張 佳，韓 瑨，吳正鈞, ，張 娟，余 意

（1.光明乳業(yè)研究院乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術研究中心，上海 200436；2.上海大學生命科學學院，上海 200444）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是發(fā)酵可利用的糖類物質后主要產(chǎn)物為乳酸、不形成芽孢的革蘭氏陽性細菌的統(tǒng)稱，它們在分類上具有多樣性[1]。乳酸菌分布廣泛，除了動物的消化道、植物的莖、葉、果實及部分天然發(fā)酵食品外，也存在于部分極端低溫的生境中[2]。同時，乳酸菌也是導致部分冷藏包裝食品污染的重要原因[3]。乳酸菌可用于各種發(fā)酵食品的生產(chǎn)和保存。此外，部分乳酸菌可以對宿主健康產(chǎn)生明確地促進作用，如調節(jié)腸道菌群的組成[4]、緩解腹瀉、乳糖不耐癥、糖尿病等[5]，對于癌癥也有一定預防作用[6]。因此，這些乳酸菌被作為益生菌在醫(yī)藥、食品和養(yǎng)殖業(yè)等領域廣泛應用[7]。

大多數(shù)乳酸菌適合在20～45 ℃生長，當環(huán)境溫度急劇下降并明顯低于其正常的生長溫度范圍時，乳酸菌細胞的代謝甚至形狀會出現(xiàn)異常，這會影響細胞的存活性。例如，在制備直投式酸奶發(fā)酵劑時需經(jīng)過深度冷凍或真空冷凍干燥過程，而低溫會對組成酸奶發(fā)酵劑的乳酸菌細胞內(nèi)的酶活[8]、細胞質的流動性等造成嚴重損傷，使其死亡率明顯升高，從而降低發(fā)酵劑的生產(chǎn)性能[9]。同時，發(fā)酵乳作為乳酸菌的優(yōu)良載體，在運輸和保存過程中，通常需要采用冷藏措施，低溫也會導致部分乳酸菌的活菌數(shù)或活力降低，從而影響其在體內(nèi)功能的發(fā)揮。此外，為了達到長期保存的目的，通常需要將乳酸菌存放在低于零度甚至-80 ℃的環(huán)境中，在此過程中，極端低溫會導致細胞滲透壓升高、形成冰晶，導致細胞完整性受損等，從而導致部分細胞死亡。

當周圍環(huán)境溫度急劇下降時，細菌細胞會產(chǎn)生一系列的生理變化，如膜的流動性下降、部分蛋白質折疊效率降低及核糖體的功能發(fā)揮受到限制等[10]。前期已有研究者對古細菌、嗜中溫細菌等對冷脅迫的應激反應進行了綜述，包括降低組成細胞膜脂肪酸的不飽和度、合成冷休克蛋白等[11-12]。研究者很早就注意到環(huán)境脅迫對乳酸菌細胞完整性及生理代謝的影響，但受限于缺乏合適的遺傳操作工具等原因，對乳酸菌受到冷脅迫時冷休克蛋白的表達及其生理功能缺乏系統(tǒng)的研究。隨著組學（Omics）技術出現(xiàn)及質譜分析技術的發(fā)展，研究者對乳酸菌的抗冷脅迫作用獲得了更全面和深入的了解。因此，本文總結了過去二十年內(nèi)研究乳酸菌抗冷脅迫的主要進展及方法，以期為后續(xù)的研究提供一定的借鑒。

1 冷脅迫對乳酸菌的影響

1.1 對細胞膜流動性和完整性的影響

在冷凍過程中細胞膜發(fā)生膜脂質相變，磷脂雙層從液態(tài)無序液晶相變?yōu)閯傂杂行蚰z相，并伴隨細胞周圍及胞內(nèi)基質由外至內(nèi)的冰晶形成[13]。針對冷凍造成細胞損傷的機制，Mazur等[14]提出了雙因素假說。該假設認為，在低冷卻速率下，細胞損傷主要來自滲透壓的改變（溶液效應），低溫引起的冰晶形成會導致胞外溶質濃縮，使細胞長時間暴露于離子強度增加、pH改變的環(huán)境中；在高冷卻速率下，胞內(nèi)冰晶的形成被認為是導致細胞死亡的主要原因。然而，當冷凍保護劑存在時，并未觀察到細菌細胞內(nèi)冰晶的形成[15]。因此，也有研究者認為LAB細胞在快速冷凍時的損傷不是來自于胞內(nèi)的冰晶，而是由解凍過程中發(fā)生的細胞內(nèi)外滲透壓不平衡所引起[16]。Meneghel等[13]認為冷凍會產(chǎn)生結冰和高滲透壓雙重效應，對保加利亞乳桿菌分別進行凍融處理和高滲透壓脅迫處理，觀察到了相似的生物活性損失。因此，他們強調高滲透壓的形成是冷凍損傷的主要來源。

細胞包被（Cell envelope）的組成在很大程度上取決于微生物生活的環(huán)境，其中溫度是最重要的因素之一[17]。細胞膜的組成和結構對細菌的冷適應很重要，因為它們構成了細胞和環(huán)境之間的動態(tài)界面，使細菌能夠應對環(huán)境挑戰(zhàn)[18]。此外，細胞膜還可作為分子傳感器，在分子運輸和相關應激反應的激活中發(fā)揮重要作用[19]。當受到冷脅迫時，微生物細胞膜的流動性和完整性會受到影響。Wang等[20]將3株植物乳桿菌分別在-20和-196 ℃預凍3 h后再進行冷凍干燥，然后采用熒光雙染色法測定了細胞膜完整性。結果發(fā)現(xiàn)，在不同預凍溫度下，3株植物乳桿菌的膜完整性受到不同程度的破壞。與-20 ℃相比，在-196 ℃預凍會導致3株被測試植物乳桿菌的細胞膜損傷密度顯著增加，這表明適當?shù)念A凍溫度能夠使細胞內(nèi)形成更均勻的冰晶，從而減少對細胞膜的損傷[20]。

1.2 對蛋白質結構和功能的影響

低溫會降低細胞內(nèi)蛋白質尤其是酶的活性，甚至影響蛋白質的正常折疊，主要表現(xiàn)如下：影響某些蛋白質的分泌[10]；導致部分蛋白質折疊緩慢或效率低下；降低酶進行轉錄或翻譯的活性。細胞要維持生命活動，需要保持酶的一定活性。隨著溫度的降低，酶反應速率也降低，而蛋白質的剛性增加。為了應對這些影響，生活在低溫環(huán)境中的嗜冷菌（psychrophile）通過下調初級代謝或改變蛋白質的分子結構、減少穩(wěn)定相互作用增加分子的無序度，從而維持酶的功能[21]。

冷脅迫會導致乳酸菌細胞產(chǎn)生何種應激反應，取決于實際面臨的溫度是否高于0 ℃。當溫度低于0 ℃時，大多數(shù)原核細胞出現(xiàn)被動反應，胞內(nèi)水結冰，引發(fā)細胞膜和DNA損傷，最終導致細胞緩慢死亡[22]。高于冰點的低溫可能導致乳酸菌生長停滯，但這種情況不會突然引發(fā)細胞死亡。然而對于嗜冷菌，即使在低于冰點的溫度下也能維持其代謝和生長[23]，原因在于嗜冷菌中含有獨特的冷適應蛋白，例如伴侶蛋白。伴侶蛋白是幫助蛋白質折疊的重要蛋白質。當GroEL和DnaK的伴侶蛋白CspB在嗜溫大腸桿菌中表達時，可提高其抗冷性[24]。Mbye等[25]述了乳酸菌在冷脅迫時，細胞適應低溫環(huán)境蛋白表達的變化（表1）。通過產(chǎn)生冷適應蛋白，乳酸菌在低溫下能保持一定的活性。

表1 冷脅迫時部分乳酸菌蛋白表達的變化Table 1 Effects of cold stress on total protein profiles in selected lactic acid bacteria

1.3 對核酸結構和功能的影響

冷脅迫會給細胞帶來諸多挑戰(zhàn)，例如酶反應速率降低、對底物的親和力降低，細胞膜流動性降低和RNA聚合酶活性受損等。除此之外，冷脅迫還可影響核酸的結構和功能。研究表明，凍融過程中細菌的死亡主要歸結于膜損傷和DNA變性[28]。冷脅迫還會造成核糖核酸和脫氧核糖核酸二級結構的穩(wěn)定，導致核糖核酸翻譯和轉錄效率的降低[24]。DNA通常為負超螺旋，受溫度影響后易產(chǎn)生錯誤折疊[29]。研究發(fā)現(xiàn)，對枯草芽孢桿菌施加冷刺激后，負超螺旋迅速增加[30]。DNA超螺旋的調節(jié)在DNA的復制和轉錄中可起到重要作用[31]。Mizushima等[32]為了檢測冷休克對DNA超螺旋的影響，通過含有氯喹的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，當對細胞進行冷休克處理時，細胞中質粒DNA的負超螺旋增加。

2 乳酸菌抗冷脅迫所采用的策略

據(jù)報道，冷適應細菌在應對低溫條件時有一系列的適應策略[33]，如表2所示。其中，胞外聚合物和相容性溶質的產(chǎn)生可為細菌提供滲透保護，膜脂肪酸中不飽和脂肪酸含量的增加有助于維持細菌細胞膜的流動性，分子伴侶的產(chǎn)生可穩(wěn)定蛋白質，而冷適應蛋白的表達可使細菌更好地適應溫度下降。在乳酸菌中，主要通過細胞包被的變化、膜性能的變化、冷休克蛋白的表達和相容性溶質的產(chǎn)生來應對冷脅迫。

表2 微生物適應低溫的細胞及分子機制Table 2 Cellular and molecular mechanism of microbial adaptation to low temperature

2.1 細胞包被的變化

胞外聚合物是多種生物分泌到其局部環(huán)境中的多功能、高分子量生物聚合物復合物，它們被認為具有多種功能[33]。其中胞外多糖具有促進細胞粘附和吸附環(huán)境中低濃度營養(yǎng)物質的作用，同時可為細胞提供多種保護功能如滲透保護、冷凍保護等。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生胞外多糖是細菌適應低溫環(huán)境的共有特征[18]。乳酸菌菌株也可產(chǎn)生胞外多糖[36]。胞外多糖可以作為莢膜多糖附著在細菌表面，也可以作為粘液多糖分泌到周圍介質中。在低溫條件下，一些冷適應細菌還具有肽聚糖層增厚和與肽聚糖生物合成有關基因上調的特征[33]。Polo等[27]研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖組成的差異可能是造成不同乳桿菌在不同預凍溫度下冷凍干燥后存活率產(chǎn)生差異的原因。

2.2 膜性能的變化

已有研究證明，冷凍可改變脂質的物理狀態(tài)，從而改變脂質組織和膜流動性[37]。冷應激（cold shock）處理會改變?nèi)樗峋哪ぶ舅峤M成，使菌株的抗凍性增加。Beal等[38]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌CFS2的脂肪酸組成與細胞抗凍性密切相關，且不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的之比（UFA/SFA）越高，對冷凍的抵抗力越好。冷凍干燥后的保加利亞乳桿菌的存活率也與UFA/SFA有關[39]。由此可知，受冷脅迫后膜脂組成的差異會造成菌株抗凍性的不同。此外，菌株自身膜脂組成的差異也會造成抗凍性不同。Meneghel等[13]對兩株抗凍性不同的菌株，保加利亞乳桿菌ATCC 11842和CFL1的膜脂肪酸進行分析。結果表明，抗凍菌株ATCC 11842的細胞膜中顯示出更高的不飽和脂肪酸含量。除了不飽和脂肪酸含量外，UFA/SFA和cycC19:0含量也會對膜流動性造成影響。Fonseca等[40]對影響膜流動性的因素進行了總結（表3），不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸之比增加會導致膜流動性的增加，而長鏈脂肪酸長度的增加則會降低細胞膜的流動性。此外，Velly等[41]還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率似乎與乳酸乳球菌TOMSC161的冷凍干燥耐受性相關，cycC19:0含量越高，細胞對冷凍干燥的耐受性越好。然而，當前的研究中大部分只是討論冷脅迫后乳酸菌膜脂肪酸成分的變化，關于乳酸菌調控脂肪酸變化的具體機制仍不清楚，因此，在未來的研究中可從脂肪酸合成相關基因著手，從基因組學的角度對脂肪酸調節(jié)機制作進一步探索。

表3 影響LAB膜流動性的主要因素Table 3 Main factors affecting fluidity of LAB membrane

當環(huán)境溫度降低時，為了在低溫條件下的生存，大多數(shù)微生物通常會改變膜脂組成，使細胞膜保持一定的流動性。例如，增強脂肪酸脫氫酶對膜脂中脂肪酸底物的催化作用，使脂肪酸鏈中的雙鍵數(shù)量增加，導致UFA/SFA提高，膜脂凝固點降低，從而增加膜流動性[42]。Suzuki等[43]對藍細菌在低溫中的信號轉導途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)藍細菌中存在一個雙組分信號轉導系統(tǒng)，可調節(jié)Δ15-脂肪酸脫氫酶（desB）基因的表達。該基因的表達可提高膜脂中α-亞麻酸含量，增強菌株的低溫耐受能力。

由于菌株的膜脂肪酸組成與其抗凍性之間存在一定聯(lián)系，因此，可通過改變微生物細胞膜的脂肪酸組成來改善其低溫適應性，從而使微生物適應冷凍環(huán)境，加入油酸可改變細胞膜的脂肪酸組成。對于乳酸菌而言，培養(yǎng)基中加入油酸可提高二氫甾酸的濃度和UFA/SFA。UFA/SFA的提高會增加細胞膜的流動性，從而提高乳酸菌的抗凍性。

李占雷(2014)認為供應鏈是為了實現(xiàn)全鏈價值的提升。整合全鏈資源，幫助節(jié)點上的企業(yè)融資。表現(xiàn)出是一種金融產(chǎn)品、市場等的特點。

2.3 冷休克蛋白的表達

在環(huán)境脅迫下，為了促進自身的生存，細菌必須通過誘導特定的應激反應來快速適應外部干擾[19]。許多微生物在低溫下會表達冷休克蛋白，以適應溫度的快速下降。當溫度高于0 ℃時，細胞出現(xiàn)主動應激，合成一類特定蛋白，即冷休克蛋白[10]。冷休克蛋白是一類核酸伴侶，其主要功能是防止RNA在低溫下形成次級結構或促進形成次級結構的RNA的降解。例如冷休克蛋白中的RNA解旋酶DeaD可以阻斷二級結構的形成，進一步在冷休克反應產(chǎn)生的核糖核酸外切酶PNPase和RNase R的作用下對它們進行降解[44]。

生產(chǎn)乳酸發(fā)酵產(chǎn)品的過程中，乳酸菌細胞會暴露在各種環(huán)境脅迫下，例如低溫、pH、滲透壓和高壓，這可能會影響細胞的生理活性[45]。然而，細菌細胞自身具備許多防御機制來提高在壓力環(huán)境中的生存能力，如伴侶蛋白（GroES/GroEL和DnaK/DnaJ/Grp E）、蛋白酶、運輸系統(tǒng)和質子泵[34]。研究人員首次在乳酸乳球菌MG1363中發(fā)現(xiàn)了以串聯(lián)重復方式排列的編碼冷休克蛋白基因（csp）的基因家族cspA、cspB、cspC、cspD和cspE[35]，與30 ℃培養(yǎng)的細胞相比，經(jīng)過10 ℃冷休克處理后，cspA、cspB、cspC、cspD的轉錄水平提高了10～40倍，但cspE的轉錄水平保持不變。在植物乳桿菌中，也鑒定到多種冷休克基因，如cspC、cspL和cspP。Song等[26]對植物乳桿菌L67進行1、4、6 h的冷脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)cspL和cspP的表達顯著增加。在低溫環(huán)境中細胞內(nèi)RNA二級結構的穩(wěn)定性增加，從而干擾轉錄和翻譯過程的進行，CSPs可以作為RNA伴侶，以不依賴于能量的方式發(fā)揮解鏈和或RNA二級結構去穩(wěn)定化的功能，起到抗轉錄終止子的作用，從而提高E.coli對低溫環(huán)境的適應能力[46]。此外，CSP還可在多種細胞代謝過程中發(fā)揮作用，例如脂肪酸代謝、染色體構建、轉錄、翻譯、一般代謝、能量代謝和應激反應[35]。

Broadbent等[47]對乳酸乳球菌MM160進行冷脅迫處理，然后通過2D-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析35S標記蛋白來表征乳酸乳球菌的冷脅迫反應。放射自顯影結果顯示，在L.lactisMM160中，在10 ℃下的最初30 min內(nèi)，至少誘導了8種蛋白質。用L.lactisMM210進行的類似實驗表明，冷脅迫誘導了大約15個Csps。L.lactisMM160和MM210的時間進程標記實驗顯示，溫度降低后，其他蛋白質的表達緩慢恢復，但即使在10 ℃下4 h后，在兩株乳球菌中，合成的蛋白質主要是Csp。進一步分析發(fā)現(xiàn)，冷脅迫后的乳酸乳球菌細胞中含有更低的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率。

Kim等[48]研究了冷脅迫對瑞士乳桿菌（L.helveticus）LB1、戊糖片球菌（P.pentosaceus）PO2、嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）TS2以及乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactissubsp.lactis）M392、M474、M712和乳酸乳球菌乳脂亞種（L. lactissubsp.cremoris）M126、M149、M179的冷凍耐受性的誘導作用。結果表明，當乳酸菌培養(yǎng)物在-20 ℃冷凍24 h后，除L.lactisM712（存活率50%）外，其它菌株的存活率都非常低。其中L.cremorisM179，只有1%的細胞存活。然而，當培養(yǎng)物在冷凍前經(jīng)過10 ℃冷應激2 h后，在測試的菌株中，來自乳酸乳球菌乳酸亞種的菌株和戊糖片球菌PO2的存活率都顯著提高，其中L.lactisM474的增幅最大，存活率由30%增加至67%。而這種效應在被測試的乳酸乳球菌乳脂亞種、L.helveticusLB1及S.thermophilusTS2中未出現(xiàn)。采用針對Escherichia coli及Bacillus subtilis中編碼主要休克蛋白的基因的簡并引物進行PCR，在所有被測試的菌株中都檢測到擴增產(chǎn)物。對L.lactisM474的擴增產(chǎn)物進行克隆和測序后所推導出的蛋白質的氨基酸序列與其它已知的冷休克蛋白具有高度的相似性。利用針對L.lactisM474冷休克蛋白編碼基因的引物對其它被測試的菌株進行擴增，僅在乳球菌中發(fā)現(xiàn)了PCR產(chǎn)物，而L.helveticus，S.thermophilus或P.pentosaceus中未觀察到擴增產(chǎn)物。因此，不同乳酸菌冷休克蛋白的基因在序列上存在一定的差異，這種差異導致其宿主對冷脅迫出現(xiàn)不同的表現(xiàn)。還需要進一步對冷休克蛋白結構與抗冷凍作用之間的關聯(lián)性予以更深入的研究。

2.4 相容性溶質

Tribelli等[18]報道了細菌與冷適應有關的典型特征，包括酶結構的調整、相容性溶質（compatible solutes）的合成等。在低溫環(huán)境下，乳酸菌也會合成相容性溶質，例如海藻糖和甘氨酸。相容性溶質不僅能在低溫環(huán)境下為微生物細胞提供滲透保護和冷凍保護，還可作為碳源、氮源和能源。研究較多的相容性溶質有甘氨酸、甜菜堿、甘油、海藻糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇，它們能降低細胞質的冰點，防止大分子聚集、清除自由基和穩(wěn)定細胞膜，從而使微生物適應低溫環(huán)境。更重要的是，相容性溶質還能降低細胞內(nèi)膠體的玻璃化轉變溫度[49]。最近的一項研究顯示，添加甘油后，細菌細胞細胞質的玻璃化轉變溫度降低了30 ℃，解凍后的存活率也有所提高[49]。Li等[50]發(fā)現(xiàn)，與其它冷凍保護劑相比，在冷凍干燥過程中添加10%的海藻糖能更好地保持羅伊氏乳桿菌CICC6226細胞膜的完整性和流動性。由此可知，除了自身合成外，乳酸菌還可從外部環(huán)境中吸收以積累相容性溶質。由于不同乳酸菌轉運相容性溶質的能力可能存在差異，因此對不同種類乳酸菌轉運相容性溶質的機制進行研究，也可為判斷乳酸菌的抗冷脅迫能力提供新的思路。

3 乳酸菌抗冷脅迫作用的表征

3.1 氣相色譜-質譜法

3.2 液質聯(lián)用

首先將乳酸菌接種于合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，然后進行冷休克處理，按Lindae等[51]的方法提取菌體蛋白質。先通過雙向電泳找出差異表達的蛋白質，將差異蛋白點用胰蛋白酶消化，再通過LC-MS對差異蛋白進行質譜鑒定，以確定冷休克蛋白的表達。Chen等[52]對Lactobacillus kefiranofaciensM1進行冷休克處理，然后分析冷休克前后菌株的蛋白表達差異，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷休克后的Lactobacillus kefiranofaciensM1有21個蛋白點表達水平發(fā)生變化。采用LC-MS對這些差異蛋白點進行鑒定，鑒定出了伴侶蛋白DnaK、GroEL等。

3.3 基質輔助激光解析飛行時間質譜

冷休克蛋白的測定還可采用Maldi-TOF MS方法進行。提取乳酸菌的菌體蛋白質先進行雙向電泳（2-DE），從2-DE凝膠中將差異表達的蛋白斑點片段手動切除，然后通過Maldi-TOF MS進行質譜鑒定。Song等[26]通過Maldi-TOF MS對一株植物乳桿菌L67在冷脅迫下的差異表達蛋白進行鑒定，有24種蛋白質表達增強，13種蛋白質被鑒定，其中2種蛋白質與泛酸激酶和合成酶有關。13種被鑒定的蛋白質分為六類：能量代謝、細胞生長、未知功能、信號轉導、應激反應和轉錄。

3.4 細胞活性分析

細胞活性分析包括活菌計數(shù)、酸化能力測定和乳酸脫氫酶活性測定。通常采用選擇性平板計數(shù)法測定經(jīng)過冷凍處理后乳酸菌培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。將樣品進行稀釋，取合適稀釋倍數(shù)的稀釋液接種在MRS固體培養(yǎng)基中，48 h進行計數(shù)[13]。乳酸菌培養(yǎng)物在冷凍前后和儲存期間酸化能力的變化也是衡量其抗冷凍協(xié)作用的重要表征，F(xiàn)onseca等[53]采用Cinac系統(tǒng)測定了經(jīng)過不同處理的乳酸菌的酸化能力，將細菌懸浮液接種于脫脂乳中，連續(xù)測定脫脂乳的pH直到酸化結束，以pH變化對時間的導數(shù)代表酸化速率。對于不同的乳酸菌樣品，達到在脫脂乳中最大酸化速率所需的時間tm（以min為單位）能夠表征細胞經(jīng)過冷脅迫后的活力。tm越高，潛伏期越長，酸化活性越低[38]。乳酸脫氫酶（LDH）可催化乳酸轉化為丙酮酸，這是乳酸菌細胞產(chǎn)生能量的重要一步[20]。細胞中LDH的活性在冷凍或冷凍干燥后會降低，因此可以通過該酶活性判斷細胞受損情況。其活性測定通常采用比色法，通過NADH在340 nm處的吸收減少來確定[20]。

4 總結與展望

在低溫下，乳酸菌會通過改變細胞膜脂肪酸組成、產(chǎn)生冷休克蛋白及產(chǎn)生相容性溶質等來適應環(huán)境，以保持良好的活性。關于乳酸菌抗冷脅迫的研究仍存在不足之處，包括：a.冷休克蛋白與低溫耐受性的確切構效關系；b.同種內(nèi)不同菌株之間由遺傳導致的細胞膜差異與冷脅迫誘導產(chǎn)生的膜脂組成差異對細胞抗冷凍性能影響的程度；c.冷休克蛋白對膜脂合成的調節(jié)作用。這些問題需要通過對與不飽和脂肪酸、冷休克蛋白等合成相關基因的編輯（敲除、沉默和定向突變）予以進一步的闡明。此外，冷休克蛋白自身結構的特點如何保證其在低溫下發(fā)揮活性也值得關注。因此，未來可以開展以下幾方面的工作：a.從基因組學的角度出發(fā)，對脂肪酸合成的相關基因進行敲除，深入探究不同菌株抗凍性強弱與遺傳基因之間的關系；b.結合蛋白組學和基因組學，探究冷休克蛋白對膜脂組成的調節(jié)作用，即對冷休克蛋白的代謝通路進行分析，通過相關基因的編輯來研究冷休克蛋白與膜脂組成之間的關聯(lián)；c.由于乳酸菌轉運相容性溶質的能力可能存在差異，因此后續(xù)的研究中還可對不同乳酸菌轉運相容性溶質的機制進行研究，這可為研究乳酸菌的抗冷脅迫作用提供新的借鑒。