王麗學(xué)，韓 靜，陳龍賓，余新越，劉景喜，馬 毅，霍文娟

（1天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院信息研究所，天津 300192；2天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；3天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；4天津師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，天津 300387；5天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，天津 300381）

0 引言

苜蓿(Medicago sativa)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，其蛋白含量高，被譽為“牧草之王”[1]，但其水溶性碳水化合物含量低、緩沖能值高且自身附著乳酸菌少，導(dǎo)致苜蓿青貯過程中pH降低困難，易發(fā)生有害菌發(fā)酵，故優(yōu)質(zhì)苜蓿青貯需要外源添加劑[2]。青貯過程是一個復(fù)雜微生物菌群（如乳酸菌、酵母菌、霉菌等）的活動過程[3]，菌群特征直接影響牧草青貯品質(zhì)[4]，甚至進一步影響反芻動物瘤胃微生物群系[5-6]。

研究表明，青貯微生物群落因青貯物料自身特征[7-8]、外源添加物質(zhì)[9-10]或添加劑[11-12]、青貯方式[13]及青貯物料生長的土壤環(huán)境[14]等多種因素的影響而存在差異。青貯細菌群落結(jié)構(gòu)研究不但可以解釋青貯品質(zhì)的變化，同時還有助于菌株篩選進而用于青貯添加劑開發(fā)，尤其對于苜蓿類較難青貯的牧草而言意義重大。目前，有關(guān)苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)的研究，多集中于乳酸菌劑[15-16]、纖維素酶[6,15]、糖[12]等發(fā)酵促進劑的影響，及與其他牧草混合青貯的效應(yīng)[10]等方面，而有關(guān)抑制型青貯添加劑對苜蓿青貯細菌群落組成的影響報道較少。

抑制型青貯添加劑如甲酸、乙酸等可通過抑制不良微生物發(fā)酵實現(xiàn)青貯物料的有效保存[17-18]，其中甲酸可在短時間內(nèi)降低苜蓿青貯pH，提高青貯品質(zhì)[19]。木醋液是植物性原料炭化或干餾過程中產(chǎn)生的氣體混合物經(jīng)冷凝、回收、分離后獲得的有機產(chǎn)品，屬于植物酸類混合物，安全、無污染、無殘留，可用作飼料添加劑、有機肥發(fā)酵劑等[20]，課題組前期研究表明木醋液作為青貯添加劑可提高苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，其乳酸含量顯著高于對照和甲酸處理[21]。本研究以甲酸和木醋液作為青貯添加劑制作苜蓿青貯，運用高通量測序技術(shù)分析了細菌群落組成，并結(jié)合苜蓿青貯主要營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)探討二者的作用機理，旨在為其在苜蓿青貯中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用苜蓿為丹農(nóng)種子公司提供的北極熊品種，種植于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究所的“濱海鹽堿地綠化土壤改良科研試驗基地”。試驗用精制木醋液(pH 2.7)和甲酸（分析純）均為市售。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2016年10月開展，設(shè)2個添加劑處理，分別為木醋液（B組）和甲酸（C組），以等量蒸餾水替代添加劑處理為對照（A組）。苜蓿刈割后晾曬24 h，其干物質(zhì)含量為(23.02±0.70)%，切割至2～5 cm小段，分別按6 mL/kg的劑量將添加物均勻噴灑在切割好的苜蓿上混勻，裝入特制聚乙烯塑料袋(25 cm×35 cm)，每袋300 g，每個處理3個重復(fù)，用真空封口機進行抽真空后封口。室溫條件發(fā)酵45 d后，在每個樣品的非表層部分用經(jīng)高溫滅菌的鑷子按照五點采樣法采集苜蓿青貯樣品20 g左右，先液氮速凍，再存于-80℃冰箱中，用于細菌群落結(jié)構(gòu)測定與分析。

1.3 細菌群落結(jié)構(gòu)測定與分析

苜蓿青貯樣品細菌群落結(jié)構(gòu)測定由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。采用Illumina MiSeq平臺，選用長度約為280 bp的細菌16S rRNA基因高度可變的V3-V4區(qū)進行測序，其PCR擴增引物為338F(5'-3')ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R(5'-3')GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Q5高保真DNA聚合酶0.25 μL，5×反應(yīng)緩沖液5 μL，5×高GC緩沖液5 μL，10 mMdNTP0.5 μL，模板 DNA 1 μL，10 μM 正、反向引物各 1 μL，ddH2O 11.25 μL。PCR程序：98℃30 s；98℃15 s，50℃30 s，25～27個循環(huán)；72℃ 30 s，72℃ 5 min，于4℃保存。擴增結(jié)果通過2%瓊脂糖凝膠電泳切取目的片段并用Axygen凝膠回收試劑盒回收。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR產(chǎn)物在Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)上進行定量，然后按照每個樣品所需數(shù)據(jù)量進行混樣。利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建文庫。在Agilent Bioanalyzer機器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫做2100質(zhì)檢，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上對文庫進行定量，合格的文庫在MiSeq機器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進行2×300 bp的雙端測序。

運用R軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析。首先對所獲序列預(yù)處理，評估有效序列質(zhì)量，獲得可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列；然后對高質(zhì)量序列按照97%的序列相似度劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)；再將豐度值高于0.001%的OTU代表序列與細菌16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫的模板序列進行比對，即可獲取每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。采用IBM SPSS Statistics 20.0對苜蓿青貯細菌分類學(xué)信息進行單因素方差分析(ANOVA)及主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，并運用Duncan法進行多重比較，通過SigmaPlot12.0軟件作圖，文中數(shù)據(jù)均以“均值±標準差”表示。

1.3.1 細菌群落組成 對不同處理在門、綱、目、科、屬、種水平的OTU序列和菌群數(shù)量信息進行單因素方差分析，著重分析不同處理在門、屬水平的細菌群落組成差異，并根據(jù)組間差異獲得如耐酸乳酸菌等重要物種信息。

1.3.2 細菌群落多樣性 選擇Chao1、ACE、Shannon和Simpson 4個指數(shù)進行分析。Chao1豐富度指數(shù)通過計算群落中只檢測到1次和2次的OTU數(shù)（即“Singleton”和“Doubleton”），估計群落中實際存在的物種數(shù)；ACE豐富度指數(shù)默認將序列量10以下的OTU都計算在內(nèi)，估計群落中實際存在的物種數(shù)；Shannon和Simpson多樣性指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，前者對豐富度和稀有OTU更敏感，而后者對均勻度和優(yōu)勢OTU更敏感。

1.3.3 細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性與營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)系 通過PCA分析苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性指標與其營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)系，進一步探討甲酸和木醋液對苜蓿青貯品質(zhì)影響的作用機理。

2 結(jié)果

2.1 苜蓿青貯細菌群落組成分析

高通量測序結(jié)果顯示，9個苜蓿青貯樣品獲得有效序列41461～55384個（合計429886個），其中高質(zhì)量序列39105～48470個（合計395074個），占有效序列的87.52%～96.43%（平均91.90%），物種累計曲線最終趨于平緩，說明樣本量足以反映群落的豐富度，且所有的OTU均可歸屬至已知分類單元（門、綱、目、科、屬）。根據(jù)OTU及細菌類群分類地位鑒定結(jié)果（圖1），門、綱、目、科、屬、種水平的OTU數(shù)量及細菌類群數(shù)均表現(xiàn)為A組＜B組＜C組，其中在綱、目水平A組與C組差異顯著，而在科、屬、種水平A、B組與C組差異均顯著。

圖1 苜蓿青貯樣品細菌序列(OTU)劃分及細菌類群分類地位統(tǒng)計

2.1.1 門水平細菌組間差異 由苜蓿青貯在門水平的組間差異（表1）可知，厚壁菌門(Firmicates)豐度表現(xiàn)為B組＞A組＞C組，組間差異均顯著；變形菌門(Proteobacteria)豐度表現(xiàn)為A組>B組>C組，組間差異均顯著；藍細菌門(Cyanobacteria)豐度均表現(xiàn)為C組顯著高于A、B組；放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、梭桿菌門(Fusobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)豐度較低，均以C組最高。由此可見，對照組以變形菌門為優(yōu)勢，豐度為57.726%，然后是厚壁菌門(40.345%)；木醋液組則以厚壁菌門為優(yōu)勢，豐度為55.687%，然后是變形菌門(37.050%)；而甲酸組以藍細菌門為優(yōu)勢，豐度為61.775%，然后依次是變形菌門(21.771%)和厚壁菌門(12.996%)。

表1 苜蓿青貯細菌群落門水平豐度的組間差異 %

2.1.2 屬水平細菌組間差異 對苜蓿青貯豐度大于1%的屬進行統(tǒng)計分析，結(jié)果（表2）可知，厚壁菌門、變形菌門、藍細菌門和放線菌門分別有9，8，1，1個屬的豐度大于1%。厚壁菌門中，腸球菌屬(Enterococcus)豐度最高，表現(xiàn)為B組>A組>C組，組間差異均顯著；芽孢桿菌屬(Bacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)均表現(xiàn)為C組>B組>A組，其中芽孢桿菌屬C組與A、B組差異顯著，而乳球菌屬B、C組與A組差異顯著；乳桿菌目(Lactobacillales)未知科屬、乳桿菌科(Lactobacillaceae)未知屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)未知屬及明串珠菌屬(Leuconostoc)的豐度組間差異均不顯著。變形菌門中，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)未知屬豐度最高，表現(xiàn)為A組＞B組＞C組，組間差異均顯著；羽扇豆屬(Lupinus)和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)的豐度均表現(xiàn)為A組＜B組＜C組，A、B組與C組差異顯著；特拉布斯氏菌屬(Trabulsiella)豐度表現(xiàn)為A組＞B組＞C組，其中A、C組間差異顯著；甲基桿菌屬(Methylobacterium)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)未知屬的豐度組間差異均不顯著。藍細菌門的鏈型植物目(Streptophyta)未知科屬及放線菌門微桿菌科(Microbacteriaceae)未知屬的豐度均表現(xiàn)為C組>B組>A組，C組與A、B組差異顯著。由此可見，對照組苜蓿青貯的優(yōu)勢菌群為變形菌門腸桿菌科未知屬，其豐度為48.302%，然后是厚壁菌門腸球菌屬(35.041%)；木醋液組的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門腸球菌屬，其豐度為45.026%，然后是變形菌門腸桿菌科未知屬(30.798%)；甲酸組的優(yōu)勢菌群為藍細菌門鏈型植物目未知科屬，其豐度為61.747%，其他類群的豐度均低于10%。

表2 苜蓿青貯細菌群落門水平豐度的組間差異 %

2.2 苜蓿青貯細菌群落多樣性分析

苜蓿青貯的細菌群落多樣性分析結(jié)果（圖2）表明，Chao1、ACE指數(shù)顯示出與OTU及菌群數(shù)量相似的趨勢，均表現(xiàn)為A組C組>A組，組間差異不顯著；Simpson指數(shù)表現(xiàn)為B組＞A組＞C組，組間差異均不顯著。

圖2 紫花苜蓿青貯樣品細菌多樣性指數(shù)

2.3 苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)與其營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)系

以苜蓿青貯中出現(xiàn)的豐度較高菌門和多樣性指數(shù)及苜蓿青貯主要營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)指標[21]進行PCA分析，前3個主成分累計可解釋苜蓿青貯樣品88.786%的信息，以PC1和PC2作圖（圖3）。由圖3可以看出，苜蓿青貯相關(guān)指標大致可以分為4組，I組為營養(yǎng)指標NFC含量與細菌群落藍細菌門豐度及Chao1和ACE指數(shù)，與PC1負相關(guān)；II組為營養(yǎng)指標NDF、ADF和發(fā)酵指標pH、乳酸、乙酸、氨態(tài)氮含量及細菌群落厚壁菌門、變形菌門豐度，與PC1正相關(guān)；III組為細菌群落Shannon和Simpson指數(shù)，與PC2正相關(guān)；IV組為營養(yǎng)指標粗蛋白含量，與PC2負相關(guān)。從樣品整體分布上看，受PC1影響，C組位于2、3象限，而A、B組位于1、4象限；受PC2影響，B組更偏向于第1象限，而A組更偏向于第4象限、C組更偏向于第3象限。

圖3 苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)與其營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的主成分分析圖

3 結(jié)論

與對照相比，木醋液提高了優(yōu)勢菌群厚壁菌門(Firmicutes)腸球菌屬(Enterococcus)乳酸菌的豐度同時降低變形菌門(Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)豐度，有助于促進乳酸菌發(fā)酵；甲酸則顯著降低了優(yōu)勢菌群厚壁菌門(Firmicutes)腸球菌屬(Enterococcus)乳酸菌和變形菌門(Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的豐度，即菌群繁殖被普遍抑制。這種細菌群落結(jié)構(gòu)的變化可較好地解釋木醋液和甲酸對苜蓿青貯營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的影響。

4 討論

青貯飼料中參與乳酸發(fā)酵的細菌群落大多數(shù)屬于厚壁菌門[16]，其與變形菌門和藍細菌門共同構(gòu)成了鮮苜蓿的主要附生細菌群落，但因氣候、地理位置等因素導(dǎo)致其豐度存在差異[8,15]，自然發(fā)酵過程中，厚壁菌門逐漸占優(yōu)勢[3,16]。本研究中對照組自然發(fā)酵后以變形菌門為優(yōu)勢，而木醋液組則以厚壁菌門為優(yōu)勢，說明木醋液的添加有助于促進苜蓿良性發(fā)酵；甲酸組以藍細菌門為優(yōu)勢，應(yīng)該是苜蓿青貯發(fā)酵進程受到抑制，有研究表明甲酸處理下苜蓿青貯在5天內(nèi)快速下降至最低而乳酸發(fā)酵在0.5天后減緩[22]，故推測藍細菌門（經(jīng)后續(xù)鑒定主要由鏈型植物目(Streptophyta)未知科屬組成的均一性群落）為苜蓿青貯樣品菌群提取過程中的植物組織部分，具體尚有待于進一步驗證。

乳酸菌是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵微生物[23]，分屬于細菌界5個門的43個屬[24]，本研究中豐度＞1%的厚壁菌門中的9個屬均為乳酸菌。在未添加外源菌劑的情況下，青貯發(fā)酵后的細菌群落組成主要受附生菌群組成及特性影響[8,12]，Ni等[25]研究報道腸球菌科、動球菌科(Planococcaceae)和腸桿菌科是鮮苜蓿的主要附生菌群，青貯后腸球菌科豐度增加至近50%而腸桿菌科保持在16%左右。本研究中對照組和木醋液組的腸球菌屬和腸桿菌科未知屬的豐度均較高，這與Ni等[25]的結(jié)果類似，故推斷二者應(yīng)該是本研究所用苜蓿的主要附生菌群。腸球菌屬乳酸菌是近年應(yīng)用較多的微生物菌種之一[26]，腸桿菌可通過脫氨反應(yīng)生成氨，減緩pH的降低[11]，同時可與乳酸菌競爭可利用的水溶性碳水化合物[7]，故良性發(fā)酵一般表現(xiàn)為乳酸菌豐度增加而腸桿菌豐度降低[10]。本研究中，與對照組相比，木醋液的添加顯著降低了腸桿菌科的豐度，說明其為酸性抑制劑表現(xiàn)出了對有害菌群的抑制作用，但同時也顯著提高了乳酸菌尤其是腸球菌屬和乳球菌屬的豐度，即說明木醋液對乳酸菌發(fā)酵沒有抑制作用反而表現(xiàn)為促進，這與Ogunade等[16]報道丙酸處理并沒有影響優(yōu)勢乳酸菌屬豐度的結(jié)果類似，可能是因為木醋液的添加為苜蓿青貯中的乳酸菌提供了更適宜的發(fā)酵環(huán)境。但甲酸處理顯著抑制了大多數(shù)細菌包括有害菌和乳酸菌的發(fā)酵，作為其優(yōu)勢菌群的藍細菌門鏈型植物目未知科屬經(jīng)推測應(yīng)該為苜蓿青貯菌群提取過程中的植物組織部分，甲酸組中也有芽孢桿菌屬、乳球菌屬、鞘脂單胞菌屬、羽扇豆屬（推測應(yīng)該是植物組織部分）和微桿菌科未知屬的豐度較對照組顯著提高，說明這些菌屬應(yīng)該屬于耐酸性較強的菌群，后續(xù)可對其進行進一步的鑒定和篩選，用于苜蓿青貯添加菌劑的開發(fā)。

主成分分析結(jié)果表明，厚壁菌門和變形菌門豐度越高，藍細菌門豐度越低，苜蓿青貯中的乳酸、乙酸、氨態(tài)氮、NDF和ADF含量及pH越高，而NFC含量越低，這與Zheng等[12]報道的水溶性碳水化合物（屬于NFC）含量低的青貯材料乙酸產(chǎn)量高且pH降低緩慢，及Ogunade等[16]報道的乳酸濃度與乳酸菌（本文中厚壁菌門中＞1%的菌屬均為乳酸菌）的豐度正相關(guān)類似。其中，甲酸組NFC含量較高、乳酸和乙酸含量較低且氨態(tài)氮含量為0[21]，這進一步說明了甲酸抑制了苜蓿青貯發(fā)酵進程，減少了青貯底物的消耗，同時也降低了發(fā)酵產(chǎn)物，也進一步印證了藍細菌門鏈型植物目未知科屬屬于苜蓿植物組織部分的推斷。在厭氧環(huán)境中，厚壁菌門和變形菌門細菌能夠有效降解纖維類物質(zhì)，為微生物活動提供更多能量物質(zhì)[27]，故本研究中苜蓿青貯NDF和ADF含量均表現(xiàn)為木醋液組略低于對照組，在甲酸組變形菌門和厚壁菌門雖然豐度低但其NDF和ADF含量卻顯著低于對照組和木醋液組，這應(yīng)該是由于甲酸對苜蓿酸化降解纖維類物質(zhì)的影響[3]效果大于微生物群系作用的緣故；厚壁菌門多為乳酸菌，產(chǎn)乳酸有助于降低青貯pH，而變形菌門尤其是腸桿菌可通過脫氨反應(yīng)生成氨，減緩青貯pH的降低[11]，王雅雅等[28]報道變形菌門與pH正相關(guān)，本研究結(jié)果與之相同。