殷龍 賈艷麗 姚月琴 張儉 譚小釘
摘 要 目的:使用糖型調(diào)節(jié)試劑優(yōu)化地諾單抗(denosumab)生物類似藥的N-糖基化修飾,使其主要糖型G0F和G1F的比例與地諾單抗高度類似。方法:利用單因素和DOE試驗(yàn)方法,考察不同濃度氯化錳、半乳糖及尿苷對(duì)地諾單抗生物類似藥糖基化修飾的影響。結(jié)果:經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)、DOE分析及200 L細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大,確定糖型調(diào)節(jié)劑氯化錳和半乳糖的最佳用量分別是150 mmol/L和35.56 mmol/L。結(jié)論:使用糖型調(diào)節(jié)劑氯化錳和半乳糖能有效調(diào)節(jié)地諾單抗生物類似藥的糖基化修飾比例,可為其他單抗生物類似藥生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供借鑒。
關(guān)鍵詞 生物類似藥 糖基化 細(xì)胞培養(yǎng)
中圖分類號(hào):TQ460.62; TQ464.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2022)03-0077-05
N-glycosylation optimization for biosimilar denosumab
YIN Long, JIA Yanli, YAO Yueqin, ZHANG Jian, TAN Xiaoding
(Jiangsu Mabwell Health Pharmaceutical R&D Co., Ltd., Taizhou 225300, China)
ABSTRACT Objective: To optimize the N-glycosylation of denosumab biosimilar using some glycosylation reagents so as to make the proportion of G0F and G1F be highly similar to denosumab. Methods: The effects of the different concentrations of manganese chloride、galactose and uridine on the glycosylation of denosumab biosimilar were studied by single factor and DOE assays. Results: A preferred combination including manganese chloride 150 mmol/L, galactose 35.56 mmol/L was obtained by single factor test, DOE analysis and 200 L cell cultivation. Conclusion: The use of manganese chloride and galactose can effectively regulate the glycosylation modification ratio of denosumab biosimilar, which can provide a reference for the optimization of production process of the other mono-cloning antibody biosimilars.
KEy wORDS biosimilar; glycosylation; cell culture
抗體藥物屬于生物大分子藥物,其生物功能的發(fā)揮離不開(kāi)復(fù)雜的翻譯后修飾。糖基化(glycosylation)作為抗體最重要的翻譯后修飾,是指蛋白質(zhì)或脂質(zhì)在酶的作用下連接上糖鏈的過(guò)程,其對(duì)抗體的生物活性和體內(nèi)代謝有著重要的作用[1],不同的糖基化對(duì)抗體親和力和體內(nèi)代謝具有顯著影響[2-4]。抗體藥物中常見(jiàn)的糖型有巖藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、唾液酸(Sia)和甘露糖(Man)修飾,不同比例的糖型修飾可影響抗體藥物的穩(wěn)定性、電荷異構(gòu)、生物學(xué)活性等,如巖藻糖修飾影響單抗的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)[5-6];高甘露糖修飾可縮短藥物的半衰期[7];半乳糖修飾可提高抗體與補(bǔ)體的親和力、增強(qiáng)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)效應(yīng)[8]。因此,糖基化修飾通常作為抗體藥物生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(critical quality attributes,CQA)進(jìn)行調(diào)控[9]。
地諾單抗糖基化形式為N-糖基化。N-糖基化是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上由糖基轉(zhuǎn)移酶催化、在內(nèi)分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白的天冬酰氨殘基的氨基上結(jié)合寡糖的過(guò)程,寡糖中的乙酰葡萄糖與多肽鏈中天冬酰胺殘基的酰胺氮連接形成N-連接糖蛋白。N-糖基化的位點(diǎn)是Asn-X-Thr/Ser(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)3個(gè)氨基酸殘基組成的序列段[10-11]。單克隆抗體糖基化類型主要有G0、G0F、G1F、G2F、Man5等[1],地諾單抗的糖基化類型以G0F和G1F為主,所占比例分別約為62%和20%;本研究中的單抗為地諾單抗生物類似藥,其糖基化類型以G0F為主,所占比例約為80%。糖基化修飾的差異可能導(dǎo)致藥物結(jié)合活性、半衰期等差異,從而影響藥效,考慮到生物類似藥用藥的安全性,需將糖型優(yōu)化至與地諾單抗高度類似。
糖型調(diào)節(jié)是生物藥工藝研發(fā)過(guò)程中常遇到的工藝難題,影響單克隆抗體糖基化類型及比例的因素有很多,如細(xì)胞株、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)參數(shù)控制等[1,12-16] ,在細(xì)胞株構(gòu)建和篩選過(guò)程中,可通過(guò)基因改造等方式進(jìn)行糖基化優(yōu)化,如利用基因敲除降低巖藻糖基化比例從而增強(qiáng)抗體的ADCC效應(yīng);在細(xì)胞培養(yǎng)工藝中可通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基的糖分、金屬離子濃度等條件來(lái)改變蛋白質(zhì)的糖基化類型及比例。細(xì)胞株構(gòu)建雖然能從根本上決定糖型的類型與比例,但通過(guò)細(xì)胞株改造進(jìn)行糖型調(diào)節(jié)耗時(shí)、耗力,并不適用于生物類似藥的工藝優(yōu)化。通過(guò)培養(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)及控制參數(shù)優(yōu)化是常見(jiàn)的優(yōu)化方式,但細(xì)胞培養(yǎng)方式和控制參數(shù)對(duì)糖基化的影響通常是多因素交互作用的,在工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中需要考慮工藝控制的可操作性和精確性;另外,在糖型優(yōu)化過(guò)程中不僅需要選擇合適的糖型調(diào)節(jié)試劑,還需要兼顧同一試劑對(duì)不同糖型的影響程度和影響趨勢(shì),以及產(chǎn)品本身的其它關(guān)鍵質(zhì)量屬性,如電荷異構(gòu)體、蛋白純度等;同時(shí),不同培養(yǎng)規(guī)模條件下細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的變化、不同反應(yīng)器控制策略的差異導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程對(duì)糖型調(diào)節(jié)試劑需求有所差異,因此工藝放大過(guò)程可能帶來(lái)的結(jié)果差異也需要特別關(guān)注。
本研究選擇氯化錳、半乳糖和尿苷作為糖型調(diào)節(jié)劑,先采用單因素方法測(cè)試三種糖型調(diào)節(jié)劑的效果,再采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(design of experiment,DOE)的方法找到合適劑量,并將優(yōu)化后培養(yǎng)工藝放大到中試規(guī)模確證,確保優(yōu)化后糖型可達(dá)到與原研藥高度類似的效果,且對(duì)抗體的其他質(zhì)量屬性無(wú)明顯影響。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
表達(dá)地諾單抗生物類似物的重組細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞,培養(yǎng)基為CD CHO(Gibco公司);地諾單抗對(duì)照抗體采購(gòu)于市售藥物;糖型調(diào)節(jié)劑為氯化錳、尿苷(Sigma公司)、半乳糖(Pfanstiehl公司)。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)
1.2.1 搖瓶培養(yǎng)
從細(xì)胞庫(kù)取出CHO細(xì)胞種子,在搖瓶上逐步擴(kuò)大培養(yǎng)體積制備實(shí)驗(yàn)用種子細(xì)胞,培養(yǎng)條件為36.8 ℃、5% CO2、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min;采用分批補(bǔ)料(fed-batch)培養(yǎng)方式進(jìn)行抗體制備,d 0~5培養(yǎng)溫度為36.8 ℃、d 6降溫至33 ℃,培養(yǎng)時(shí)間為14 d,培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和活率。
1.2.2 生物反應(yīng)器培養(yǎng)
200 L規(guī)模培養(yǎng)工藝采用XDR 200反應(yīng)器(Cytiva公司)、分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式,d 0~5培養(yǎng)溫度36.8 ℃、d 6降溫至33 ℃,培養(yǎng)過(guò)程中控制pH 6.95、溶氧40%、攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min、培養(yǎng)時(shí)間14 d,監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和活率。優(yōu)化前工藝不添加任何糖型調(diào)節(jié)劑。
1.3 糖型優(yōu)化方法
1.3.1 單因素
采用搖瓶培養(yǎng)對(duì)氯化錳、半乳糖和尿苷三種糖型調(diào)劑進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),每個(gè)糖型調(diào)節(jié)劑設(shè)置3個(gè)濃度水平,氯化錳測(cè)試濃度為154、308和616 μmol/L;半乳糖測(cè)試濃度為15.4、30.8和61.6 mmol/L;尿苷測(cè)試濃度為1.65、3.3和6.6 mmol/L。
1.3.2 多因素DOE析因糖型優(yōu)化
根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果確定選擇氯化錳和半乳糖作為糖型調(diào)節(jié)劑,進(jìn)行2因素2水平DOE析因糖型優(yōu)化實(shí)驗(yàn),方案見(jiàn)表1。氯化錳濃度設(shè)置2水平分別是150、350 μmol/L,半乳糖濃度設(shè)置2水平分別是10、50 mmol/L。
1.3.3 200 L培養(yǎng)規(guī)模糖型優(yōu)化
在優(yōu)化前工藝基礎(chǔ)上批次XDR200-1、XDR200-2、XDR200-3添加氯化錳和半乳糖調(diào)節(jié)劑的用量分別為222.22 mmol/L、35.56 mmol/L,而批次XDR200-4分別為150 mmol/L、35.56 mmol/L。
1.4 產(chǎn)量和質(zhì)量檢測(cè)方法
IgG定量采用蛋白A親和高效液相色譜法檢測(cè)(Waters公司,Arc);抗體純度采用分子排阻高效液相色譜(SEC-HPLC)方法進(jìn)行檢測(cè);電荷異構(gòu)體采用離子交換高效液相色譜(CEX-HPLC)方法進(jìn)行檢測(cè),N-糖型采用2-AB標(biāo)記法超高效液相色譜(Waters公司,H-Class)檢測(cè)[17] 。
1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法
多因素DOE析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果使用JMP軟件進(jìn)行分析,以G0、G0F、Man5和G1F這4種主要的糖型為響應(yīng)建模,分析不同因子對(duì)其影響程度及趨勢(shì)[16] 。
2.1 不同糖型調(diào)節(jié)劑對(duì)糖型質(zhì)量的影響
在搖瓶培養(yǎng)規(guī)模上進(jìn)行Fed-batch細(xì)胞培養(yǎng),進(jìn)行氯化錳、半乳糖和尿苷這三種不同劑量糖型調(diào)節(jié)劑對(duì)糖型比例優(yōu)化的效果,結(jié)果如表2、圖1、圖2所示。
氯化錳的高、中、低劑量分別是154、308和616μmol/L,在這個(gè)范圍內(nèi)氯化錳對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體產(chǎn)量、純度和電荷異構(gòu)體比例均無(wú)明顯影響,但對(duì)糖型有明顯影響。氯化錳 616 μmol/L已將G0F降至低于地諾單抗,同時(shí)G0和Man5比例顯著升高,提示高濃度錳離子對(duì)單抗G0和Man5修飾影響較大;氯化錳 154 μmol/L和308μmol/L可將G0、G0F、Man5、G1F比例調(diào)節(jié)至與地諾單抗類似,提示氯化錳有效用量在154~308 μmol/L之間。
半乳糖的高、中、低劑量分別是15.4、30.8和61.6 mmol/L,在這個(gè)范圍內(nèi)半乳糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體產(chǎn)量、純度和電荷異構(gòu)體比例均無(wú)明顯影響,其對(duì)糖型的G0、Man5無(wú)明顯影響,但可降低G0F比例及提升G1F比例,使其與地諾單抗類似,但其作用與劑量無(wú)明顯關(guān)系,提示半乳糖有效用量為30.8 mmol/L左右。
尿苷的高、中、低劑量分別是1.65、3.3和6.6 mmol/L,在此范圍內(nèi)尿苷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體產(chǎn)量、純度和電荷異構(gòu)體比例及糖型均無(wú)明顯影響,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將不再使用尿苷來(lái)調(diào)節(jié)糖型。
2.2 多因素DOE析因糖型優(yōu)化結(jié)果
以氯化錳、半乳糖為因子,以G0、G0F、Man5和G1F這4種主要糖型為響應(yīng),采用JMP軟件進(jìn)行分析,結(jié)果表明,氯化錳對(duì)糖型影響顯著,隨濃度的升高顯著降低G0F、G1F比例,同時(shí)提高G0、Man5比例;半乳糖對(duì)糖型G0、G0F、Man5影響較小,對(duì)G1F影響顯著,隨著濃度升高可提高G1F比例(圖3)。根據(jù)意愿刻畫,確定氯化錳和半乳糖組合用量分別是222.22 mmol/L和35.56 mmol/L。
2.3 200 L培養(yǎng)規(guī)模放大試驗(yàn)
搖瓶培養(yǎng)工藝條件下確定氯化錳和半乳糖用量后,將工藝放大至200 L規(guī)模,考察工藝的可放大性。進(jìn)行連續(xù)3批工藝放大培養(yǎng)(XDR200-1、XDR200-2、XDR200-3),培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)、活率、抗體產(chǎn)量一致性良好,批次間無(wú)顯著差異,經(jīng)純化制備后抗體關(guān)鍵質(zhì)量屬性純度、電荷異構(gòu)體比例結(jié)果與工藝優(yōu)化前無(wú)顯著差異,同時(shí)與地諾單抗保持一致(圖4、表3);糖型G0、G0F、G1F比例較工藝優(yōu)化前顯著改善(圖5),但與地諾單抗相比,G0F比例略低,Man5比例較高,可能原因?yàn)楣に嚪糯蠛蠹?xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的變化、不同反應(yīng)器控制策略的差異導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程對(duì)糖型調(diào)節(jié)劑的需求量有所減少,結(jié)合小試單因素、DOE試驗(yàn)中高濃度氯化錳對(duì)Man5比例調(diào)節(jié)的影響趨勢(shì),推測(cè)Man5比例升高是因?yàn)楣に嚪糯蠛蠹?xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中錳離子濃度過(guò)高,因此降低氯化錳用量至150 mmol/L,進(jìn)行第4批(XDR200-4)200 L培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明,降低氯化錳濃度至150 mmol/L后,培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)、活率及抗體產(chǎn)量均無(wú)影響,關(guān)鍵質(zhì)量屬性純度、電荷異構(gòu)體比例與工藝優(yōu)化前產(chǎn)物及地諾單抗一致性良好;隨著錳離子量減少M(fèi)an5比例較前三批結(jié)果顯著降低,與地諾單抗比例一致,G0F、G1F比例略有上升(表3、圖4、圖5)。綜合對(duì)比G0、G0F、Man5、G1F主要糖型比例,氯化錳、半乳糖用量分別為150 mmol/L和35.56 mmol/L時(shí),主要糖型比例與地諾單抗高度一致,且抗體的其他質(zhì)量屬性純度、電荷異構(gòu)體比例無(wú)明顯差異,達(dá)到優(yōu)化目的。
工藝過(guò)程中添加調(diào)節(jié)試劑是一種相對(duì)簡(jiǎn)單有效的糖基化優(yōu)化方式,但是不同調(diào)節(jié)試劑的濃度需求以及對(duì)不同糖基化類型的影響程度可能會(huì)有所差異,通常需要多種試劑的組合使用才能實(shí)現(xiàn);同時(shí),在工藝放大、培養(yǎng)規(guī)模變化時(shí)會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的變化,從而導(dǎo)致對(duì)糖型調(diào)節(jié)試劑需求的變化,因此在小試工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中需要兼顧工藝放大的可行性。本研究使用氯化錳、半乳糖通過(guò)單因素試驗(yàn)、DOE分析對(duì)地諾單抗生物類似藥N-糖基化修飾比例進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)將優(yōu)化工藝放大至200 L規(guī)模,實(shí)現(xiàn)地諾單抗生物類似藥糖基化水平與原研藥地諾單抗的高度可比。
利用DOE分析方法可有效通過(guò)較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù),高效快速地確定糖型調(diào)節(jié)劑的交互影響及作用濃度,大大提高工藝優(yōu)化效率。同時(shí)本研究在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加糖型調(diào)節(jié)試劑的工藝優(yōu)化方式對(duì)地諾單抗生物類似藥的糖基化修飾調(diào)節(jié)是有效的,這為其他單克隆抗體生物類似藥工藝優(yōu)化提供了較好的借鑒。
參考文獻(xiàn)
[1] 張忠兵, 羅建輝. 單克隆抗體糖基化修飾研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2020, 15(4): 426-431.
[2] 王沖. 單克隆抗體糖基化修飾研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué), 2017, 37(3): 247-252.
[3] 劉曉宇, 常軍亮, 劉玉林. 單克隆抗體糖基化修飾的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2020, 33(2): 216-221.
[4] 衣常紅, 高春芳. IgG糖基化修飾及其意義研究進(jìn)展[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2010, 26(11): 1051-1056.
[5] Konno Y, Kobayashi Y, Takahashi K, et al. Fucose content of monoclonal antibodies can be controlled by culture medium osmolality for high antibody-dependent cellular cytotoxicity[J]. Cytotechnology, 2011, 64(3): 249-265.
[6] Nguyen Dang A, Mun M, Rose CM, et al. Interaction of cell culture process parameters for modulating mAb afucosylation[J]. Biotechnol Bioeng, 2019, 116(4): 831-845.
[7] Goetze AM, Liu YD, Zhang Z, et al. High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans[J]. Glycobiology, 2011, 21(7): 949-959.
[8] Hodoniczky J, Zheng YZ, James DC. Control of recombinant monoclonal antibody effector functions by Fc N-Glycan remodeling in vitro[J]. Biotechnol Prog, 2005, 21(6): 1644-1652.
[9] Rathore AS, Weiskopf A, Reason AJ. Defining critical quality attributes for monoclonal antibody therapeutic products[J]. Biopharm Int, 2014, 27(7): 34-43.
[10] 張芳, 許之玨, 徐穎姣, 等. IgG糖基化與疾病相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2017, 29(4): 319-330.
[11] Werner RG, Kopp K, Schlueter M. Glycosylation of therapeutic proteins in different production systems[J]. Acta Paediatr, 2007, 96(455): 17-22.
[12] Grainger RK, James DC. CHO cell line specific prediction and control of recombinant monoclonal antibody N-glycosylation[J]. Biotechnol Bioeng, 2013, 110(11): 2970-2983.
[13] Kildegaard HF, Fan Y, Sen JW, et al. Glycoprofiling effects of media additives on IgG produced by CHO cells in fed-batch bioreactors[J]. Biotechnol Bioeng, 2016, 113(2): 359-366.
[14] Gramer MJ, Eckblad JJ, Donahue R, et al. Modulation of antibody galactosylation through feeding of uridine, manganese chloride, and galactose[J]. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(7): 1591-1602.
[15] Fan Y, Jimenez Del Val I, Müller C, et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation[J]. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(3): 521-535.
[16] 徐菲菲, 王太海, 楊玲, 等. 運(yùn)用DOE方法降低抗體生產(chǎn)過(guò)程中五聚甘露糖水平的工藝開(kāi)發(fā)[J]. 藥物生物技術(shù), 2017, 24(4): 305-309.
[17] 張峰, 于傳飛, 王文波, 等. 人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體質(zhì)控方法的建立[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2016, 51(13): 1101-1106.