蔣鵬飛，歐晨，彭俊，姚震，田野，楊毅敬，宋厚盼，徐劍，彭清華

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；3.上海市東方醫(yī)院，上海 200120

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一種遺傳性視網(wǎng)膜病，遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及性連鎖隱性遺傳等，其特征是雙眼發(fā)病，慢性進(jìn)行性視力損害并伴有眼底色素變化，影響全世界約250萬人。RP屬中醫(yī)學(xué)“高風(fēng)內(nèi)障”范疇，古文獻(xiàn)多認(rèn)為由虛所致。彭清華教授認(rèn)為，“虛中夾瘀”是 RP的主要病機(jī)，治當(dāng)補(bǔ)虛活血。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)虛活血中藥枸杞子-丹參對RP模型大鼠有一定治療作用，可保護(hù)RP大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，但其作用機(jī)制尚不明確。目前研究多認(rèn)為RP視力損失的主要原因是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞死亡。本研究以RP模型動物rd10小鼠為研究對象，觀察枸杞子-丹參對視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的影響，探討枸杞子-丹參治療RP的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

4周齡SPF級rd10小鼠40只、4周齡SPF級C57小鼠8只，雌雄各半，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號SYXK（湘）2019-0017。飼養(yǎng)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司SPF級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度 50%～55%，定期更換墊料，自由攝食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

枸杞子超微配方顆粒，批號190247，規(guī)格3 g/袋（相當(dāng)于飲片10 g），湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，臨用前取1袋顆粒用40 mL滅菌蒸餾水溶解；丹參超微配方顆粒，批號190131，規(guī)格1.8 g/袋（相當(dāng)于飲片10 g），湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，臨用前取1袋顆粒用40 mL滅菌蒸餾水溶解；維生素A軟膠囊，批號140701，每粒含維生素A 5 000 U，青島雙鯨藥業(yè)有限公司，使用時先用 DMSO溶解，再稀釋成水溶液。

1.3 主要試劑與儀器

Caspase-8、Caspase-3、Caspase-12、αB-晶狀體蛋白（αB-crystallin）抗體，英國Abcam公司，貨號分別為 ab25901、ab44976、ab62484、ab166839；瓊脂糖，西班牙Biowest，批號111860；6×上樣緩沖液，北京康為世紀(jì)，批號CW0610；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京康為世紀(jì)，批號CW2569；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京康為世紀(jì)，批號CW2141；核酸染料，北京普利萊，批號PB11141。搖床（海門其林貝爾，型號TS-92），恒溫箱（北京六一，型號DYY-6C），切片刀（德國徠卡，型號M199），切片機(jī)（金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號YD-315），包埋機(jī)（常州中威電子儀器，型號BMJ-A），熒光顯微鏡（廈門Motic，型號BA210-T），臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀，型號H1650R），熒光定量RCP儀（美國 Thermo，型號 PIKOREAL96），熒光PCR板（美國Thermo，型號SPL0960），電泳儀（北京六一，型號 DYY-2C），電泳槽（北京六一，型號DYCP-31DN），生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛，型號BioPrep-24）。

1.4 分組與給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只rd10小鼠隨機(jī)分為空白組、對照組、枸杞子組、丹參組、杞參組，每組8只，8只C57小鼠為野生組，各組雌雄分籠飼養(yǎng)。對照組灌胃維生素A溶液（11.25 mg/kg），枸杞子組灌胃枸杞子超微配方顆粒溶液（1.5 g/kg），丹參組灌胃丹參超微配方顆粒溶液（0.9 g/kg），杞參組灌胃枸杞子＋丹參超微配方顆粒溶液（3 g枸杞子超微配方顆粒＋1.8 g丹參超微配方顆粒溶于 40 mL滅菌蒸餾水），野生組與空白組灌胃生理鹽水，灌胃劑量均為20 mL/kg，每日1次，連續(xù)28 d。

1.5 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡

1%苯巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，75%酒精消毒雙眼瞼周圍皮膚，摘除眼球后脫頸處死小鼠。取視網(wǎng)膜，常規(guī)石蠟包埋切片，60 ℃烤片30～60 min，將切片置于二甲苯中 10 min，再依次置于100%、95%、85%、75%乙醇中，每次 5 min，蒸餾水沖洗，Proteinase K孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次，DNaseⅠ孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次，加入適量1×平衡緩沖液，使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，TdT緩沖液37 ℃孵育60 min，PBS沖洗5 min×3次，37 ℃染核10 min，PBS沖洗5 min×3次，90%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 RT-qPCR檢測

Trizol法提取視網(wǎng)膜組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度；以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒說明書配制反應(yīng)體系混合液，并進(jìn)行 PCR反應(yīng)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 免疫組化檢測

將石蠟切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH＝6.0），微波爐加熱至沸騰，保持沸騰24 min，冷卻24 min后取出，0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次，加入3%HO室溫孵育5 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加Caspase-8（1∶100）、Caspase-3（1∶50）、Caspase-12（1∶100）、αB-crystallin（1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加DAB工作液，室溫孵育5 min，蘇木素復(fù)染10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)，乙醇逐級脫水，二甲苯透明10 min×2次，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，計(jì)算陽性表達(dá)的平均光密度。

1.8 免疫熒光檢測

石蠟切片置于硼氫化鈉溶液中室溫放置30 min，蒸餾水漂洗5 min，蘇丹黑染液染色5 min，蒸餾水沖洗3 min，5%BSA封閉60 min，滴加Caspase-8（1∶100）、Caspase-3（1∶50）、Caspase-12（1∶100）、αB-crystallin（1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜，滴加熒光二抗，37 ℃孵育90 min，DAPI染核10 min，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算陽性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 枸杞子-丹參對小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)及感光細(xì)胞凋亡的影響

野生組小鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列正常，形態(tài)規(guī)則，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞連續(xù)，感光細(xì)胞核數(shù)量正常，視網(wǎng)膜外層未見凋亡細(xì)胞；空白組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不清晰，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞大部分損失，視網(wǎng)膜外層較薄，感光細(xì)胞核數(shù)量減少，并可見凋亡細(xì)胞；對照組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)模糊，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞小部分損失，感光細(xì)胞核數(shù)量減少，視網(wǎng)膜外層可見凋亡細(xì)胞；枸杞子組和丹參組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)欠清晰，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞不連續(xù)，感光細(xì)胞核數(shù)量減少，視網(wǎng)膜外層可見少量凋亡細(xì)胞；杞參組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，可見連續(xù)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，感光細(xì)胞核數(shù)量多于空白組，視網(wǎng)膜外層凋亡細(xì)胞數(shù)量少于空白組。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)（TUNEL染色，×400）

2.2 枸杞子-丹參對小鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)靶點(diǎn)mRNA表達(dá)的影響

與空白組、對照組、枸杞子組、丹參組比較，杞參組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3 mRNA表達(dá)降低（＜0.05）；與空白組、對照組、枸杞子組比較，杞參組小鼠視網(wǎng)膜組織 αB-crystallinmRNA表達(dá)升高（＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3和αB-crystallin mRNA表達(dá)比較（±s）

2.3 枸杞子-丹參對小鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色顯示，與空白組、對照組、枸杞子組、丹參組比較，杞參組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)降低，αB-crystallin蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見表3、圖2～圖5。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖5 各組小鼠視網(wǎng)膜組織αB-crystallin陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3和αB-crystallin蛋白表達(dá)比較（±s，平均光密度）

免疫熒光染色顯示，與空白組、對照組、枸杞子組、丹參組比較，杞參組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)降低（＜0.05），αB-crystallin蛋白表達(dá)升高（＜0.05）。結(jié)果見表4、圖6～圖9。

圖6 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

圖9 各組小鼠視網(wǎng)膜組織αB-crystallin陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

表4 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3和αB-crystallin蛋白表達(dá)比較（±s，平均熒光強(qiáng)度）

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-12陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖7 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-12陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

圖8 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

3 討論

凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，多種疾病均可引起視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，如黃斑變性、視網(wǎng)膜光損傷等。炎癥因子Fas通常分布在豁免器官（眼、睪丸等），視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中 Fas高表達(dá)，當(dāng) Fas過表達(dá)時可誘導(dǎo) Caspase-8表達(dá)，Caspase-8是外源性細(xì)胞凋亡的起始位點(diǎn)。枸杞子味甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)益肝腎功效；丹參味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，有活血化瘀功效。本實(shí)驗(yàn)對小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，rd10小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)較 C57小鼠升高，經(jīng)枸杞子-丹參灌胃干預(yù)后，Caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05），且效果優(yōu)于單用枸杞子或丹參（＜0.05），提示枸杞子-丹參可通過降低Caspase-8表達(dá)抑制視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可通過調(diào)控 Ca或激活凋亡酶誘導(dǎo)Caspase-12表達(dá)，活化的Caspase-12可激活Caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡。研究顯示，Caspases抑制劑可降低視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)量，Caspase-3抑制劑對遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病中視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞起保護(hù)作用，提示Caspase-3參與視網(wǎng)膜變性過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡與 RP疾病進(jìn)展有關(guān)。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子，也是組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。本實(shí)驗(yàn)檢測小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，rd10小鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)較 C57小鼠升高（＜0.05），而枸杞子-丹參能顯著抑制Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，且效果優(yōu)于單用枸杞子或丹參（＜0.05）。

αB-crystallin（編碼基因CRYAB）是晶狀體組織中的關(guān)鍵蛋白，但在晶狀體外的組織中也有表達(dá)，如視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、腦等。αB-crystallin可通過抑制Caspase-3的水解激活延緩細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞子-丹參能提高rd10小鼠視網(wǎng)膜組織αB-crystallin mRNA和蛋白表達(dá)，抑制凋亡通路下游靶點(diǎn)Caspase-3激活，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，且效果優(yōu)于單用枸杞子或丹參（＜0.05）。

綜上，本研究通過TUNEL染色、RT-qPCR、免疫組化染色和免疫熒光染色的檢測方法，對 rd10小鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rd10小鼠存在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，而補(bǔ)虛活血中藥枸杞子-丹參能明顯抑制rd10小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，對視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低 Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3表達(dá)，提高αB-crystallin表達(dá)有關(guān)。