李生儀， 孫延亮， 劉選帥， 趙俊威， 趙建濤， 馬春暉， 張前兵

(石河子大學動物科技學院， 新疆 石河子 832003)

世界農業(yè)土壤中磷的缺乏是影響作物生產的主要問題之一，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為多年生優(yōu)質蛋白質飼料，磷是其生長過程中需求量最大且最容易短缺的養(yǎng)分元素[1]。我國西北地區(qū)土壤通常為堿性，紫花苜蓿的生產性能因土壤缺磷及干旱而被限制[2]。在苜蓿實際生產中，為改善苜蓿土壤中磷素缺乏的問題，人們常通過長期施用大量化學磷肥來增加作物的吸磷量[3]，導致農業(yè)土壤中的磷大量富集，且易于與鋁(Al)、鐵(Fe)等元素形成金屬螯合物，并與Ca2+形成不溶性磷酸鹽和礦物質，致使僅有少量的磷能夠被作物吸收利用?？梢?，過量施用磷肥不僅增加了肥料成本，并使土壤磷素富集，造成土壤環(huán)境污染[4]。因此，開展施磷量對苜蓿根際土壤微環(huán)境的研究對提高磷素利用效率進而提高苜蓿生產性能、改善土壤環(huán)境具有重要的意義。

土壤微生物在土壤-養(yǎng)分循環(huán)、土壤-植物間相互作用和土壤結構形成中發(fā)揮著關鍵作用[5]。土壤磷循環(huán)過程中，土壤微生物與土壤磷之間存在互助效應，微生物在促進土壤磷循環(huán)的同時，能高效運移不同土壤磷庫中的磷[6]，并將有機和無機磷轉化為適宜植物根系吸收的有效形式[7]。研究表明，長期施磷對單作苜蓿土壤微生物群落結構有顯著影響，隨著施磷量的增加，土壤細菌、真菌群落結構發(fā)生明顯變化[8]。與此同時，土壤酶活性在土壤生態(tài)系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用。土壤酶主要來源于土壤微生物，參與調解土壤中的生物化學過程，促進土壤內有機殘留物的分解及養(yǎng)分循環(huán)[9]。土壤磷素利用中，土壤酶活性的變化直接或間接地影響著磷的釋放進程，顯著影響土壤有效磷庫變化。施用磷肥在改善土壤磷含量的同時，顯著改善土壤養(yǎng)分狀況，促進根系分泌，并提高酶活性[10]。研究表明，施肥后土壤的過氧化氫酶和脲酶活性是未施肥的2.0和3.3倍[11]。但隨著磷肥的施入量過多，土壤中的磷出現(xiàn)沉積，導致土壤酶活性降低[8]。目前，關于施磷對土壤微生物及酶活性的影響主要集中在作物及森林土壤中，而在滴灌條件下施磷對紫花苜蓿根際土壤微生物數量、根際土壤酶活性及干草產量的影響鮮見報道，尚不明確滴灌條件下不同施磷水平間紫花苜蓿根際土壤微生物數量、根際土壤酶活性、根際土壤理化性質及干草產量間的關系。

因此，本研究通過探究不同施磷水平對紫花苜蓿根際土壤微生物數量和根際土壤酶活性的影響，闡明不同施磷水平下紫花苜蓿根際土壤微生物數量、根際土壤酶活性的動態(tài)變化特征、苜蓿根際土壤理化性質及干草產量的變化規(guī)律，明確各指標與苜蓿干草產量之間的內在聯(lián)系，以期在生產實踐中為苜蓿優(yōu)質高效生產及科學合理施磷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2020年在石河子大學牧草試驗站(44°20′ N，88°30′ E)進行，試驗地土壤類型為灰漠土，耕層(0～20 cm)土壤基礎理化性質見表1。

表1 試驗地土壤基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of test soil

1.2 試驗設計

本研究采用單因素完全隨機設計，設置4個施磷肥(P2O5)梯度：0(P0)、50(P1)、100(P2)和150 kg·hm-2(P3)，各處理做3次重復，所用磷肥為磷酸一銨(含P2O552%，N 12.2%)。各處理苜蓿分別于返青后的營養(yǎng)生長初期及各茬次刈割收獲后3～5 d施加對應水平的磷肥，采用滴灌模式隨水滴施，具體施肥時間分別為2020年5月9日、5月30日、7月6日及8月12日，單次施肥量為當年施肥總量的25%。為保證試驗僅受磷肥的影響，通過施加尿素抵消含氮肥的磷酸一銨對試驗的影響，以保持試驗的一致性，具體施肥情況如表2所列。

表2 施肥配比Table 2 Fertilizer proportion

本研究供試紫花苜蓿品種‘WL366HQ’于2019年4月29日播種。采用條播方式播種，播種量為18.0 kg·hm-2，播種深度為2.0 cm，行間距為20 cm，小區(qū)面積為24 m2(4 m×6 m)。滴灌帶淺埋于地表10～15 cm處，滴灌帶間距為60 cm，所用滴灌帶為內鑲式滴灌帶(北京綠源有限公司生產)，滴頭間距為20 cm。田間管理除施肥因素外，其余均按當地滴灌苜蓿高產田進行。

1.3 土壤樣品采集

采用抖根法在紫花苜蓿最后一茬刈割(2020年10月4日)后進行根際土取樣，具體方法為：每個小區(qū)隨機選取長勢均勻一致的紫花苜蓿3株，挖出苜蓿植株根系(60 cm深)，抖掉與根系結合松散的土壤，然后用酒精燈火焰滅菌過的鑷子將附著在植株根系表面的土壤輕輕刮下作為根際土。將得到的根際土迅速放入冰盒中保存，帶回實驗室后保存于4℃冰箱冷藏備用。

1.4 測定指標及方法

苜蓿根際土壤微生物數量采用平板計數法培養(yǎng)計數，細菌、真菌以及放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁瓊脂培養(yǎng)基和改良高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)計數。苜蓿根際土壤酶活性采用北京索萊寶科技有限公司所提供的土壤脲酶、土壤堿性磷酸酶、土壤過氧化氫酶活性檢測試劑盒測定。

土壤全磷和有效磷分別采用硫酸-高氯酸消煮法及NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定[12]。土壤含水率采用烘干法測定[12]。土壤pH利用酸度計(PHS-3C，上海雷磁)進行測定。

苜蓿干草產量測定：在每茬苜蓿初花期(開花5%左右)采用樣方法(1 m×1 m)測定，隨機選取苜蓿植株(長勢均勻一致且能夠代表該小區(qū)長勢)，控制留茬高度5 cm刈割苜蓿植株，稱重，重復3次；另取300 g鮮草樣品各3份裝于白色布袋帶回實驗室進行苜蓿植株含水率測定，在105℃下殺青30 min后，于65℃烘干至恒重，測定其干物質含量并計算苜蓿干草產量(t·hm-2)。具體計算公式如下：

干草產量=鮮草產量×(1-含水率)

(1)

1.5 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進行數據整理，用SPSS 17.0對真菌、放線菌、細菌數量和土壤脲酶活性、土壤過氧化氫酶活性及土壤堿性磷酸酶活性進行方差分析，并采用Duncan法進行處理間的差異性比較，同時利用SPSS 17.0進行相關性和主成分分析。采用Origin 2019繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同施磷水平下苜蓿根際土壤微生物數量的動態(tài)變化

苜蓿根際土壤微生物數量在不同施磷水平下具有明顯變化(圖1)。真菌和放線菌的數量隨著施磷量的增加均呈先增加后降低趨勢，均在P2處理(100 kg·hm-2)達到最大值。不同施磷量條件下，苜蓿根際土壤真菌數量為P2處理顯著高于其他施磷處理(P<0.05)，與P0處理相比，P2處理下苜蓿根際土壤真菌數量提高了3.85%，相較P1和P3處理，P2處理下苜蓿根際土壤真菌數量分別提高了1.57%和5.14%。苜蓿根際土壤放線菌數量在P2處理達最大值6.15 lg cfu·g-1，顯著高于其他處理(P<0.05)，且各處理間均差異顯著(P<0.05)，與其余處理相比，P2處理下苜蓿根際土壤放線菌數量提高了1.90%～5.67%。隨著施磷量的增加，苜蓿根際土壤細菌數量逐漸增高，在P3處理(150 kg·hm-2)下達到最高值，顯著高于P0，P1和P2處理(P<0.05)，且分別高出了10.59%，4.61%和1.49%。

圖1 不同施磷水平下苜蓿根際土壤微生物數量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of microbial quantity in rhizosphere soil of alfalfa under different phosphorus levels注：不同小寫字母表示施磷處理間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between different treatments at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同施磷水平下苜蓿根際土壤酶活性的動態(tài)變化

不同施磷水平下苜蓿根際土壤酶活性變化明顯(表3)。隨著施磷量的增加，苜蓿根際土壤堿性磷酸酶活性呈先增高后降低趨勢，在P1處理(50 kg·hm-2)達到最大值，顯著高于其他處理(P<0.05)，且各處理間均差異顯著(P<0.05)，分別顯著高于P0處理69.17%、P2處理15.47%及P3處理69.49%(P<0.05)。苜蓿根際土壤脲酶活性及過氧化氫酶活性隨著施磷量的增加，均在P2處理(100 kg·hm-2)達到最大值，隨后開始逐漸降低。苜蓿根際土壤脲酶活性在P2處理時顯著高于其余施磷處理10.98%～46.35%(P<0.05)；苜蓿根際土壤過氧化氫酶活性在P2處理顯著高于其他處理(P<0.05)，與P0，P1及P3處理相比，P2處理下苜蓿根際土壤過氧化氫酶活性分別提高了3.22%，1.63%及3.48%。

表3 不同施磷水平下苜蓿根際土壤酶活性的變化Table 3 Changes of soil enzyme activity in alfalfa rhizosphere under different phosphorus levels/U·g-1·d-1

2.3 不同施磷水平下苜蓿根際土壤理化性質的變化

苜蓿根際土壤理化性質在不同施磷水平下具有明顯變化，苜蓿根際土壤含水率及pH隨施磷量的增多而逐漸降低，苜蓿根際土壤全磷及有效磷含量隨著施磷量的增多呈逐漸增多趨勢(表4)。不同施磷量條件下，苜蓿根際土壤含水率在不施磷(P0)時顯著高于其他處理(P<0.05)，與其他處理相比較，施磷量為150 kg·hm-2(P3)時土壤含水率最低，為14.30%，分別顯著低于P0處理23.29%、P1處理11.31%和P2處理6.91%(P<0.05)；苜蓿根際土壤全磷含量在施磷量為150 kg·hm-2(P3)時達最大值，為0.81 g·kg-1，顯著高于P0處理26.56%、P1處理15.71%(P<0.05)，但與P2處理差異不顯著(P>0.05)；苜蓿根際土壤有效磷含量在施磷量為150 kg·hm-2(P3)時達最大值，為20.82 mg·kg-1，顯著高于P0處理54.57%(P<0.05)；苜蓿根際土壤pH在P0處理顯著高于其余施磷處理(P<0.05)，當施磷量達150 kg·hm-2(P3)時，土壤pH最低，為7.23，分別顯著低于其他施磷處理0.96%～4.74%(P<0.05)。

表4 不同施磷水平下苜蓿根際土壤理化性質Table 4 Physical and chemical properties of alfalfa rhizosphere soil under different phosphorus levels

2.4 不同施磷水平下苜蓿的干草產量

苜蓿干草產量在一定施磷量下具有明顯變化(圖2)。苜蓿干草產量在不施磷(P0)處理下最低，為19.54 t·hm-2，顯著低于其余處理(P<0.05)。持續(xù)提高施磷量，苜蓿干草產量逐步增加，直至施磷量達100 kg·hm-2(P2)時其干草產量達到最大值，為21.82 t·hm-2，分別顯著高于P0處理11.67%和P1處理4.28%(P<0.05)。當苜蓿土壤施磷量達150 kg·hm-2(P3)時，苜蓿干草產量反而下降，且顯著低于P2處理1.00%(P<0.05)。

圖2 不同施磷水平下苜蓿的干草產量Fig.2 Hay yield of alfalfa under different phosphorus levels

2.5 不同施磷水平下苜蓿根際土壤微生物數量、酶活性及土壤理化性質與干草產量的相關性分析

施磷肥后苜蓿根際土壤微生物數量和酶活性及土壤全磷含量與苜蓿干草產量的相關性分析如表5所示。根際土壤細菌、真菌及放線菌數量均與根際土壤堿性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶活性呈正相關，其中根際土壤細菌、真菌和放線菌數量兩兩間均呈正相關，且根際土壤真菌與放線菌數量顯著正相關(P<0.05)，根際土壤放線菌與細菌數量極顯著正相關(P<0.01)；根際土壤真菌數量與根際土壤堿性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶活性呈極顯著正相關(P<0.01)，根際土壤放線菌數量與根際土壤脲酶、過氧化氫酶活性極顯著正相關(P<0.01)，根際土壤細菌數量與根際土壤脲酶活性呈極顯著正相關(P<0.01)；根際土壤堿性磷酸酶、脲酶及過氧化氫酶活性間均呈極顯著正相關(P<0.01)。苜蓿干草產量與根際土壤細菌、放線菌數量及脲酶活性、土壤全磷、有效磷含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與土壤過氧化氫酶活性呈顯著正相關(P<0.05)，與真菌數量及堿性磷酸酶活性呈正相關，而與土壤含水率及土壤pH呈極顯著負相關(P<0.01)。

圖3 不同施磷水平下苜蓿根際土壤微生物數量、酶活性及土壤理化性質與干草產量的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of rhizosphere soil microbial quantity,enzyme activity,soil physical and chemical properties and hay yield of alfalfa under different phosphorus application levels注：圖中*表示相關性顯著(P<0.05)，**表示相關性極顯著(P<0.01)Note：*and** indicate significant correlation at the level of 0.05 and 0.01,respectively

2.6 不同施磷水平下苜蓿根際土壤微生物數量、酶活性、土壤理化性質及干草產量的主成分分析

在相關性分析的基礎上，對不同施磷水平下苜蓿根際土壤微生物數量、酶活性、土壤理化性質及干草產量進行主成分分析(圖4)。分析得出，PC1(Principal component 1，PC1)的方差貢獻率為71.36%，PC2(Principal component 2，PC2)的方差貢獻率為25.20%，PC1和PC2的綜合方差貢獻率為96.56%。隨后計算各主成分的特征向量，最終加權計算(表5)，綜合評價分值越高，則為最適宜施磷處理。結果表明，其評分從高到低的排序為P2>P1>P3>P0處理，綜合評價P2處理為最優(yōu)處理，可見，當施磷量為100 kg·hm-2(P2)時效果最優(yōu)。

表5 苜蓿根際土壤微生物數量、酶活性、土壤理化性質及干草產量的綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation of microbial quantity,enzyme activity,soil physical and chemical properties and hay yield in alfalfa rhizosphere soil

圖4 不同施磷水平下苜蓿根際土壤微生物數量、酶活性、土壤理化性質及干草產量的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of rhizosphere soil microbial quantity,enzyme activity,soil physical and chemical properties and hay yield of alfalfa under different phosphorus levels

3 討論

3.1 苜蓿根際土壤微生物數量對不同施磷水平的響應

土壤原生微生物群落和其代謝功能與土壤磷素變化具有密切關系，在有機物分解、改變土壤酶活性和養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮著重要作用。將磷素引入土壤會影響該區(qū)域微生物群落的組成，使土壤環(huán)境發(fā)生改變[13]。其中，細菌作為土壤中數量最多、種類最豐富的微生物，參與有機質的動態(tài)變化和養(yǎng)分循環(huán)[14]。研究表明，施磷在直接為土壤提供養(yǎng)分的同時能夠改變土壤pH，進而影響細菌群落的組成[15]。本研究結果表明，通過增施磷肥能夠顯著增加苜蓿根際土壤細菌數量，這主要是因為施入磷肥使土壤的有效磷含量發(fā)生變化，在為微生物生長提供磷素營養(yǎng)的同時，促進植物生長并產生更多的植物根系分泌物，從而提高根際土壤細菌的多樣性及豐度[16]。放線菌普遍存在于土壤生態(tài)系統(tǒng)中，具有固氮及對死亡有機物的循環(huán)利用作用[17]。本研究中，磷肥施入量的增加明顯提高了苜蓿根際土壤放線菌數量。研究表明，外源性的磷肥能夠促使微生物快速吸收土壤中的磷，協(xié)同微生物細胞內富集更多的多聚磷酸鹽，從而促進微生物的增殖[18]。由于放線菌適宜生存在微堿性及透氣性良好的土壤中，但繼續(xù)提升磷肥施入量，土壤pH降低，破壞了放線菌生長的最有利條件，致使其生長被抑制[19]。真菌作為田間土壤中常見的微生物，在促進土壤中有機質的轉化、改善植株生長發(fā)育情況及調控作物病害等方面具有極其重要的作用[20]。陳露等[21]研究發(fā)現(xiàn)，隨著磷肥的施入，真菌群落結構改變，土壤真菌數量與磷肥施入量呈負相關。本研究結果表明，隨磷肥的施入量增加，苜蓿根際土壤真菌數量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。這主要是因為真菌宜生存于有機物難分解，營養(yǎng)含量低的環(huán)境，因此低磷土壤更宜于真菌生長，而在高磷土壤中的真菌數量則開始趨于降低[22]。同時，磷肥的施入改變了土壤中的微環(huán)境及物種變化，以真菌為營養(yǎng)來源的動植物數量升高，從而導致真菌數量及多樣性降低[20]。

3.2 苜蓿根際土壤酶活性對不同施磷水平的響應

土壤酶活性是土壤肥力的傳感器，其活性水平反映了土壤中的生物活性和生化反應，也是土壤肥力的重要指標[9-10]。研究表明，充足的磷肥供應有利于苜蓿根系的良好發(fā)育并產生更多的根系分泌物，進而促進土壤酶活性的提高[23]。其中，土壤磷酸酶是由微生物細胞和植物根系分泌產生的，其活性對植物磷的有效性、有機磷肥料的有效性和土壤磷循環(huán)具有重要的影響[24]。本研究中，隨施磷量的增加，苜蓿根際土壤堿性磷酸酶活性先增加后降低，這主要是因為磷肥的介入提高了土壤微生物的豐度，導致微生物對磷的攝入量增加，根區(qū)及非根區(qū)中可利用磷素含量降低，刺激微生物和動植物分泌產生更多堿性磷酸酶[25]。然而，過量的磷肥會導致堿性磷酸酶活性下降，主要是由于在堿性磷酸酶活性變化過程中存在“誘導-抑制”機制，無機磷含量的增高與堿性磷酸酶活性呈成負相關[26]。研究表明，土壤中過氧化氫酶活性與土壤性質存在密切聯(lián)系，作為H2O2清除系統(tǒng)中極其重要的生物酶，其活性在一定程度上表征了土壤總生物活性及土壤的生物氧化過程[27]。本研究中施加磷肥，土壤過氧化氫酶活性提高，但隨著施磷量的增加，過氧化氫酶活性開始降低。由于堿性土壤對根區(qū)的不利影響會加速微生物的氧化脅迫，提高過氧化氫酶活性，當pH降低至一定水平時，土壤過氧化氫酶活性略有下降[11]。土壤脲酶是有催化功能的活性物質，與土壤中微生物數量、全氮及有機質含量存在密切聯(lián)系，并深刻影響土壤動植物對氮的獲取，其活性與土壤供氮能力有緊密聯(lián)系[28]。本研究中，隨著磷肥施入量的增多，土壤脲酶活性逐漸升高。磷肥的增施有效緩解土壤中磷素匱乏的限制，進一步增加土壤微生物的豐度及活性，進而顯著提高土壤脲酶活性[29]。磷肥施入在促進苜蓿植株生長的同時，促進了土壤中氮被植株大量利用，導致土壤氮含量匱乏，而氮含量與土壤脲酶活性的關系密切，因此植株需通過其根系及根區(qū)微生物分泌更多的脲酶來獲取更多的氮[29]。但是，持續(xù)增加施磷量致使土壤脲酶活性降低，這可能是因為土壤中磷肥的施入促使大量氮素被利用，致使土壤中不可用氮的含量過高，脲酶的酶促反應被抑制而活性降低[30]。

3.3 苜蓿干草產量對不同施磷水平的響應

干草產量作為牧草生長速度、株高及莖粗的綜合表現(xiàn)，能夠直觀的體現(xiàn)牧草的生產性能。施入磷肥可以提高土壤對植物的有效性，能夠有效彌補土壤缺磷造成的植株生產力受限[31]。本研究結果表明，磷肥的施入能夠有效提高苜蓿干草產量，但隨著施磷量的持續(xù)增高，苜蓿干草產量開始降低。磷肥在一定的區(qū)間范圍內能夠有效提高苜蓿的生產性能，但過量的磷肥施入會導致苜蓿生產性能降低，與不施磷肥相比，苜蓿干草產量隨著磷肥的施入呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，增產率區(qū)間為14.8%～23.2%[32]。研究表明，施磷在有效促進植物體內磷素積累的同時能夠增大苜蓿的葉面積指數，提高苜蓿的光合效率，促進植株的生長和物質積累，進而提高紫花苜蓿產量，但磷肥施用過量，會使磷素在植物營養(yǎng)器官中過度富集，造成干物質積累受到抑制[33-34]。同時，過量施磷會破壞土壤中磷素吸收與分解的平衡，導致苜蓿根系磷素吸收超過閾值，磷素利用率不再增加，干草產量降低[35]。

4 結論

適宜施磷量能夠有效改善根際土壤微環(huán)境。隨著施磷量的增加，紫花苜蓿根際土壤微生物數量增多，酶活性及干草產量提高。當施磷量過高，除根際土壤細菌數量增多外，其余微生物數量均減少，酶活性及干草產量有所降低。通過綜合評定，施磷(P2O5)量為100 kg·hm-2時，能夠顯著改善根際土壤微環(huán)境，提高紫花苜蓿干草產量。