富貴草葉斑病病原的鑒定

鐘杰，尹秀娟，鐘雙玉，陳錦，朱俊子，李曉剛*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

富貴草（Pachysandra terminalisSieb. et Zucc）為黃楊科板凳果屬多年生常綠草本植物或亞灌木，又稱為頂花板凳果、頂蕊三角咪、轉(zhuǎn)筋草、吉祥草等。富貴草具有重要的藥用價(jià)值，從富貴草中提取的孕烷生物堿具有抗菌和抗癌功效[1]。富貴草分布較廣，因其觀賞效果好，且耐寒、耐陰、易繁殖，常作為盆栽和綠化植物[2]。

2019 年5 月，在湖南長(zhǎng)沙一中藥材苗圃的富貴草上發(fā)生了一種不明原因的葉部病害，約20%的植株葉片受到侵染。筆者對(duì)這種富貴草葉斑病進(jìn)行了病原菌分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定及科赫氏法則驗(yàn)證，確定了該病害病原，以期為病害的科學(xué)防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年5 月，在湖南長(zhǎng)沙一中藥材苗圃摘取不明原因的富貴草葉斑病典型癥狀葉片。

1.2 方法

1.2.1 富貴草葉斑病病原菌的分離和鑒定

剪取患病葉片病健交界部大小5 mm×5 mm 的組織，用75%乙醇消毒30 s、0.1%升汞再消毒1 min后無(wú)菌水漂洗3 次，用無(wú)菌濾紙吸干水分，置于含50 μg/mL 鏈霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，26 ℃黑暗培養(yǎng)。將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基，并通過(guò)單孢分離進(jìn)行純化后，于4 ℃ PDA斜面保存。

按照文獻(xiàn)[3]的方法，刮取菌絲，提取病菌DNA。采用通用引物ITS4/ITS5[4]、ACT-512F/ ACT-783R[5]、CHS-79F/CHS-354R[5]和GDF/GDR[6]擴(kuò)增核糖體轉(zhuǎn)錄間區(qū) rDNA （ITS）、肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、幾丁質(zhì)合成酶1 基因（CHS1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）序列（表1）。PCR擴(kuò)增： 2×EsTaqMaster Mix 25 μL、總DNA 模板2 μL、10 μmol/L上、下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表1 用于PCR 擴(kuò)增和測(cè)序的引物信息Table 1 Information of pr imers use d for PCR a mplification and sequencing

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生物工程有限公司測(cè)序。所獲序列提交GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)（ITS、ACT、CHS1、GAPDH基因序列分別為MT645674、MT648689、MT663546和 MT663547），并進(jìn)行同源性比對(duì)分析。利用MEGA 6 軟件中鄰接法（NJ）構(gòu)建串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用自舉法（bootstrap）進(jìn)行1000 次重復(fù)檢驗(yàn)[7]。

1.2.2 富貴草葉斑病病原菌致病性的測(cè)定

采用菌絲塊接種方法進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。將菌株在PDA 培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)7 d，用消毒后的5 mm 打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于健康的富貴草葉片。接種前葉片經(jīng)75%乙醇表面消毒，并將葉片針刺傷口。以無(wú)菌PDA 瓊脂塊為對(duì)照處理。將所有接種體置于含有濕潤(rùn)濾紙的保鮮盒26 ℃保濕培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況，并對(duì)發(fā)病葉片再次進(jìn)行病原菌分離鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 富貴草葉斑病病原菌的分離和鑒定結(jié)果

富貴草葉斑病侵染癥狀如圖1 所示。受害植株葉片從葉尖和葉緣開(kāi)始，呈現(xiàn)不規(guī)則的黃褐色病斑，葉片健康部分變黃；隨著病斑擴(kuò)展，顏色變成深褐色，葉片枯萎凋落。

圖1 富貴草葉斑病侵染癥狀Fig.1 Symptoms of leaf spot disease observed on Pachysandra terminalis leaves

共獲得5 個(gè)培養(yǎng)性狀一致的菌株，代表性菌株命名為FGC3-1。PDA 培養(yǎng)基26 ℃恒溫培養(yǎng)，菌絲由白色逐漸轉(zhuǎn)變成灰色，菌落呈圓形，邊緣較平滑。培養(yǎng)7 d 左右，產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子單生、透明、呈鐮刀形，大小為（20.5～27.5） μm×（3.8～4.2） μm （n=50）。從發(fā)病植株葉片病斑處鏡檢發(fā)現(xiàn)黑褐色剛毛，較僵直，末端尖銳，長(zhǎng)約85～115 μm。分生孢子萌發(fā)形成附著胞，附著胞呈深褐色、形狀近圓形或棍棒形，大小為（8.8～12.5） μm × （6.5～8.5）μm （圖2-C、圖2-D、圖2-E）。病原菌形態(tài)特征與已報(bào)道的[8]冬麥刺盤(pán)孢（Colletotrichum liriopes）相似。

圖2 富貴草葉斑病病原菌的形態(tài)Fig.2 Morphological characteristics of the isolated pathogens

對(duì)分離純化后菌株的ITS、ACT、CHS1和GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，分別獲得了長(zhǎng)度為581、245、260、257 bp的片段序列。利用BLASTn進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明，除ITS序列外，ACT、CHS1和GAPDH序列與冬麥刺盤(pán)孢（C. liriopes）菌株對(duì)應(yīng)序列相似性為97.21%～100%（對(duì)應(yīng)菌株登錄號(hào)為MK644098.1 、 KY995503.1 、 KY995452.1 、MK644100.1等）。利用多基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（序列登錄號(hào)信息如表2所示），結(jié)果，F(xiàn)GC3-1與冬麥刺盤(pán)孢聚為一支（圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果，可確定該病原菌為冬麥刺盤(pán)孢。

圖3 基于ITS、ACT、CHS1 和GAPDH 序列的聯(lián)合進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on combined sequences of ITS, ACT, CHS1 and GAPDH

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的真菌菌株信息Table 2 Information of the fungal strains used for phylogenetic analysis

表2(續(xù))

2.2 富貴草葉斑病病原菌的致病性

利用菌絲塊接種富貴草健康葉片，7 d 后引起葉片發(fā)病。病斑呈褐色、近圓形或不規(guī)則形，病斑周圍變黃，接種癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似。無(wú)菌PDA 瓊脂塊接種的對(duì)照葉片未發(fā)病。從接種病斑處可鏡檢到病原菌分生孢子，且可再次從病斑處分離并鑒定出相同的病原菌，由此證明接種的分離菌株為富貴草葉斑病的致病菌。

3 結(jié)論

對(duì)富貴草上不明原因葉斑病進(jìn)行了癥狀觀察、病原菌分離及鑒定，完成了科赫氏法則驗(yàn)證，證明該富貴草葉斑病病原為冬麥刺盤(pán)孢（C. liriopes）。冬麥刺盤(pán)孢也可導(dǎo)致其他植物病害：TRIGIANO 等[9]在美國(guó)報(bào)道了冬麥刺盤(pán)孢可引起萬(wàn)年青（Rohdea japonica）葉部炭疽病；CHEN 等[10]對(duì)青島發(fā)生的山麥冬（Liriope spicata）葉斑病進(jìn)行鑒定，確定其病原為冬麥刺盤(pán)孢；OO 等[11]鑒定了由冬麥刺盤(pán)孢引起的闊葉山麥冬炭疽病。此外，還有關(guān)于冬麥刺盤(pán)孢和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）共同侵染引起蘭花三七（Liriope cymbidiomorpha）葉斑病的報(bào)道[12]。YANG 等[13]在貴州、廣西和遼寧等省份的萱草屬植物莖稈病害中分離到了冬麥刺盤(pán)孢和其他炭疽菌。關(guān)于冬麥刺盤(pán)孢的寄主范圍及是否存在致病力分化等還有待進(jìn)一步研究。