束婧婷，單艷菊，姬改革，章明，屠云潔，劉一帆，巨曉軍，盛中偉，唐燕飛，李華，鄒劍敏

廣西麻雞m6A甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)與肌纖維類型及成肌分化的關(guān)系

束婧婷1，單艷菊1，姬改革1，章明1，屠云潔1，劉一帆1，巨曉軍1，盛中偉1，唐燕飛2，李華3，鄒劍敏1*

1江蘇省家禽科學(xué)研究所江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225125；2廣西富鳳農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，南寧 530024；3佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528225

【目的】肌纖維類型及其轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)是改善肉質(zhì)的重要途徑，最新研究表明，m6A RNA 甲基化修飾在肌肉的分化中發(fā)揮著重要作用。以優(yōu)良的地方品種——廣西麻雞作為研究對象，研究其性成熟日齡不同部位肌纖維類型的組成差異，探究m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白 3/14 (methyltransferase like 3/14, METTL3/14)、Wilm 腫瘤 1-相關(guān)蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）和病毒樣m6A 甲基轉(zhuǎn)化酶（vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA，也稱 KIAA1429）在不同部位肌肉組織和成肌細(xì)胞分化前后的表達(dá)差異，為闡明肌纖維類型組成及轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)理提供參考。【方法】采用ATPase染色法比較廣西麻雞胸部、腿部和背部肌肉群7個(gè)部位肌纖維類型、直徑和密度等肌纖維性狀差異，采用比色法檢測成肌細(xì)胞分化前后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)源性m6A甲基化水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測上述4個(gè)基因在廣西麻雞7個(gè)部位肌肉以及成肌細(xì)胞分化前后的表達(dá)差異，并將其與肌纖維性狀和m6A甲基化水平進(jìn)行相關(guān)性分析?！窘Y(jié)果】廣西麻雞性成熟日齡胸部肌肉群的胸大肌和胸小肌全部由白肌纖維組成，腿部肌肉群的恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭和縫匠肌均以紅肌纖維為主，而髂脛外側(cè)肌以白肌纖維為主，背部肌肉群的背闊肌則以紅肌纖維為主；總體上，紅肌纖維比例多的肌肉肌纖維密度顯著高于白肌纖維比例多的肌肉。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429基因表達(dá)存在顯著的組織和時(shí)間特異性，總體上，在紅肌纖維為主的肌肉中的表達(dá)量高于白肌纖維為主的肌肉，在分化期成肌細(xì)胞中的表達(dá)量要顯著高于增殖期成肌細(xì)胞。肌肉中METTL3、METTL14和WTAP具有相似的表達(dá)模式，均在背闊肌中表達(dá)量最高，顯著高于其他肌肉組織；在恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭和腓腸肌內(nèi)側(cè)頭的表達(dá)量次之，顯著高于縫匠肌、胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)肌。KIAA1429基因在腓腸肌內(nèi)側(cè)頭的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織；在背闊肌中的表達(dá)量次之，顯著高于恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌、胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)?。辉谛卮蠹≈斜磉_(dá)量最低，但與在胸小肌和髂脛外側(cè)肌中的表達(dá)量差異不顯著。在雞成肌細(xì)胞中，METTL3和METTL14基因表達(dá)變化趨勢較為一致，均表現(xiàn)出先持續(xù)升高后下降的趨勢，在剛分離0 h細(xì)胞中的表達(dá)量最低，在誘導(dǎo)分化后2 d（D2）細(xì)胞中的表達(dá)量最高，顯著的高于增殖期和誘導(dǎo)分化當(dāng)天（D0）細(xì)胞中的表達(dá)量。WTAP和KIAA1429基因表達(dá)變化趨勢也較為一致，均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在剛分離細(xì)胞中的表達(dá)量最低，顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)，至19 h顯著上升，D0天略有增加，接著顯著上升至D5天達(dá)到高峰。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著成肌細(xì)胞的分化，內(nèi)源性RNA m6A甲基化水平逐步上升，分化期的水平顯著高于增殖期，在D2天甲基化水平最高，顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)，隨后在D5天顯著下降，但略高于D0天。肌肉和成肌細(xì)胞中，METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429基因的表達(dá)兩兩之間均表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系；肌肉中4個(gè)基因的表達(dá)與紅肌纖維比例存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，與白肌纖維比例則呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系；成肌細(xì)胞中4個(gè)基因的表達(dá)與m6A甲基化水平之間也存在正相關(guān)關(guān)系。【結(jié)論】廣西麻雞不同部位肌肉肌纖維類型組成存在差異，所研究的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶4個(gè)基因之間協(xié)同表達(dá)，并可能對雞肌纖維類型組成、維持及成肌細(xì)胞分化具有一定的調(diào)控作用。

廣西麻雞；基因表達(dá)；m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶基因；肌纖維類型; 成肌分化

0 引言

【研究意義】骨骼肌肌纖維類型直接影響肉品質(zhì)，肌纖維類型及其轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)是改善肉質(zhì)的重要途徑[1]。研究表明，RNA甲基化修飾，尤其是N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是真核生物體內(nèi)廣泛存在的RNA水平表觀遺傳修飾，在細(xì)胞分化、發(fā)育和壓力應(yīng)答等多種生理功能中均有重要作用[2-4]。哺乳動物中研究發(fā)現(xiàn)，m6A 甲基化修飾在肌肉的分化中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。然而迄今為止，尚無m6A甲基化修飾在雞骨骼肌發(fā)育和分化中的研究報(bào)道。因此，研究m6A甲基化修飾酶相關(guān)基因在雞成肌細(xì)胞發(fā)育、分化及不同類型肌肉中的表達(dá)規(guī)律及其相關(guān)性，將有助于找尋出參與肌纖維發(fā)育及類型組成的調(diào)控因子，對于闡明雞肉品質(zhì)差異的分子機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】禽類骨骼肌肌纖維根據(jù)外觀、收縮特性和代謝特征可將雞骨骼肌肌纖維分成慢肌纖維（slow-twitch myofibres, SM）（Ⅰ型，色紅，收縮慢，進(jìn)行有氧代謝）、快紅肌纖維（red fast-twitch myofibres, FRM）（2a型，色澤較紅，收縮快，進(jìn)行有氧和酵解代謝）和快白肌纖維（white fast-twitch, FWM）（2b型，色白，收縮快，進(jìn)行酵解代謝）[5]。其中I型和IIa型纖維可歸為紅肌纖維[6]，所有骨骼肌均是由這3類肌纖維混合構(gòu)成的，但各塊肌肉中各種肌纖維的比例不同。肌纖維類型的發(fā)生與轉(zhuǎn)化受到許多信號通路、基因與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，是一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控過程[7]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A 修飾在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，主要通過mRNA分子的表達(dá)水平來影響mRNA穩(wěn)定性、出核運(yùn)動及翻譯起始等，介導(dǎo)了超過80%的RNA堿基甲基化[8-9]。參與m6A甲基化修飾的酶有甲基化轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白，其中甲基化轉(zhuǎn)移酶上保守的motif能催化RNA上的腺苷酸發(fā)生m6A甲基化修飾，而去甲基化酶主要作用是對已經(jīng)發(fā)生m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化修飾，閱讀蛋白主要功能是識別發(fā)生m6A修飾的堿基，從而激活下游的調(diào)控通路如RNA降解、miRNA加工等[10-11]。m6A修飾是一種動態(tài)可逆的修飾，這種可逆的動態(tài)修飾代表了一種全新的遺傳信息調(diào)控方式。甲基化轉(zhuǎn)移酶是多種酶的復(fù)合物，其核心組分包括甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白 3/14（methyltransferase like 3/14, METTL3/14）、Wilm 腫瘤 1-相關(guān)蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）和病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)化酶（vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA，也稱 KIAA1429）等[12]。在METTL3 /METTL14 /WTAP 復(fù)合物中，METTL3與 METTL14形成異二聚體復(fù)合物，與WTAP 相互作用。METTL3 被證明是多腺苷酸化 m6A 形成的主要催化活性酶[10]；METTL14不具有酶促活性，而是作為 m6A 甲基化過程的支架和銜接子來結(jié)合RNA 底物并促進(jìn) METTL3 的活性[13]；WTAP則起招募METTL3和METTL14 至核斑點(diǎn)促進(jìn)m6A 水平的作用[14]。KIAA1429可能起招募催化METTL3 /METTL14的核心組分指導(dǎo)區(qū)域選擇性甲基化的作用[15]。m6A 甲基化修飾對肌肉的分化具有重要調(diào)控作用。Chen等研究發(fā)現(xiàn)m6A 甲基化修飾能正向調(diào)控大鼠成肌細(xì)胞的分化[16]。在增殖期成肌細(xì)胞中，METTL3通過介導(dǎo) MyoD 等肌源性轉(zhuǎn)錄因子 mRNA 的 5’UTR的 m6A 修飾維持增殖性骨骼肌祖細(xì)胞的肌源性潛能，提示METTL3 參與肌源性祖細(xì)胞的骨骼肌分化潛能，同時(shí)也是骨骼肌分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因在雞成肌細(xì)胞增殖、分化過程中以及不同部位肌肉中的表達(dá)規(guī)律及其表達(dá)對m6A甲基化水平、成肌細(xì)胞分化及肌纖維類型的影響研究還處于空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】肌纖維類型并不是出生前就確定下來的，在生長過程中，它受到品種、年齡、營養(yǎng)、內(nèi)分泌及機(jī)體各級調(diào)控因子的影響。廣西麻雞是我國重要的慢速型地方品種，其肉質(zhì)鮮美，深受廣大消費(fèi)者歡迎。本研究即以廣西麻雞作為研究對象，首次研究其性成熟時(shí)不同部位肌肉肌纖維類型組成差異，以及m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429在成肌細(xì)胞增殖和分化過程中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律以及在不同部位肌肉中的組織分布，并結(jié)合m6A甲基化水平以及肌纖維性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，以進(jìn)一步揭示m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的生物學(xué)功能，為雞肉品質(zhì)的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年10月至2020年6月在揚(yáng)州江蘇省家禽科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地和家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

廣西麻雞種蛋來源于廣西富鳳農(nóng)牧有限公司廣西麻雞保種群。種蛋孵化前，進(jìn)行稱重、消毒和編號，品種內(nèi)蛋重變異系數(shù)在5%以內(nèi)。在溫度為37.5—37.8℃、相對濕度為65%—75%條件下孵化。出雛后，飼養(yǎng)至性成熟（120日齡），隨機(jī)選擇體重相近的母雞10只屠宰，參考羅克[18]方法采集兩側(cè)胸大肌、胸小肌、縫匠肌、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、髂脛外側(cè)肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭肌和背闊肌等7個(gè)部位肌肉，在每種肌肉一側(cè)中間部位采集1×1 cm2大小肌肉塊，并采集另一側(cè)同一部位組織樣品，置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織學(xué)測定

在恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行冰凍切片的制作，每個(gè)樣品在垂直于肌纖維延展方向做10張連續(xù)橫切切片，切片厚度10 μm，ATPase染色法染色，封片，顯微鏡觀察測量，根據(jù)染色結(jié)果確定肌纖維類型。在10倍或者20倍鏡下選取視野進(jìn)行觀察，每組切片選取1—2個(gè)完整肌束，每只雞取7個(gè)完整肌束，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析不同類型肌纖維的比例。

1.4 成肌細(xì)胞分離及誘導(dǎo)分化

雞成肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)參考Luo等[19]方法并稍作調(diào)整。用胰酶消化法分離提取11胚齡廣西麻雞腿肌成肌細(xì)胞，并用差速貼壁法對提取的成肌細(xì)胞進(jìn)行純化。將純化的雞成肌細(xì)胞以1×106個(gè)/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板，用DMEM +20%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞匯合至80%時(shí)，換用DMEM +5%馬血清培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。收集培養(yǎng)0、19 h以及誘導(dǎo)分化后0、2、5 d的成肌細(xì)胞。

1.5 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0軟件，分別設(shè)計(jì)GenBank中雞的METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429（GenBank登錄號：XM_418337）等4個(gè)候選基因以及分化標(biāo)志基因（MyoD、MyoG）的定量PCR引物，選擇雞肌肉特異性內(nèi)參基因HSP70作為本研究的內(nèi)參基因。由上海英俊生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

表1 相關(guān)基因熒光定量引物序列

1.6 總RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

肌肉和細(xì)胞總RNA提取按TRNzol Universal 總RNA提取試劑（DP424）（天根，北京）的說明書進(jìn)行。RNA樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性后，采用核酸定量儀NanoDrop2000（Thermo Scientific，美國）測定濃度及根據(jù)A260nm/A280nm值確定RNA純度。

cDNA反轉(zhuǎn)錄按照HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）合成試劑盒（諾唯贊，南京）的使用說明書進(jìn)行，RT產(chǎn)物保存在-20℃?zhèn)溆谩晒舛縋CR采用SYBR Green Ι法，參照ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Q411-02）（諾唯贊，南京）試劑盒說明書進(jìn)行。每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

1.7 整體m6A甲基化水平測定

采用比色法檢測成肌細(xì)胞分化前后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)源性m6A甲基化水平，具體步驟參考m6A RNA Methylation Quantification Kit（Colorimetric，ab185912）說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后使用多功能酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值，計(jì)算各樣品的RNA m6A含量，計(jì)算公式如下：

m6A（%）=（（Sample OD-NC OD）/S）/（（PC OD- NC OD）/P）×100

式中：S為RNA的量，P為陽性對照RNA的量。

1.8 細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取和Western blot檢測

細(xì)胞總蛋白的提取采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制混合物（碧云天，中國）進(jìn)行，按照細(xì)胞板培養(yǎng)面積比例加入蛋白裂解液，把細(xì)胞培養(yǎng)板放置在冰上5 min，期間反復(fù)水平搖擺培養(yǎng)板讓細(xì)胞充分裂解，把細(xì)胞蛋白裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，4℃ 12 000×離心10 min，取上清液。細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度測定方法，參考BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）說明書。按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行Western blot檢測，抗體信息如下：anti-MyoG（Biorbyt，英國），anti-MyoD（Thermo Fisher Scientific，美國），anti-GAPDH（Bioworld，美國），goat anti-rabbit IgG（H & L）-HRP（Bioworld，美國）。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理，分析基因的相對表達(dá)量。細(xì)胞分化前后表達(dá)分析將誘導(dǎo)分化0日齡設(shè)為對照組，ΔΔCt=ΔCt（其他時(shí)間點(diǎn)）-ΔCt（D0），廣西麻雞性成熟不同部位表達(dá)分析將胸大肌設(shè)為對照組，ΔΔCt=ΔCt（其他肌肉部位）-ΔCt（胸大?。２捎?SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，組間差異顯著性用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Bivariate Correlation用來分析基因表達(dá)之間以及基因表達(dá)與肌纖維類型和RNA m6A含量的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)以Mean ± SE表示，＜0.05，表示差異顯著；＜0.01，表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 廣西麻雞不同部位肌肉肌纖維類型組成差異

對性成熟日齡的廣西麻雞胸大肌、胸小肌、髂脛外側(cè)肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌和背闊肌等7個(gè)部位肌肉進(jìn)行ATPase染色和肌纖維類型統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖1和表2。由圖1-A可以較直觀地看出，性成熟日齡的廣西麻雞胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)肌肉色較白，而腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌和背闊肌肉色較紅。在堿性（pH10.4）條件下，ATPase染色圖中，染色深的是ATPase活性較強(qiáng)的快白肌纖維，染色淺的是ATPase活性較弱的慢肌纖維，染色效果居中的是ATPase活性居中的快紅肌纖維。由圖1-B的不同部位肌肉ATPase染色形態(tài)學(xué)圖片可以看出，胸大肌和胸小肌全部為深染的IIb型纖維，其他的幾種肌肉則是由I型、IIa型和IIb型肌纖維組成的混合型肌肉。7個(gè)部位肌肉的肌纖維類型組成及平均肌纖維直徑、平均肌纖維橫截面積、密度等指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。從肌纖維類型組成來看，胸部肌肉胸大肌和胸小肌僅由快白肌纖維（IIb型）組成；髂脛外側(cè)肌中，快白肌纖維（IIb型）比例最高，中間型纖維（IIa型）比例次之，慢肌纖維（I型）比例最低；腓腸肌內(nèi)側(cè)頭肌中，中間型纖維（IIa型）比例最高，慢肌纖維（I型）比例次之，快白肌纖維（IIb型）比例最低；而在恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌和背闊肌中，均為中間型纖維（IIa型）比例最高，快白肌纖維（IIb型）比例次之，慢肌纖維（I型）比例最低。將I型和IIa型合并到一起統(tǒng)計(jì)為紅肌纖維，則可以看出胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)肌主要由白肌纖維組成，而腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌和背闊肌則主要是由紅肌纖維組成。比較了不同部位肌肉的肌纖維直徑、橫截面積和密度差異，發(fā)現(xiàn)白肌纖維比例高的胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)肌的平均肌纖維直徑和橫截面積差異不顯著（＞0.05），但顯著高于紅肌纖維比例高的腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌和背闊肌（＜0.05）。紅肌纖維比例高的4種肌肉中，腓腸肌內(nèi)側(cè)頭和背闊肌的平均肌纖維直徑和橫截面積顯著低于恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭和縫匠?。ǎ?.05），而腓腸肌內(nèi)側(cè)頭和背闊肌、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭和縫匠肌兩兩之間差異均不顯著（＞0.05）。肌纖維密度則與平均肌纖維直徑和橫截面積結(jié)果相反，紅肌纖維比例高的肌肉肌纖維密度要顯著高于白肌纖維比例高的肌肉（＜0.05）。

（A）不同部位肌肉形態(tài)圖；（B）不同部位肌肉ATPase染色形態(tài)學(xué)圖，?：慢肌纖維；Пa：快紅肌纖維；Пb：快白肌纖維；XD：胸大?。籜X：胸小??；QW：髂脛外側(cè)??；FN：腓腸肌內(nèi)側(cè)頭；CN：恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭；FJ：縫匠??；BK：背闊肌。下同

表2 廣西麻雞不同部位肌肉肌纖維類型組成

同一列不同字母表示差異顯著(＜0.05) Least-squares means with different letters in the same column differed significantly (＜0.05)

2.2 m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因組織表達(dá)分析

從圖2可以看出，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429在所研究的廣西麻雞7個(gè)部位肌肉組織中均有表達(dá)，總體來說，4個(gè)基因在紅肌纖維比例高的肌肉中的表達(dá)量要高于白肌纖維比例高的肌肉。

METTL3、METTL14 和WATP基因表達(dá)模式較為一致，均在背闊肌中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（＜0.05）；3個(gè)基因在恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭和腓腸肌內(nèi)側(cè)頭的表達(dá)量顯著高于縫匠肌、胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)?。ǎ?.05）。METTL3 和WTAP基因在縫匠肌中的表達(dá)量要高于胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)肌，但兩兩之間差異不顯著(＞0.05）。METTL14基因在縫匠肌和髂脛外側(cè)肌中的表達(dá)量顯著高于胸大肌和胸小?。ǎ?.05），而在縫匠肌和髂脛外側(cè)肌中，胸大肌和胸小肌中的表達(dá)量差異不顯著(＞0.05）。

KIAA1429基因在腓腸肌內(nèi)側(cè)頭的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（＜0.05），在背闊肌中的表達(dá)量次之，顯著高于恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌、胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)?。ǎ?.05）；該基因在恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭和縫匠肌中的表達(dá)量也顯著高于胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)?。ǎ?.05），而在恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭和縫匠肌中，胸大肌、胸小肌和髂脛外側(cè)肌中兩兩之間的表達(dá)量差異不顯著(＞0.05）。

2.3 m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因在成肌細(xì)胞分化前后表達(dá)分析

為了進(jìn)一步在細(xì)胞水平研究m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達(dá)水平與成肌細(xì)胞分化的關(guān)系，檢測成肌分化標(biāo)志基因MyoG、MyoD以及甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429基因在成肌細(xì)胞分化前后的相對表達(dá)量，將新分離的雞胚成肌細(xì)胞（0 h）中上述基因的表達(dá)量平均值設(shè)為對照。成肌分化標(biāo)志基因的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果如圖3所示，總體來說，MyoG和MyoD基因在分化期的相對表達(dá)量高于增殖期。MyoG基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均隨著成肌細(xì)胞的分化而逐漸升高，至分化后5 d相對表達(dá)量最高，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（＜0.05）。MyoD基因mRNA和蛋白表達(dá)水平則呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，mRNA相對表達(dá)量在誘導(dǎo)分化當(dāng)天表達(dá)量最高，而蛋白相對表達(dá)量則是誘導(dǎo)分化后2 d達(dá)到最高，無論是mRNA水平還是蛋白水平D0和D2天表達(dá)量差異不顯著，但均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（＜0.05）。

（A）METTL3基因；（B）METTL14基因；（C）WTAP基因；（D）KIAA1429基因。柱形圖上字母相同者表示差異不顯著（P＞0.05），字母不同者表示差異顯著（P＜0.05）

A：mRNA表達(dá)；（B）蛋白表達(dá)。0 h：新分離的雞成肌細(xì)胞；19 h：增殖19 h的成肌細(xì)胞；D0：誘導(dǎo)分化當(dāng)天的成肌細(xì)胞；D2：誘導(dǎo)分化2天的成肌細(xì)胞；D5：誘導(dǎo)分化5天的成肌細(xì)胞。柱形圖上字母相同者表示差異不顯著（P＞0.05），字母不同者表示差異顯著（P＜0.05）

甲基化轉(zhuǎn)移酶4個(gè)基因mRNA表達(dá)結(jié)果如圖4所示，總體來說，4個(gè)基因在雞原代成肌細(xì)胞分化前后均有表達(dá)，且在分化后細(xì)胞中的表達(dá)量要高于增殖期細(xì)胞中的表達(dá)量。

METTL3和METTL14基因表達(dá)變化趨勢較為一致，均表現(xiàn)出先持續(xù)升高后下降的趨勢，在誘導(dǎo)分化后2 d細(xì)胞中的表達(dá)量最高，顯著高于增殖期和誘導(dǎo)分化當(dāng)天（D0）細(xì)胞中的表達(dá)量（＜0.05）。METTL3基因在剛分離0 h細(xì)胞中的表達(dá)量最低，顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的表達(dá)量（＜0.05）；在誘導(dǎo)分化后5 d（D5）細(xì)胞中的表達(dá)量相較于誘導(dǎo)分化后2 d（D2）細(xì)胞中的表達(dá)量有所下降，差異不顯著(＞0.05），但顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的表達(dá)量（＜0.05）。METTL14基因在剛分離0 h細(xì)胞中的表達(dá)量最低，除19 h外，顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的表達(dá)量（＜0.05）；在D5細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于在D2細(xì)胞中的表達(dá)量（＜0.05），略高于D0細(xì)胞中的表達(dá)量，但均顯著高于誘導(dǎo)分化前細(xì)胞中的表達(dá)量（＜0.05）。

WTAP和KIAA1429基因表達(dá)變化趨勢也較為一致，均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，0 h細(xì)胞中的表達(dá)量最低，顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)（＜0.05），至19 h顯著上升，D0天略有增加，接著顯著上升至D5達(dá)到高峰，WTAP基因在D5細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（＜0.05），而KIAA1429基因在D5細(xì)胞中的表達(dá)量略高于D2細(xì)胞中，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（＜0.05）。

2.4 雞成肌細(xì)胞分化前后內(nèi)源性mRNA m6A甲基化水平分析

為了了解分化前后雞成肌細(xì)胞中內(nèi)源性RNA m6A甲基化水平，采用比色法檢測成肌細(xì)胞分化前后不同時(shí)間點(diǎn)m6A甲基化水平，結(jié)果見圖5?？梢?，成肌細(xì)胞分化期的m6A甲基化水平顯著高于增殖期（＜0.05），誘導(dǎo)分化第2天（D2）m6A甲基化水平達(dá)到最高，顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)（＜0.05），隨后在誘導(dǎo)分化第5天（D5）顯著下降（＜0.05），略高于誘導(dǎo)分化當(dāng)天（D0），但兩者差異不顯著(＞0.05），說明m6A可能在雞成肌細(xì)胞分化過程中具有重要的調(diào)控作用。

(A) METTL3 ; (B) METTL14; (C) WTAP; (D) KIAA1429

圖5 雞成肌細(xì)胞分化前后的m6A RNA 甲基化水平

2.5 肌肉中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因之間及其表達(dá)量與肌纖維性狀的相關(guān)性

研究表明，m6A調(diào)控動物肌肉生長發(fā)育[20-21]。故本研究分析了肌肉中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)系及其對肌肉肌纖維性狀的影響，結(jié)果見表3。m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429表達(dá)水平之間均存在極顯著的正相關(guān)（＜0.01）。4個(gè)基因表達(dá)水平與紅肌纖維比例（I+IIa (%)）和肌纖維密度均呈顯著或極顯著正相關(guān)（＜0.05 or＜0.01），而與白肌纖維比例（IIb (%)）和肌纖維直徑則呈極顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.01）。這些結(jié)果說明肌肉中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因協(xié)同表達(dá)并對肌纖維類型的形成及轉(zhuǎn)換具有一定調(diào)控作用。

2.6 成肌細(xì)胞中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因之間及其表達(dá)量與m6A甲基化水平的相關(guān)性

成肌細(xì)胞中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)系及其對細(xì)胞中m6A甲基化水平的影響，結(jié)果見表4。m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429表達(dá)水平之間均存在極顯著的正相關(guān)（＜0.01）；甲基化轉(zhuǎn)移酶4個(gè)基因與成肌分化標(biāo)志基因表達(dá)水平存在正相關(guān)關(guān)系，其中，與MyoG基因mRNA表達(dá)水平之間達(dá)到極顯著（＜0.01）。成肌細(xì)胞中m6A甲基化水平與6個(gè)基因表達(dá)水平之間均表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，除與WTAP基因表達(dá)差異不顯著外（＞0.05），與其他5個(gè)基因表達(dá)水平之間均達(dá)到呈顯著或極顯著正相關(guān)（＜0.05 or＜0.01）。

表3 肌肉中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因之間及其表達(dá)量與肌纖維性狀的相關(guān)性

*表示顯著相關(guān)（0.01＜＜0.05＝；**表示極顯著相關(guān)（＜0.01）。下同

* shows that there are significant relationship between two different index (0.01＜＜0.05)；** shows that there are extreme significant relationship between two different index (＜0.01). The same as below

表4 成肌細(xì)胞中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因之間及其表達(dá)量與m6A甲基化水平的相關(guān)性

3 討論

3.1 廣西麻雞不同部位肌肉肌纖維類型組成

肌纖維作為構(gòu)成肌肉的基本單位，不僅決定雞骨骼肌的生長發(fā)育，還影響雞肉的生理生化特性、屠宰后肌肉的代謝活動及感官品質(zhì)。雞肌肉中肌纖維肥大、肌纖維類型的決定與轉(zhuǎn)化和肌內(nèi)脂肪沉積是影響優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成的主要因素，因此，肌纖維類型及其轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)是改善肉質(zhì)的重要途徑[1]。禽類所有骨骼肌均是由不同類型肌纖維混合構(gòu)成的，而各塊肌肉中各種肌纖維的比例不同，雞的胸肌以白肌纖維為主，腿部肌肉以紅肌纖維為主[18]。Suzuki等[22]以羅斯1品系為研究對象，發(fā)現(xiàn)腿部肌肉群的恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭和縫匠肌均以紅肌纖維為主，而髂脛外側(cè)肌以白肌纖維為主，背部肌肉群的背闊肌則以紅肌纖維為主。本研究首次采用ATPase染色法（pH10.4），成功對性成熟日齡的廣西麻雞胸大肌、胸小肌、髂脛外側(cè)肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌和背闊肌等7個(gè)部位肌肉進(jìn)行肌纖維分型及統(tǒng)計(jì)，結(jié)果驗(yàn)證了前人的研究結(jié)果[18, 22]，廣西麻雞性成熟日齡胸部肌肉群的胸大肌和胸小肌全部由白肌纖維組成，腿部肌肉群的恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭和縫匠肌均以紅肌纖維為主，而髂脛外側(cè)肌以白肌纖維為主，背部肌肉群的背闊肌則以紅肌纖維為主，其中腓腸肌內(nèi)側(cè)頭和背闊肌中紅肌纖維比例達(dá)到了80%左右。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，紅肌纖維比例多的肌肉肌纖維平均直徑顯著低于白肌纖維比例多的肌肉，而肌纖維密度則表現(xiàn)相反的結(jié)果，這也與課題組在前期對清遠(yuǎn)麻雞不同類型肌肉的研究結(jié)果一致[23]。不同部位肌肉肌纖維類型組成的不同也為研究肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)換的分子機(jī)理提供了參考，胸肌和腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、背闊肌可以作為肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)換機(jī)理研究的理想模型。

3.2 廣西麻雞肌肉中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因?qū)±w維性狀的調(diào)控

越來越多的研究表明，m6A RNA甲基化修飾在細(xì)胞分化、生長發(fā)育和壓力應(yīng)答等多種生理功能中均有重要作用[2-4]。mRNA的m6A修飾是由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化形成的，甲基化轉(zhuǎn)移酶3(METTL3)發(fā)揮功能亞基作用；甲基化轉(zhuǎn)移酶14(METTL14)主要負(fù)責(zé)識別RNA并與METTL3形成異二聚體[24]，KIAA1429同樣對甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的其他組分起到協(xié)同作用，也是m6A修飾的關(guān)鍵[25]。然而，目前尚無m6A RNA甲基化修飾在雞骨骼肌發(fā)育和分化中的相關(guān)研究報(bào)道。鑒于METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429在m6A甲基化修飾中的重要功能，本研究初步探討了上述基因在廣西麻雞肌肉肌纖維類型組成及成肌細(xì)胞分化中可能發(fā)揮的調(diào)控作用。

檢測了m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因在肌纖維類型組成不同的肌肉中的表達(dá)差異及其表達(dá)對肌纖維性狀的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所研究的甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429在廣西麻雞不同部位肌肉中均有表達(dá)，與Tao等[21]在豬上研究結(jié)果一致，他們對野豬、長白豬和榮昌豬3個(gè)不同品種的肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測定，繪制了m6A全轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m6A在肌肉組織中廣泛分布。本研究中，4個(gè)基因表達(dá)之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，且METTL3、METTL14和WTAP具有相似的表達(dá)模式，說明這些基因存在協(xié)同表達(dá)，這也可能與這些基因在甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中的作用有關(guān)[24, 26]，在人類疾病研究中也發(fā)現(xiàn)，METTL3/METTL14/WTAP復(fù)合物同向調(diào)控乳腺癌的發(fā)生并產(chǎn)生不良預(yù)后[27]。研究表明，甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生變化會影響體內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性從而影響基因的表達(dá)，在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中特異性敲除METTL3或METTL14會導(dǎo)致ESCs分化相關(guān)基因表達(dá)顯著降低[28]，而敲除KIAA1429基因則會導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯，胚胎在出生前出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，所研究的4個(gè)甲基化轉(zhuǎn)移酶基因在紅肌纖維比例高的肌肉中的表達(dá)量顯著高于白肌纖維比例高的肌肉，這提示甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因可能在雞肌纖維類型組成及轉(zhuǎn)換中發(fā)揮了一定的調(diào)控作用，關(guān)聯(lián)結(jié)果也表明，所研究的甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達(dá)與紅肌纖維比例呈顯著的正相關(guān)，與白肌纖維比例則呈顯著的負(fù)相關(guān)，說明這些基因的高表達(dá)有利于紅肌纖維的生成和維持。

3.3 雞m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因?qū)Τ杉〖?xì)胞分化的調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化修飾對成肌細(xì)胞分化具有重要的調(diào)控作用[16]。課題組前期研究了雞成肌細(xì)胞的增殖分化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)1 d時(shí)，已有部分細(xì)胞分化發(fā)生融合，形成多核肌管[30]，故選擇在分離后19h即使用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著成肌細(xì)胞的分化，成肌分化標(biāo)志基因MyoG的表達(dá)水平逐步上升，在誘導(dǎo)分化第5天最高；而MyoD基因則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這也與Sabourin[31]報(bào)道MyoD是成肌分化早期的標(biāo)志基因、MyoG是分化后期的標(biāo)志基因的結(jié)論相吻合。隨著成肌細(xì)胞的分化，內(nèi)源性RNA m6A甲基化水平逐步上升，分化期的水平顯著高于增殖期，且在誘導(dǎo)分化第2天達(dá)到最高水平，且與成肌分化標(biāo)志基因的表達(dá)存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明m6A甲基化修飾在成肌細(xì)胞分化中發(fā)揮著正向調(diào)控作用，與Chen等[16]在小鼠中的研究結(jié)果一致。所研究的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶4個(gè)基因在雞成肌細(xì)胞分化前后均有表達(dá)，且隨著成肌細(xì)胞的分化，表達(dá)量顯著上升，說明這些基因的表達(dá)對成肌細(xì)胞的分化具有正向的調(diào)控作用，這與Kudou 等[17]在小鼠增殖期成肌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，他們研究發(fā)現(xiàn)，METTL3通過介導(dǎo) MyoD 等肌源性轉(zhuǎn)錄因子 mRNA 的 5’UTR的 m6A 修飾維持增殖性骨骼肌祖細(xì)胞的肌源性潛能，提示 METTL3 參與肌源性祖細(xì)胞的骨骼肌分化潛能，同時(shí)也是骨骼肌分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究中，成肌細(xì)胞中甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達(dá)之間均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步在細(xì)胞水平證明了這些基因存在協(xié)同表達(dá)。在小鼠胚胎干細(xì)胞中敲低METTL3或METTL14的研究顯示：其數(shù)千個(gè)位點(diǎn)上的mRNA甲基化減少高達(dá)99%[32]；Wilms瘤相關(guān)蛋白（WTAP）則發(fā)揮調(diào)節(jié)亞基的作用，并在RNA代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]，METTL3、METTL14和WTAP的表達(dá)降低都會導(dǎo)致m6A水平的下降[24, 32]；本研究基因表達(dá)與細(xì)胞中內(nèi)源性RNA m6A甲基化水平關(guān)聯(lián)分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，所研究的甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達(dá)與m6A甲基化水平之間存在正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果說明在雞上這些甲基化轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)水平對m6A甲基化修飾水平具有促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

4.1 首次采用ATPase染色法了解了廣西麻雞胸大肌、胸小肌、髂脛外側(cè)肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、恥坐骨肌內(nèi)側(cè)頭、縫匠肌和背闊肌等7個(gè)部位肌肉的肌纖維類型組成，為雞肌肉肌纖維類型組成及轉(zhuǎn)換的分子機(jī)理研究提供了模型參考。

4.2 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究了m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因METTL3，METTL14，WTAP和KIAA1429在廣西麻雞不同部位肌肉中和成肌細(xì)胞分化前后的表達(dá)量差異，研究結(jié)果表明上述4個(gè)基因協(xié)同表達(dá)，在紅肌纖維為主的肌肉中的表達(dá)量高于白肌纖維為主的肌肉，在分化期成肌細(xì)胞中的表達(dá)量要顯著高于增殖期，4個(gè)基因的表達(dá)與成肌細(xì)胞中m6A甲基化修飾水平之間也存在正向調(diào)控機(jī)制，提示這4個(gè)甲基化轉(zhuǎn)移酶基因可能對雞肌纖維類型的組成、維持以及成肌細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究雞肌纖維類型的形成和轉(zhuǎn)換機(jī)理提供了新的思路。

[1] Lefaucheur L. A second look into fiber typing--relation to meat quality. Meat Science, 2010, 84(2): 257-270.

[2] Dominissini D, Moshitch-Moshkovitz S, Schwartz S, Salmon-Divon M, Ungar L, Osenberg S, Cesarks K, Jacob-Hirsch J, Amariglio N, Kupiec M, et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature, 2012, 485(7397): 201-206.

[3] Lin Z, Hsu P J, Xing X D, Fang J H, Lu Z K, Zou Q, Zhang K J, Zhang X, Zhou Y C, Zhang T, et al. Mettl3-/Mettl14-mediated mRNA N(6)-methyladenosine modulates murine spermatogenesis. Cell Research, 2017, 27: 1216-1230.

[4] Zhao B X S, Roundtree I A, He C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology,2017, 18: 31-42.

[5] Ashmore C R, Doerr L. Comparative aspects of muscle fiber types in different species. Experimental Neurology, 1971, 31: 408-418.

[6] Zierath J R, Hawley J A. Skeletal muscle fiber type: influence on contractile and metabolic properties. PLoS Biology, 2004, 2(10): e348.

[7] Schiaffino S, Sandri M, Murgia M. Activity-dependent signaling pathways controlling muscle diversity and plasticity. Physiology, 2007, 22: 269-278.

[8] Bokar J A, Shambaugh M E, Polayes D, Matera A G, Rottman F M. Purification and cDNA cloning of the AdoMet- binding subunit of the human mRNA (N6-adenosine)-methyltransferase. RNA, 1997, 3(11): 1233-1247.

[9] Bokar J A, Rath-Shambaugh M E, Ludwiczak R, Narayan P, Rottman F. Characterization and partial purification of mrna n6-adenosine methyltransferase from hela cell nuclei. internal mrna methylation requires a multisubunit complex. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(26), 17697-17704.

[10] Fu Y, Dominissini D, Rechavi G, He C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(5):293-306.

[11] Roundtree I A, Evans M E, Pan T, He C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell, 2017, 169(7): 1187-1200.

[12] Bi Z, Liu Y H, Zhao Y L, Yao Y X, Wu R F, Liu Q, Wang Y Z, Wang X X. A dynamic reversible RNA N(6)-methyladenosine modification: current status and perspectives. Journal of Cellular Physiology, 2019, 234(6): 1-9.

[13] Wang X, Feng J, Xue Y, Guan Z Y, Zhang D L, Liu Z, Gong Z, Wang Q, Huang J B, Tang C, et al. Structural basis of N(6)-adenosine methylation by the METTL3-METTL14 complex. Nature, 2016, 534: 575-578.

[14] Ping X L, SUN B F, WANG L, XIAO W, YANG X, WANG W J, ADHIKARI S, SHI Y, LV Y, CHEN Y S, ZHAO X, LI A, YANG Y, DAHAL U, LOU X M, LIU X, HUANG J, YUAN W P, ZHU X F, CHENG T, ZHAO Y L, WANG X Q, DANIELSEN J M R, LIU F, YANG Y G. Mammalian WTAP is a regulatory subunit of the RNA N6-methyladenosine methyltransferase. Cell Research, 2014, 24(2): 177-189.

[15] Yue Y, Liu J, Cui X, Cao J, Luo G, Zhang Z, Cheng T, Gao M, Shu X, Ma H, et al. VIRMA mediates preferential m(6)a mRNA methylation in 3'UTR and near stop codon and associates with alternative polyadenylation. Cell Discovery, 2018, 4: 10.

[16] Chen J N, Chen Y, Wei Y Y, Raza M A, Zou Q, Xi X Y, Zhu L, Tang G Q, Jiang Y Z, Li X W.Regulation of m6A RNA methylation and its effect on myogenic differentiation in murine myoblasts. Molecular Biology, 2019, 53(3): 384-392.

[17] Kudou K, Komatsu T, Nogami J, Maehara K, Harada A, Saeki H, Oki E, Maehara Y, Ohkawa Y. The requirement of Mettl3-promoted MyoD mRNA maintenance in proliferative myoblasts for skeletal muscle differentiation. Open Biology, 2017, 7(9): 170119.

[18] 羅克. 家禽解剖學(xué)與組織學(xué). 福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社. 1983: 27-44.

Luo K. Anatomy and Histology of Poultry. Fuzhou: Fujian Science and Technology Press. 1983: 27-44. (in Chinese)

[19] Luo W, Wu H, Ye Y, Li Z, Hao S, Kong L, Zheng X, Lin S, Nie Q, Zhang X. The transient expression of miR-203 and its inhibiting effects on skeletal muscle cell proliferation and differentiation. Cell Death & Disease, 2014, 5: e1347.

[20] XU T S, XU Z J, LU L Z, ZENG T, GU L H, HUANG Y Z, ZHANG S J, YANG P, WEN Y F, LIN D J, XING M P, HUANG L L, LIU G J, CHAO Z, SUN W P. Transcriptome-wide study revealed m6A regulation of embryonic muscle development in Dingan goose (Anser cygnoides orientalis). BMC Genomics, 2021, 22: 270.

[21] Tao X, Chen J, Jiang Y, Wei Y Y, Chen Y, Xu H M, Zhu L, Tang G Q, Li M Z, Jiang A A, et al. Transcriptome-wide N ( 6) -methyladenosine methylome profiling of porcine muscle and adipose tissues reveals a potential mechanism for transcriptional regulation and differential methylation pattern. BMC Genomics, 2017, 18(1): 336.

[22] Suzuki A, Tsuchiya T, Ohwada S, Tamate H. Distribution of myofiber types in thigh muscles of chickens. Journal of Morphology, 1985, 185: 145-154.

[23] Shu J T, Xiao Q, Shan Y J, Zhang M, Tu Y J, Ji G G, Sheng Z W, Zou J M. Oxidative and glycolytic skeletal muscles show marked differences in gene expression profile in Chinese Qingyuan partridge chickens. PLoS ONE, 2017, 12(8): e0183118.

[24] Liu J Z, Yue Y N, Han D L, Wang X, Fu Y, Zhang L, Jia G F, Yu M, Lu Z K, Deng X. A METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation. Nature Chemical Biology, 2014, 10(2): 93-95.

[25] Schwartz S, Mumbach M R, Jovanovic M, Wang T, Maciag K, Bushkin G G, Mertins P, Ter-Ovanesyan D, Habib N, Cacchiarelli D, et al. Perturbation of m6A writers reveals two distinct classes of mRNA methylation at internaland 5' Sites. Cell Reports, 2014, 8(1): 284-296.

[26] Ping X L, Sun B F, Wang L, Xiao W, Yang X, Wang W J, Yang Y C. Mammalian WTAP is a regulatory subunit of the RNA N6-methyladenosine methyltransferase. Cell Research, 2014, 24(2): 177-189.

[27] Wu L, Wu D, Ning J, Liu W, Zhang D. Changes of N6- methyladenosine modulators promote breast cancer progression. BMC Cancer, 2019, 19: 326．

[28] Pedro J B, Benoit M, Jinkai W, Qu K, Zhang J J, Li L J, Donna M B, Chang H Y. m6A RNA modification controls cell fate transition in mammalian embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2014, 15(6): 707-719.

[29] 魏巍. KIAA1429 在小鼠胚胎發(fā)育過程中的功能研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2017.

Wei W. Study on the function of KIAA1429 in mouse embryo development [D]. Nanning: Guangxi University, 2017. (in Chinese)

[30] Shan Y J, Ji G G, Zou J M, Zhang M, Tu Y J, Liu Y F, Ju X J, Shu J T. PGC-1α differentially regulates the mRNA expression profiles of genes related to myofiber type specificity in chicken. Journal of Integrative Agriculture, 2020, 19(8): 2083-2094.

[31] Sabourin L A, Rudnicki M A. The molecular regulation of myogenesis. Clinical Genetics, 2010, 57: 16-25.

[32] Geula S, Moshitch-Moshkovitz S, Dominissini D, Mansour A A, Kol Nitzan, Salman-Divon M, Hershkovitz V, Peer E, Mor N, Manor Y S, et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science, 2015, 347(6225): 1002-1006.

Relationship Between Expression Levels of Guangxi Partridge Chicken m6A Methyltransferase Genes, Myofiber Types and Myogenic Differentiation

SHU JingTing1, SHAN YanJu1, JI GaiGe1, ZHANG Ming1, TU YunJie1, LIU YiFan1, JU XiaoJun1, SHENG ZhongWei1, TANG YanFei2, LI Hua3, ZOU JianMin1*

1Key Laboratory for Poultry Genetics and Breeding of Jiangsu Province, Jiangsu Institute of Poultry Science, Yangzhou 225125, Jiangsu;2Guangxi Fufeng Farm Group Co., Ltd. Nanning 530024;3Foshan University, Foshan 528225, Guangdong

【Objective】It is widely accepted that the regulation of myofiber type composition and transition is an important source of variation to improve meat quality. Recently, several studies revealed that N6-methyladenosine (m6A) RNA methylation played a important biological role in the regulation of muscle differentiation. In the present study, the myofiber types of different location of skeletal muscles were identified in the native chicken breed-Guangxi partridge chicken, and the expression levels of the m6A methyltransferase genes (METTL3, METTL14, WTAP and KIAA1429) were first studied in different location of skeletal muscle and myogenic differentiation, which would provide a reference for clarifying the regulation mechanism of chicken myofiber type composition and transition.【Method】Myosin ATPase staining was used to identify the myofiber types and to measure the myofiber size and density of seven location of Guangxi partridge chicken muscles, including the(XD),(XX),(FJ),(CN),(FN),(QW) and(BK). Colorimetric method was used to detect the endogenous m6A methylation levels at different time points before and after myogenic differentiation. Expression of METTL3, METTL14, WTAP and KIAA1429 was quantified by RT-PCR in these seven muscles, as well as at the myoblasts separated on 0 h, 19 h, and cultured in differentiation medium on D0, D2, and D5, and the correlations between the gene expression levels and myofiber characteristics as well as m6A methylation levels were also analyzed by SPSS20.0 software.【Result】The XD and XX muscles of the breast muscle group were all composed of white myofibers, CN, FN and FJ muscles of the leg muscle group were mainly composed of red myofibers, and QW muscles were mainly composed of white myofibers, while the BK muscles of the back muscle group were mainly composed of red myofibers. The average fiber densities of muscles mainly composed of red myofibers were significantly higher than those mainly composed of white myofibers. The expression patterns of METTL3, METTL14, WTAP and KIAA1429 showed significant differences in tissue and time-specific fashion. Overall, the expression levels of the four genes in muscles mainly composed of red myofibers were higher than those mainly composed of white myofibers, and in differentiated myoblasts were significantly higher than those in proliferative myoblasts. The muscle METTL3, METTL14 and WTAP gene showed similar expression patterns, the highest expression level was appeared in BK muscles, which were significantly higher than that in all the other studied muscles; the expression levels in CN and FN muscles were also significantly higher than those in FJ, XD, XX and QW muscles. The highest expression level of KIAA1429 was appeared in FN muscles, which were significantly higher than that in all the other studied muscles; the expression levels in BK muscles were also significantly higher than those in CN, FJ, XD, XX and QW muscles; the lowest expression level was appeared in XD muscles, but the differences were not significantly when compared to XX and QW. In chicken myoblasts, both METTL3 and METTL14 gene showed continuous increasing and then decreasing expression pattern, the lowest expression level was appeared at 0h newly separated myoblasts, and the highest level was appeared at D2 induced differentiation myoblasts, which were significantly higher than those in proliferative myoblasts and D0 induced differentiation myoblasts. The consistent expression pattern was also found in WTAP and KIAA1429 gene, showed continuous increasing expression pattern; the lowest expression level was appeared at 0h newly separated myoblasts, significantly lower than that in other studied time points, then significantly increased at 19 h, and then slightly increased at D0, then significantly increased from D0 to D5. The endogenous m6A RNA methylation levels increased along with myogenic differentiation, and the levels in differentiation myoblasts also showed significantly higher than those in proliferative myoblasts, the highest methylation level was appeared at D2 induced differentiation myoblasts, then significantly increased from D2 to D5; however, the methylation level at D5 was higher than that at D0. Significant positive relationships were observed for the expression of studied genes in different muscle tissues as well as in myoblasts. Meanwhile, the skeletal muscle expression of these four genes was all showed significant positive relationships with red myofiber ratio, and significant negative relationships with red myofiber ratio. Positive relationships were also observed between the expression of studied genes in myoblasts and m6A methylation levels.【Conclusion】There were differences in muscle fiber type composition in different parts of the muscle of Guangxi partridge chicken. Differential expression and coordinated developmental regulation of the selected m6A methyltransferase genes in the chicken skeletal muscles and myoblasts, and these genes might play a role in the regulation of the myofiber type composition, maintain, and myogenic differentiation.

Guangxi partridge chicken; gene expression; m6A methyltransferase genes; myofiber type; myogenic differentiation

2020-12-16；

2021-03-30

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金（CX(20)3003）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-41）、江蘇省種業(yè)創(chuàng)新揭榜掛帥項(xiàng)目（JBGS[2021]107）、江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（PZCZ201728）、江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心（JATS［2021］396）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20211121，BK20210955）

束婧婷，E-mail：shujingting@163.com。通信作者鄒劍敏，E-mail：jqszjm@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）