刺玫果中花色苷提取工藝優(yōu)化及抗氧化性分析

周新宇，呂重寧，秦汝蘭,

（1.通化師范學院醫(yī)藥學院，吉林通化 134000；2.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧沈陽 110016）

刺玫果（Rosa davuricaPall.）為薔薇科薔薇屬植物刺玫的成熟果實，又名薔薇果、山刺玫果、野刺玫果等。野生資源豐富，主要分布于我國東北、內(nèi)蒙、山西及河北等省區(qū)。刺玫果中含有黃酮、維生素、皂苷、多糖、三萜類等多種活性物質(zhì)，其中研究較多的為黃酮類化合物[1]，但關(guān)于刺玫果中花色苷的研究報道較少。刺玫果果實酸甜可口，營養(yǎng)豐富。據(jù)《中國中藥大辭典》中記載，刺玫果可用于治療胃腹脹痛、小兒積食、咳嗽、腹瀉及維生素C缺乏癥等疾病，并具有明顯的抗疲勞、耐缺氧、抗炎及增強免疫等活性[2-3]。目前，以野生刺玫果為主要原料的食品、保健品和功能性飲料不斷出現(xiàn)[4]。

花色苷（anthocyanins）是具有2-苯基苯并毗喃結(jié)構(gòu)的一類糖苷衍生物，其共軛雙鍵在465～560 nm處有最大光吸收，為植物界中廣泛分布的一種水溶性色素，普遍存在于植物的花、果實、根、莖、葉中，具有抗氧化、保護心血管、抗腫瘤等多種功能[5-6]。近年來對于花色苷抗氧化作用的研究較多，如吳映梅等[7]通過體外抗氧化實驗得出黑莓中的總花色苷對DPPH自由基和羥自由基具有較強的清除作用。閆亞美等[8]研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1黑加侖花色苷提取液較同質(zhì)量濃度的抗壞血酸，表現(xiàn)出更強的還原能力和自由基清除能力。何傳波等[9]研究紫薯中花色苷抗氧化活性得出總抗氧化能力為101.38 U·mg-1，表明其花色苷抗氧化活性較強。綜合文獻分析，進一步揭示花色苷為最直接有效、安全的自由基清除劑[10]。此外，隨著研究水平的不斷提高，人們逐漸發(fā)現(xiàn)合成色素對人體健康存在一定的危害，因而從天然植物中尋找花色苷作為食品著色劑引起了人們的廣泛關(guān)注[11]。

本研究以花色苷得率為評價指標，采用Plackett-Burman設(shè)計并結(jié)合Box-Behnken實驗確定刺玫果中花色苷的最佳提取工藝，通過多種體外抗氧化方法評價刺玫果中花色苷的抗氧化活性，為刺玫果資源的開發(fā)及后續(xù)產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺玫果樣品 采于通化師范學院周邊經(jīng)通化師范學院于俊林教授鑒定為刺玫果（Rosa davuricaPall.）正品，烘干粉碎后備用；無水乙醇、丙酮、甲醇、鹽酸等試劑 均為國產(chǎn)分析純；DPPH（1，1－二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽 阿拉丁試劑，上海有限公司。

KQ-250E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；YP2002電子天平 上海衡際科學儀器有限公司；TGL-16B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；PB-10酸度計 北京賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺玫果中花色苷的提取工藝 刺玫果→粉碎至粗粉→按考察的實驗條件進行超聲提取→12000 r·min-1離心→上清液→用提取溶液補足或濃縮至25 mL→刺玫果花色苷提取物

1.2.2 最大吸收波長的確定 稱取刺玫果粉末1 g，按1:15 g·mL-1的料液比加15 mL鹽酸酸化的60%乙醇溶液（pH2），溫度50 ℃，超聲提取30 min，2次，12000 r·min-1離心，上清液定容于25 mL容量瓶中，于200～700 nm處進行全波長掃描，測定刺玫果中花色苷的最大吸收波長[12]。

1.2.3 提取溶劑的選擇 稱取刺玫果粉末1 g，4份，按1:15 g·mL-1的料液比分別加入15 mL鹽酸酸化的蒸餾水、鹽酸酸化的甲醇溶液、鹽酸酸化的60%乙醇溶液、鹽酸酸化的丙酮溶液，各溶液pH均為2，溫度為50 ℃，超聲提取30 min，2次，離心，上清液定容于25 mL容量瓶中，并于532 nm處測定各樣品溶液的吸光度值，確定最佳提取溶劑，每組實驗平行3次。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料液比考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，料液比分別按照1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g·mL-1，其余因素按“1.2.2”項下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長處測定吸光度值，每組實驗平行3次。

1.2.4.2 溶劑pH考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，溶劑pH分別為1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”項下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長處測定吸光度值，每組實驗平行3次。

1.2.4.3 超聲溫度考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，超聲溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，其余因素按“1.2.2”項下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長處測定吸光度值，每組實驗平行3次。

1.2.4.4 乙醇體積分數(shù)考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，乙醇體積分數(shù)分別為20%、40%、60%、80%、100%，其余因素按“1.2.2”項下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長處測定吸光度值，每組實驗平行3次。

1.2.4.5 超聲時間考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，超聲時間分別為10、20、30、40、50 min，其余因素按“1.2.2”項下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長處測定吸光度值，每組實驗平行3次。

1.2.4.6 超聲次數(shù)考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，超聲次數(shù)分別為1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”項下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長處測定吸光度值，每組實驗平行3次。

1.2.5 Plackett-Burman試驗設(shè)計 通過Plackett-Burman試驗對可能影響刺玫果花色苷的6個因素，包括溶劑pH、超聲時間、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、料液比、超聲次數(shù)進行主效應(yīng)分析，選用n=12的Plackett-Burman因素篩選試驗，6個因素分別對應(yīng)表中的6個列，每個因素取低水平“-1”和高水平“1”，以樣品溶液的吸光度值A(chǔ)為響應(yīng)值對實驗結(jié)果進行分析，得出各因素的F值和P值，選取影響結(jié)果的關(guān)鍵因素，Plackett-Burman實驗因素水平表和編碼見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素水平和編碼Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental

1.2.6 Box-Behnken實驗設(shè)計 在Plackett-Burman實驗基礎(chǔ)上，選取超聲時間（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）四個因素，以刺玫果花色苷吸光度值（Y）為響應(yīng)值，通過四因素三水平實驗進行響應(yīng)面分析，實驗設(shè)計因素水平見表2。

表2 Box-Behnken實驗因素與水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.7 驗證性實驗 為確定響應(yīng)面回歸模型的建立的準確性，對模型預(yù)測的最優(yōu)工藝條件進行適當調(diào)整后進行驗證，實驗平行操作3次。通過pH示差法[13-14]，按照下列公式計算刺玫果中花色苷含量。

式中：X為刺玫果花色苷含量（mg·g-1）；ΔT為吸光度ApH1和ApH4.5的差值；V為稀釋體積（L）；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449 g·mol-1）；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)[26900 L·（mol·cm）-1]；m為樣品質(zhì)量（g）；b為比色皿厚度（1 cm）。

1.2.8 刺玫果中花色苷體外抗氧化活性研究

1.2.8.1 待測溶液的配制 按“1.2.7”項下最佳工藝條件提取刺玫果花色苷，減壓濃縮至稠膏狀，臨用前稀釋制成所需質(zhì)量濃度。

1.2.8.2 刺玫果中花色苷對DPPH·清除率測定 精確稱取15.7685 mg的DPPH粉末，置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.4 mmol·L-1的DPPH溶液，避光保存。按照“1.2.8.1”項下方法，制成1、2、3、4、5 mg·mL-1濃度供試品溶液。試驗分為樣品組、對照組和空白組，并于517 nm波長處測定各組吸光度值，其中空白組和樣品組加入DPPH乙醇溶液后需避光靜置1 h，其它操作相同。以VC溶液作為參照，按下列公式計算刺玫果中花色苷對DPPH·清除率[15-16]。

式中：A空白為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL蒸餾水的吸光度值；A對照為2 mL蒸餾水+2 mL樣品溶液的吸光度值；A樣品為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL樣品溶液的吸光度值。

1.2.8.4 刺玫果中花色苷對ABTS+·的清除能力的測定 分別取7 mmol·L-1ABTS水溶液和2.5 mmol·L-1過硫酸鉀水溶液5 mL，混勻，置于暗處反應(yīng)12～16 h，使其產(chǎn)生ABTS+·，用蒸餾水將ABTS+·溶液稀釋，使其在734 nm波長下的吸光值為0.70±0.02，得到工作液。按照“1.2.8.1”項下方法，制備2、4、6、8、10 mg·mL-1濃度供試品溶液。吸取1 mL系列濃度刺玫果花色苷溶液置于具塞試管中，分別加2 mL ABTS+·溶液，混合均勻，10 min后測定734 nm處的吸光值記作A1；吸取2 mL ABTS+·溶液與1 mL蒸餾水，混合10 min后測定734 nm處的吸光值記作A0；吸取2 mL磷酸鹽緩沖液與1 mL系列濃度刺玫果花色苷溶液，混合10 min后測定734 nm處的吸光值記作A2。以VC作為陽性對照，操作方法同上。按下列公式計算刺玫果中花色苷對ABTS+·清除率[19]。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素試驗中Duncan’s多重差異顯著性分析并計算樣品對各自由基清除能力為50%時的IC50。實驗數(shù)據(jù)圖采用Excel 2010進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺玫果中花色苷最大吸收波長的確定

由圖1可知，刺玫果花色苷提取液在532 nm處具有吸收峰。因此確定刺玫果花色苷最大吸收波長為532 nm。

圖1 刺玫果花色苷在200～700 nm波長下的吸光度值Fig.1 Absorbance of anthocyanins of Rosa davurica Pall. at 200～700 nm

2.2 提取溶劑的確定

由于花色苷是極性分子，因此常用乙醇、甲醇或丙酮做為提取溶劑[20]，Bridgers等以甲醇、乙醇、酸化甲醇和酸化乙醇從紫紅薯中提取花色苷時發(fā)現(xiàn)，酸化甲醇的提取效果最好[12]。Awika等用丙酮和酸化甲醇提取黑高粱花色苷時發(fā)現(xiàn)酸化甲醇的提取效果優(yōu)于丙酮，經(jīng)過液相分析得出丙酮提取的花色苷分子結(jié)構(gòu)被修飾[21]。由圖2可知，4種提取溶劑從刺玫果中提取花色苷后測定的吸光度值基本與文獻得出的結(jié)論一致，分別為甲醇＞乙醇＞水＞丙酮，盡管很多報道表明甲醇的提取效果最好，但甲醇具有一定的毒性，因此選擇乙醇為提取溶劑。并且花色苷在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，通常采用酸化的有機溶劑進行提取。

圖2 提取溶劑對花色苷提取效果的影響Fig.2 Effects of extraction solution on anthocyanins extraction

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 料液比對刺玫果花色苷提取效果分析 由圖3可知，隨著料液比的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值呈現(xiàn)遞增的趨勢，當料液比超過1:15時，刺玫果花色苷的提取量呈現(xiàn)遞減趨勢。一定質(zhì)量的刺玫果中花色苷提取率是有限的，溶劑體積的增大利于有效成分的溶出，當提取劑用量繼續(xù)增加時，反而花色苷得率略有降低，表明花色苷已基本從組織中充分溶出，且提取劑過剩，不但會影響超聲效果，而且可能會導(dǎo)致花色苷的水解，適當?shù)牧弦罕炔粌H有利于花色苷的溶出，而且也減少了料溶劑過多造成的試劑浪費[22]，故選擇料液比為1:15進行提取。

圖3 料液比對花色苷提取效果的影響Fig.3 Effects of solid/liquid ratio on anthocyanins extraction

2.3.2 溶劑pH對刺玫果花色苷提取效果分析 圖4可知，隨著pH的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當pH為2時，刺玫果中花色苷的吸光度值最高。分析其原因可能為花色苷屬于水溶性多酚類化合物，可溶于水、乙醇等極性溶劑中，且在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[23]，故本實驗在提取刺玫果中花色苷時，加入HCl試劑，以保證花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，防止其降解。文獻研究表明[15]，花色苷在pH≤3的介質(zhì)中呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色，隨著pH增大，紅色減弱，花色苷的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)椴槎?，穩(wěn)定性降低。所以試驗選用pH為2溶液從刺玫果中提取花色苷。

圖4 pH對花色苷提取效果的影響Fig.4 Effects of pH on anthocyanins extraction

2.3.3 超聲溫度對刺玫果花色苷提取效果分析 由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值逐漸增大，當超聲溫度為50 ℃時，刺玫果中花苷的吸光度值最大，溫度繼續(xù)上升，刺玫果中花苷的吸光度值反而降低，這可能是由于溫度對細胞內(nèi)花色苷的滲透、擴散和溶解有一定的影響。在低溫時，花色苷溶解度較低，分子不易滲透。隨溫度升高，加速分子運動，使其溶解度增大，加快分子從細胞層之間的轉(zhuǎn)移，有助于花色苷的提取，但花色苷耐熱性較差，在高溫環(huán)境和超聲波的空化作用下，花色苷類物質(zhì)會發(fā)生結(jié)構(gòu)改變[24]，導(dǎo)致提取量降低，吸光度值減小。因此，實驗從刺玫果中超聲提取花色苷時溫度確定為50 ℃。

圖5 超聲溫度對花色苷提取效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on anthocyanins extraction

2.3.4 不同體積分數(shù)乙醇溶液對刺玫果花色苷提取效果分析 通過圖6得出，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值逐漸增大，當乙醇濃度為60%時吸光度值最高?；ㄉ帐怯绍赵吞腔M成的，當乙醇體積分數(shù)過高時會導(dǎo)致花色苷中糖苷的溶解度降低，使得花色苷提取率隨之減少[25]，故實驗乙醇體積分數(shù)確定為60%。

圖6 不同乙醇體積分數(shù)對花色苷提取效果的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on anthocyanins extraction

2.3.5 超聲時間對刺玫果花色苷提取效果分析 從圖7可知，隨著超聲時間的延長，刺玫果中花色苷的吸光度值呈現(xiàn)急劇上升趨勢，當超聲時間為30 min時，刺玫果中花色苷的吸光度值最高，之后基本呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，這是因為花色苷在固液之間基本達到了平衡[26]。因此，實驗確定超聲提取時間為30 min。

圖7 超聲時間對花色苷提取效果的影響Fig.7 Effects of ultrasound time on anthocyanins extraction

2.3.6 超聲次數(shù)對刺玫果花色苷提取效果分析 圖8所示，當超聲提取為2次時，刺玫果中花色苷的吸光度值最大，隨著超聲次數(shù)增加，吸光度值基本保持不變，說明提取2次可以把花色苷全部提取出來，為提高實驗效率，故本實驗從刺玫果中提取花色苷超聲次數(shù)確定為2次。

圖8 超聲次數(shù)對花色苷提取效果的影響Fig.8 Effects of ultrasound times on anthocyanins extraction

2.4 Placket-Burman試驗結(jié)果分析

通過Design-Expert8.0.6軟件對表3中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，經(jīng)影響因素篩選，得到以吸光度值為響應(yīng)值的線性回歸方程Y=0.36+0.014X1+0.041X2+0.084X3+0.050X4+0.041X5+0.019X6，模 型P=0.0010（P＜0.01），具有統(tǒng)計學意義，說明該模型在研究區(qū)域擬合性良好，所得回歸方程顯著[27]。一般情況下決定系數(shù)R2越高，說明實驗的可信度和精確度越高，實驗得到的R2=97.21%，表明回歸模型與數(shù)據(jù)吻合較好。各因素效應(yīng)評價結(jié)果見表4，從表4中的主效應(yīng)分析可知，Placket-Burman試驗在二水平范圍內(nèi)，超聲時間（X2）、乙醇體積分數(shù)（X3）、超聲溫度（X4）、料液比（X5）影響顯著（P＜0.05），影響響應(yīng)值的因素順序依次為乙醇體積分數(shù)（P=0.0002）＞超聲溫度（P=0.0023）＞超聲時間（P=0.0053）=料液比（P=0.0053）＞超聲次數(shù)（X6）（P=0.0826）＞溶劑pH（X1）（P=0.1709），由此推斷，乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲溫度、超聲時間為影響刺玫果花色苷提取條件的關(guān)鍵因素。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 3 Experimental design and response values of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計各因素效應(yīng)評價Table 4 Effect evaluations of each factor under Plackett-Burman test design

2.5 Box-Benhnken試驗結(jié)果分析

2.5.1 數(shù)學模型的建立與顯著性實驗 在Placket-Burman試驗基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.0.6軟件對表5中的實驗數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸，得到刺玫果中花色苷吸光度值對超聲時間（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、超聲溫度（C）及料液比（D）4個影響因素的二次多項回歸方程：Y=+0.48-0.014A+0.018B+0.028C+0.029D+0.038AB-2.500E-003AC+0.056AD-0.081BC+1.250E-003BD+0.028CD-0.18A2-0.070B2-0.098C2-0.091D2。

表5 Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

回歸方程方差顯著性分析結(jié)果見表6，由表6實驗數(shù)據(jù)可知，模型的F=45.40，P＜0.0001，表明實驗所用的二次模型是極顯著的，具有統(tǒng)計學意義。失擬項P=0.1610（＞0.05），表明此響應(yīng)面模型對試驗擬合的情況較好，誤差較小[28]；模型擬合的多元決定系數(shù)R2=0.9784，表明模型擬合度良好，調(diào)整性決定系數(shù)R2Adj=0.9569，表明該模型能解釋95.69%響應(yīng)值的變化，則用該模型能代替真實試驗點對超聲法提取刺玫果中花色苷提取量的分析和預(yù)測。從表6各因素的P值可知，回歸模型中的B、C、D、AB、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2具有顯著性（P＜0.05），而A、AC、BD均不顯著（P＞0.05），表明各因素對刺玫果中花色苷提取量的影響不同，調(diào)整不同因素將達到不同提取效果。

表6 Box-Benhnken回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

2.5.2 各因素間相互作用響應(yīng)面分析結(jié)果 三維曲面反映每兩個影響因素之間的交互作用，曲面越較陡，說明各因素對響應(yīng)值的影響較為顯著，擬合的響應(yīng)曲面能直觀反映各因素之間的交互作用[29]。圖9所示為當料液比、超聲溫度、乙醇體積分數(shù)、超聲時間中任意兩因素固定為0水平時，直觀地反映其余兩個因素交互作用對花色苷吸光度值的影響。圖9中各圖可以看出三維曲面較陡，響應(yīng)值波動較大，表明料液比與超聲溫度，料液比與超聲時間，超聲溫度與乙醇體積分數(shù)，乙醇體積分數(shù)與超聲時間的之間的交互作用對刺玫果中花色苷吸光度值影響較大，實驗結(jié)果與方差分析一致。

圖9 各因素間相互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface diagram of interaction of various factors

2.6 最優(yōu)工藝條件確定與驗證性實驗

通過Design-Expert.8.06軟件對回歸方程進行計算，得到刺玫果花色苷最佳提取工藝條件為：料液比為1:15.9 g·mL-1，超聲溫度為51.49 ℃，乙醇體積分數(shù)為60.88%，超聲時間為29.94 min，刺玫果花色苷最大吸光度預(yù)測值為0.487，結(jié)合實際操作，將提取工藝合理化后，改為：料液比1:15 g·mL-1，超聲溫度50 ℃，乙醇體積分數(shù)60%，超聲時間30 min，提取次數(shù)2次，溶液pH為2。在此條件下進行3次驗證性試驗，測定平均吸光度值為0.481±0.019，與預(yù)測值接近，說明該工藝準確可行。通過pH示差法計算得出，在最佳工藝條件下，刺玫果中花色苷的提取量為185.033 mg·100g-1。

2.7 刺玫果中花色苷體外抗氧化活性分析

2.7.1 刺玫果中花色苷對DPPH·清除能力 DPPH·有單電子，在517 nm波長處，其醇溶液呈紫色。自由基清除劑能使單電子配對，從而使吸光度值降低，顏色褪去，且成定量關(guān)系[30]?；ㄉ辗肿咏Y(jié)構(gòu)上有多個酚羥基，可以通過自身氧化釋放電子，進而清除DPPH等自由基[31]。實驗以抗壞血酸（VC）為陽性對照，研究刺玫果中花色苷物質(zhì)對DPPH·清除能力，由圖10可知，刺玫果中花色苷物質(zhì)和抗壞血酸均具有一定的DPPH·清除能力，但弱于同濃度的VC。刺玫果中花色苷對DPPH·的清除能力在考察濃度1～5 mg·mL-1范圍內(nèi)，抗氧化能力隨樣品溶液濃度的升高逐漸增強，當樣品溶液濃度為5 mg·mL-1，清除率為81.11%。通過SPSS軟件計算得出VC和刺玫果花色苷對DPPH·清除能力的IC50值分別為0.270和2.299 mg·mL-1，結(jié)果進一步表明刺玫果中花色苷對DPPH·具有一定的清除能力。

圖10 DPPH自由基清除率的測定Fig.10 Determination of DPPH free radical scavenging rates

2.7.2 刺玫果中花色苷對超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子自由基是機體內(nèi)壽命最長的自由基，在一定條件下可生成羥自由基、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物及單線態(tài)氧等其他活性氧，從而造成機體的氧化損傷[32]。如圖11所示，刺玫果中花色苷物質(zhì)和抗壞血酸均具有一定的超氧陰離子自由基清除能力，且強于同濃度的VC。刺玫果花色苷提取物在實驗濃度范圍內(nèi)，對超氧陰離子自由基的抑制作用隨質(zhì)量濃度增加而增強，經(jīng)SPSS軟件計算得刺玫果花色苷提取物和VC溶液的IC50值分別為1.902和2.607 mg·mL-1。由此可見，刺玫果花色苷提取物對超氧陰離子具有較強抗氧化能力。

圖11 超氧陰離子自由基清除率的測定Fig.11 Determination of O2－free radical scavenging rates

2.7.3 刺玫果中花色苷對ABTS+·的清除能力ABTS在K2S2O8作用下可被氧化成綠色的ABTS+·，在抗氧化物存在時，ABTS+·與之反應(yīng)變成沒有顏色的的ABTS，因此ABTS法可用于檢測樣品的抗氧化能力[33]。圖12表明，刺玫果花色苷提取物和VC均具有一定的清除ABTS+·能力，刺玫果花色苷清除ABTS+·能力弱于同濃度時的VC溶液。刺玫果花色苷提取物和VC的IC50值分別為8.993和1.314 mg·mL-1。因此表明，刺玫果花色苷提取物對ABTS+·具有極好的清除能力。

圖12 ABTS+自由基清除率的測定Fig.12 Determination of ABTS+ free radical scavenging rates

3 結(jié)論

本文通過單因素實驗及Placket-Burman設(shè)計對影響刺玫果花色苷提取的因素進行篩選，并結(jié)合Box-Benhnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法對參數(shù)進行優(yōu)化，確定刺玫果中花色苷最佳提取條件為：采用HCl調(diào)節(jié)溶液pH為2的60%乙醇作為提取溶劑，料液比1:15 g·mL-1，超聲溫度為50 ℃，超聲時間30 min，提取2次，在此工藝條件下得出刺玫果中花色苷得率為185.033 mg·100g-1。實驗條件穩(wěn)定，操作簡單，可作為從刺玫果中提取花色苷的工藝方法。此外，體外抗氧化能力研究結(jié)果表明，刺玫果中花色苷對DPPH·、超氧陰離子自由基、ABTS+·均表現(xiàn)出較強的清除能力，IC50值均小于10 mg·mL-1，提示刺玫果中花色苷物質(zhì)具有一定的抗氧化能力。實驗結(jié)果為刺玫果資源的開發(fā)利用及后續(xù)抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。