)據(jù)分析

      利用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用LSD法進(jìn)行多重比較。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 不同滲透壓緩沖液對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      原生質(zhì)體對(duì)滲透壓較為敏感,濃度適宜的穩(wěn)滲劑有助于原生質(zhì)體的釋放,以及維持原生質(zhì)體狀態(tài)的穩(wěn)定,使其不易破裂。由圖1可知,NaCl效果比MgSO好,0.7 mol·LNaCl的效果更佳。因此,番茄匍柄霉原生質(zhì)體制備推薦采用0.7 mol·LNaCl作為穩(wěn)滲劑。

      圖1 穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      2.2 酶對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      由于不同真菌的細(xì)胞壁組成成分不同,酶的種類直接影響原生質(zhì)體的釋放效率。由圖2可知,不同酶組合的酶解效率差異較大,其中,Kitalase裂解酶在濃度為10 mg·mL時(shí)產(chǎn)量最高,原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)8.72×10mL,其效率明顯高于其他3種酶;蝸牛酶的效率最低,原生質(zhì)體數(shù)量最高為0.52×10mL。

      圖2 酶種類與濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      2.3 不同酶組合對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      為了篩選最佳的酶組合,將單個(gè)酶的最佳濃度(Kitalase裂解酶10 mg·mL,溶壁酶10 mg·mL,崩潰酶25 mg·mL,蝸牛酶10 mg·mL)進(jìn)行不同的組合試驗(yàn),觀察其釋放原生質(zhì)體的情況。結(jié)果如圖3所示,4種酶組合效果最佳,其原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高可達(dá)到9.25×10mL,但酶解效率與單獨(dú)使用10 mg·mLKitalase裂解酶(8.72×10mL)沒有顯著差異。

      Kit,Kitalase裂解酶;Lys,溶壁酶;Dri,崩潰酶;Sna,蝸牛酶。

      從節(jié)約成本的角度考慮,推薦制備番茄匍柄霉原生質(zhì)體采用10 mg·mLKitalase裂解酶。

      2.4 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      菌絲的菌齡對(duì)原生質(zhì)體的制備影響很大,不同菌齡的菌絲細(xì)胞壁組成不同,對(duì)酶的敏感程度也不同,幼嫩菌絲的細(xì)胞壁易被酶解,但幼嫩菌絲產(chǎn)生的原生質(zhì)體往往不穩(wěn)定,容易破裂,因此需要摸索最佳菌齡。試驗(yàn)結(jié)果表明,開始隨著菌齡的增加,原生質(zhì)體的產(chǎn)量不斷增加,當(dāng)菌齡到36 h時(shí),原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高,此后原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著菌齡的增加逐漸下降(圖4)。因此,番茄匍柄霉制備原生質(zhì)體菌絲的最佳培養(yǎng)時(shí)間為36 h。

      圖4 不同菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      2.5 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      不同酶解溫度也能顯著影響原生質(zhì)體的制備,在其他條件相同的情況下,將酶解溫度分別設(shè)為24、26、28、30、32 ℃。試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明,原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加,28 ℃時(shí)效果最佳,之后隨著溫度的升高原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸降低。

      圖5 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      2.6 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      在其他條件一致的情況下,將酶解時(shí)間分別設(shè)為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。原生質(zhì)體產(chǎn)量最初隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,酶解3.0 h后增長(zhǎng)變緩,酶解3.5 h產(chǎn)量達(dá)到最高,之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),原生質(zhì)體的產(chǎn)量開始下降(圖6)。酶解時(shí)間過短,菌絲酶解不完全,原生質(zhì)體釋放不徹底,而酶解時(shí)間過長(zhǎng),原生質(zhì)體失去細(xì)胞壁保護(hù)后不穩(wěn)定,長(zhǎng)時(shí)間暴露在酶解液中,酶解液中的雜質(zhì)蛋白酶對(duì)原生質(zhì)體膜造成損害而導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。因此,番茄匍柄霉最佳的酶解時(shí)間為3.5 h。

      圖6 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

      2.7 培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生的影響

      菌株CS12的原生質(zhì)體在顯微鏡下呈透明圓球狀(圖7)。取100 μL原生質(zhì)體分別涂布在PDA、YEPG、YEPS、TB3培養(yǎng)基上,均能生長(zhǎng)出單菌落。通過菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),利用YEPS培養(yǎng)基的原生質(zhì)體再生率可達(dá)10.80%,顯著高于其他類型培養(yǎng)基(圖8)。

      圖7 番茄匍柄霉CS12的原生質(zhì)體形態(tài)

      圖8 不同培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體再生率

      3 討論

      原生質(zhì)體制備與再生體系的建立是進(jìn)行分子遺傳學(xué)操作的基礎(chǔ)和前提,關(guān)于真菌原生質(zhì)體制備與再生的研究報(bào)道較多,但由于真菌種類繁多,其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜,組成成分多樣,原生質(zhì)體制備條件不盡相同;因此,優(yōu)化原生質(zhì)體制備與再生條件尤為重要。在嘗試?yán)肞EG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究番茄匍柄霉基因功能時(shí),首先參照了王琪制備蔥葉匍柄霉原生質(zhì)體的條件,發(fā)現(xiàn)15 mg·mL溶壁酶、10 mg·mLLywallzyme裂解酶、10 mg·mL蝸牛酶和5 mg·mL纖維素酶(cellulase)組合,30 ℃酶解培養(yǎng)菌齡36 h的菌絲3.5 h,番茄匍柄霉原生質(zhì)體的釋放效率不高。說明同屬不同種的匍柄霉菌株之間,細(xì)胞壁成分存在較大差別,因此,需要探索適合番茄匍柄霉的酶解條件。Kitalase裂解酶對(duì)鏈格孢屬酶解效率顯著高于其他常規(guī)裂解酶,而匍柄霉屬和鏈格孢屬親緣關(guān)系較近。本試驗(yàn)在摸索酶解條件時(shí)加入了Kitalase裂解酶,發(fā)現(xiàn)在單酶酶解試驗(yàn)中,10 mg·mLKitalase裂解酶酶解效果最好,釋放的原生質(zhì)體數(shù)量最多,增加溶壁酶、蝸牛酶和崩潰酶不能顯著提高酶解效率;因此,推薦用10 mg·mLKitalase裂解酶酶解番茄匍柄霉制備原生質(zhì)體。Kitalase裂解酶最早報(bào)道來源于,是一種內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶。真菌細(xì)胞壁中廣泛存在葡聚糖,其中1,3-β-D-葡聚糖占真菌細(xì)胞壁成分50%以上,Kitalase裂解酶可催化1,3-β-D-葡聚糖水解。推測(cè)番茄匍柄霉細(xì)胞壁中1,3-β-D-葡聚糖含量高,因此Kitalase酶解效果好。

      穩(wěn)滲劑可維持原生質(zhì)體細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓平衡,也會(huì)影響酶的活性。制備絲狀真菌原生質(zhì)體時(shí),選擇的穩(wěn)滲劑一般為無機(jī)鹽類,如NaCl、MgSO等。酶解過程中釋放的原生質(zhì)體失去細(xì)胞壁的保護(hù)后容易破裂,而合適的穩(wěn)滲劑會(huì)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生保護(hù)作用,因此,穩(wěn)滲劑的選擇至關(guān)重要。本試驗(yàn)對(duì)不同濃度的NaCl和MgSO進(jìn)行篩選,最終發(fā)現(xiàn)0.7 mol·LNaCl溶液作為穩(wěn)滲劑時(shí)效果最好。

      用于原生質(zhì)體再生的培養(yǎng)基種類很多,本試驗(yàn)比較PDA、YEPG、YEPS、TB3培養(yǎng)基的再生效果,發(fā)現(xiàn)YEPS培養(yǎng)基再生效果最好,可能是因?yàn)閅EPS培養(yǎng)基富含碳源、氮源,利于番茄匍柄霉的再生。

      本研究通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化了菌齡、酶種類與濃度、酶組合、酶解溫度和時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑,并比較了不同再生培養(yǎng)基的再生效率,成功建立了番茄匍柄霉的高效原生質(zhì)體制備與再生體系,為探索番茄匍柄霉基因功能提供了技術(shù)保障。

      4 結(jié)論

      本研究從菌齡、酶種類與濃度、酶組合、酶解溫度與時(shí)間、不同滲透壓穩(wěn)定劑等方面對(duì)番茄匍柄霉原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行優(yōu)化,明確原生質(zhì)體制備的最佳條件如下:菌齡為36 h,穩(wěn)滲劑為0.7 mol·LNaCl溶液,酶解液10 mg·mLKitalase裂解酶,28 ℃酶解3.5 h,制備原生質(zhì)體效果最佳;番茄匍柄霉原生質(zhì)體在YEPS培養(yǎng)基上再生效率最高。

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