陳秋玲，祝芷琦，李詠華，王小妹，梁北梅，溫愷嘉，許一靖，曾還雄，林元亨，唐順之

(廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司 中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣東省藥用脂質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510240)

蛋黃卵磷脂是從雞蛋黃中提取、精制得到的一種復(fù)合磷脂,包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)以及磷脂酰絲氨酸(PS)等[1-3]，具有抗氧化、抗菌、抗炎活性，及延緩衰老、改善脂肪代謝、保護(hù)視網(wǎng)膜、預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力以及益智健腦等功能。在醫(yī)藥行業(yè)，蛋黃卵磷脂是一種輔料，可作為脂肪乳注射液中的乳化劑，也可以用于制作脂質(zhì)體將藥物直接運(yùn)送到患病部位，使藥物具有靶向性[4-7]。

ICH Q3D元素雜質(zhì)指南根據(jù)金屬元素的毒性與來源將其分為3 類(1類，2A、2B類，3類)，并根據(jù)不同的給藥途徑(口服、注射、吸入)分別給出了不同的限度(允許日暴露量，PDE)。2020版《中華人民共和國藥典》四部通則0412《電感耦合等離子體質(zhì)譜法》、GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》以及美國藥典(USP)通則<232> <233>對元素雜質(zhì)的限度、測定流程及方法學(xué)驗(yàn)證做了建議與要求。蛋黃卵磷脂作為注射劑的乳化劑應(yīng)用較為廣泛，從臨床應(yīng)用的角度來看，與普通制劑相比，其金屬元素檢測方法的探索顯得尤為重要。2020版《中華人民共和國藥典》四部，蛋黃卵磷脂中重金屬檢查項(xiàng)為根據(jù)通則0821第二法。該方法的主要原理為10種元素(Ag、As、Bi、Cd、Cu、Hg、Mo、Pb、Sb 和 Sn)與硫代乙酰胺反應(yīng)，產(chǎn)生的有色反應(yīng)產(chǎn)物與10 ng/mL的Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液同法反應(yīng)物進(jìn)行顏色比對，以確定藥物中重金屬是否超出限度要求。該方法存在檢測的元素有限且無法反映單個(gè)元素的濃度，目視比色存在主觀誤差等局限性[8]。

金屬元素的測定方法主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-AES)法以及原子吸收光譜(AAS)法。其中AAS法存在耗時(shí)長、檢出限較高、基體效應(yīng)大、線性范圍窄且難以實(shí)現(xiàn)多元素同時(shí)分析的問題。ICP-AES法雖可以同時(shí)測定多種元素, 但譜線干擾多、靈敏度較低。ICP-MS具有分析速度快、檢出限低、基體效應(yīng)小、精密度高、靈敏度高、線性范圍寬及多元素同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)[9-12]，是今后的發(fā)展方向。當(dāng)前常用的樣品消解方法有微波消解法、濕式消解法、高溫密閉消解法、干式灰化法和高溫熔融法，其中微波消解法利用微波快速加熱, 在高壓環(huán)境下進(jìn)行消解, 具有消解速度快、污染小、樣品消解完全、回收率高、用酸少、安全、污染程度低等優(yōu)點(diǎn)[11，13]。

目前，關(guān)于蛋黃卵磷脂中金屬元素測定的相關(guān)文獻(xiàn)較少。因蛋黃卵磷脂比較難消解，依據(jù)GB 5009.268—2016中微波消解法，在消解過程中會(huì)出現(xiàn)壓力過大導(dǎo)致無法正常消解的問題。因此，本文在微波消解前增加100℃預(yù)消解1 h的步驟，能夠避免消解過程的異常情況，建立了ICP-MS法測定蛋黃卵磷脂中15種金屬元素的方法，為蛋黃卵磷脂的金屬元素檢測提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

蛋黃卵磷脂樣品，由廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司天然有機(jī)室提供，批號為I30181201。

硝酸(MOS級)，安譜公司；調(diào)諧溶液(Ce、Co、Li、Mg、Tl、 Y，1 μg/L)，安捷倫公司；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Li、Be、B、Na、Mg、Al、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Zr、Nb、Mo、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、Hf、Tl、Pb，100 μg/mL)、多元素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(Sc、Ge、In、Rh、Re、Bi，10 μg/mL)、鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、銻標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、釩標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、金標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μg/mL)、鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、錫標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)，鋼研納克檢測技術(shù)有限公司；砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；Milli-Q超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，安捷倫公司；WX-8000微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；AP225WD分析天平，島津公司；Milli-Q純水/超純水一體機(jī)，默克密理博公司；BHW-09Y12趕酸儀，上海博通化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

鋰標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)：量取鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。鋁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5 μg/mL)：量取鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。釩標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取釩標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。鉻標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)：量取鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。鈷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 μg/mL)：量取鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。鎳標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4 μg/mL)：量取鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。銅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(50 μg/mL)：量取銅標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。銅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.25 μg/mL)：量取銅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(50 μg/mL)0.25 mL用2%硝酸定容至50 mL。鋅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4 μg/mL)：精密量取砷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL于50 mL容量瓶中，用2%硝酸定容。鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)：量取鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.5 μg/mL)：量取鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)2.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。錫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)：量取錫標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。銻標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)：量取銻標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 μg/mL)：量取汞標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL和金標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用2%硝酸定容100 mL。鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL用2%硝酸定容至100 mL。

多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 μg/mL)：量取多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用2%硝酸定容至100 mL。多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用2%硝酸定容至50 mL。

用2%硝酸稀釋多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稀釋得到的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素質(zhì)量濃度見表1。

表1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素質(zhì)量濃度

混合內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg/mL)：量取多元素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL，用2%硝酸定容至50 mL。

1.2.2 樣品預(yù)處理

精密稱取0.5 g蛋黃卵磷脂置于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入8 mL硝酸混勻，加蓋放置過夜(15 h)，于100℃預(yù)消解1 h，旋緊罐蓋將消解罐置于微波消解儀內(nèi)，按微波消解程序進(jìn)行消解(見表2)。冷卻后取出消解罐，緩慢打開罐蓋排氣，用少量水沖洗內(nèi)蓋。將消解罐置于趕酸儀，于100℃加熱趕酸1 h，然后將消解液轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中,用少量水洗滌消解罐5次，洗液合并于量瓶中，用純水稀釋至刻度，待ICP-MS測定。

表2 微波消解時(shí)間-溫度程序

1.2.3 ICP-MS條件

射頻功率1.55 kW，載氣(高純氬氣)流速1.03 L/min，等離子氣體流速15.0 L/min，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.1 r/s，霧化室溫度 2℃，輔助氣流量0.9 L/min，氦氣流量4.3 mL/min；數(shù)據(jù)采樣模式為質(zhì)譜圖，采樣錐/截取錐為鎳錐，檢測器模式為P/A，采樣深度 10 mm，重復(fù)次數(shù)3 次，掃描次數(shù) 100 次。選取同位素為7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、111Cd、118Sn、121Sb、201Hg 和208Pb，其中7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe以45Sc 作為內(nèi)標(biāo)，59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As以72Ge 作為內(nèi)標(biāo)，111Cd、118Sn、121Sb 以115In 作為內(nèi)標(biāo)，201Hg 和208Pb 以185Re 作為內(nèi)標(biāo)。

1.2.4 方法學(xué)考察要求

方法學(xué)驗(yàn)證要求參考USP通則<233>，線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于等于0.99， 3個(gè)加標(biāo)水平回收率應(yīng)為70%～150%(n=3)，重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不得超過20%(n=6)，中間精密度RSD不得超過 25%(n=12)，穩(wěn)定性RSD 不得超過20%。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜干擾優(yōu)化

質(zhì)譜型干擾主要有兩個(gè)方面的來源，元素的干擾和分子離子的干擾。其中，元素的干擾包含同量異位素重疊干擾和雙電荷離子，分子離子的干擾主要來自等離子氣體和樣品基體。

同量異位素重疊干擾是指多個(gè)元素的同位素在同一個(gè)質(zhì)量數(shù)重疊，主要靠同位素選擇來避免。本次測定的15種金屬元素中，除了Al、Co、As只有一個(gè)質(zhì)量數(shù)外，其他元素都有多種同位素，針對不同質(zhì)量數(shù)的同位素在自然界中的含量可能引起的多原子干擾情況，選擇相關(guān)系數(shù)好且響應(yīng)值高的質(zhì)量數(shù)為分析用的同位素。本次實(shí)驗(yàn)選取的同位素為7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、111Cd、118Sn、121Sb、201Hg和208Pb 。

多原子離子的干擾可分為等離子氣體形成的多原子分子干擾、難熔氧化物干擾和雙電荷干擾[13]。本實(shí)驗(yàn)采用四級桿碰撞/反應(yīng)池(氦氣模式，流速4.3 mL/min)克服多原子離子對分析元素引起的重疊干擾。氧化物和雙電荷對檢測元素的干擾是比較常見的問題，由于所有穩(wěn)定/亞穩(wěn)定分子解離為原子和離子的過程為吸熱反應(yīng)，而CeO 是所有氧化物中最難解離的，在 ICP-MS 分析中在進(jìn)樣之前進(jìn)行儀器調(diào)諧，CeO+/Ce+為氧化物指標(biāo)，確認(rèn) CeO+/Ce+小于等于3%、雙電荷小于等于2%，氧化物和雙電荷干擾對元素的測定干擾可忽略不計(jì)。

2.1.2 非質(zhì)譜干擾優(yōu)化

非質(zhì)譜干擾較為復(fù)雜，又稱為基體效應(yīng)，主要來源于樣品基體或酸溶劑中的元素和等離子體用的氬氣中的雜質(zhì)。一般情況下，干擾的程度與樣品基體的性質(zhì)及復(fù)雜程度有關(guān)，通過加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量校正[13]。按照內(nèi)標(biāo)同位素質(zhì)量數(shù)與待測元素質(zhì)量數(shù)相近、電離勢能匹配性、待測樣品中不應(yīng)含有內(nèi)標(biāo)元素和化學(xué)溶液性質(zhì)相似選擇內(nèi)標(biāo)元素[14-15]。實(shí)驗(yàn)用2%硝酸配制1 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，其中7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe以45Sc 作為內(nèi)標(biāo)，59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As 以72Ge 作為內(nèi)標(biāo)，111Cd、118Sn、121Sb 以115In 作為內(nèi)標(biāo)，201Hg和208Pb以185Re作為內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)元素回收率在80%～120%之間，能有效地校正分析信號的漂移。

2.1.3 降低汞元素記憶效應(yīng)

汞蒸汽壓較低，在常溫下即可蒸發(fā)，故在敞口測定汞溶液時(shí)，其揮發(fā)性會(huì)造成測定結(jié)果有一定的誤差，由于汞具有極強(qiáng)的吸附性，在檢測過程中容易吸附在樣品瓶、泵管及矩管上而產(chǎn)生記憶效應(yīng)。汞可以溶解多種金屬，與之形成汞齊，其溶解度越大，形成的汞齊越穩(wěn)定，越不易吸附在容器或管線表面，但溶解度過大，形成的汞齊在等離子體中難以分解離子化。金在汞中具有一定的溶解度，能夠形成金汞齊[16]。本實(shí)驗(yàn)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過程中加入適量的金元素，且標(biāo)準(zhǔn)溶液最高點(diǎn)為5 ng/mL，能夠很好地降低記憶效應(yīng)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

取1.2.1系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測定，測定過程中儀器的內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管在儀器分析工作過程中始終插入混合內(nèi)標(biāo)溶液中，依次將樣品管插入各個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行測定。以各元素與內(nèi)標(biāo)測量值的比值 (y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。15種元素的線性關(guān)系見表3。由表3可知，各元素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.999。

續(xù)表3

2.2.2 方法的檢出限和定量限

取樣品空白溶液按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣連續(xù)測定11次，計(jì)算11次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以3.3倍SD除以斜率作為檢出限，10 倍SD除以斜率作為定量限，方法的檢出限和定量限見表4。由表4可知，方法檢出限在0.03～0.65 ng/mL之間，方法定量限在0.10～1.97 ng/mL之間，檢出限、定量限低。

表4 15種元素的檢出限和定量限 ng/mL

2.2.3 儀器精密度

取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 ng/mL)以及汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 ng/mL)，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，計(jì)算RSD。結(jié)果表明，各元素精密度測試的RSD在0.45%～4.67%之間(見表5)，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性

取蛋黃卵磷脂樣品6份按1.2.2制備供試品溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測定，計(jì)算6次測定結(jié)果的RSD。結(jié)果表明：鋰、銅、鋅元素含量在定量限之上，RSD分別為2.57%、5.06%、5.85%，均小于20%，結(jié)果符合要求；鋁、釩、鉻、鈷、鎳、砷、鎘、錫、銻、汞、鉛元素含量低于定量限；6份鐵元素樣品中2份含量在定量限之上，4份含量在定量限之下，重復(fù)性不佳(RSD為82%)。樣品中部分元素含量低于定量限，故由加標(biāo)重復(fù)性RSD表示方法重復(fù)性結(jié)果。

取蛋黃卵磷脂樣品6份，鋁、釩、鉻、鐵、鈷、鎳、砷、鎘、錫、銻、汞、鉛元素按照限度值的100%加入標(biāo)準(zhǔn)元素，按1.2.1制備供試品溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，重復(fù)性RSD在1.78%～8.72%之間(見表5)，說明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 中間精密度

不同時(shí)間不同實(shí)驗(yàn)人員按2.2.4樣品加標(biāo)重復(fù)性方法重新配制6份供試溶液，測定并計(jì)算12份測定結(jié)果(包括重復(fù)性)的 RSD，作為中間精密度結(jié)果。結(jié)果表明，中間精密度RSD在2.24%～9.45%之間(見表5)，說明本方法中間精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性

取2.2.5中間精密度的樣品溶液，在2～ 8℃條件下保存，分別于0、24、48、72 h按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測定并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，RSD在0.56%～3.93%之間(見表5)，說明樣品溶液在2～8℃的條件下保存72 h穩(wěn)定性較好。

表5 儀器精密度、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性結(jié)果%

2.2.7 回收率

取蛋黃卵磷脂樣品9份，鋰、銅、鋅元素按照樣品含量的100%、200%、300%加入標(biāo)準(zhǔn)溶液作為低、中、高水平供試品溶液。鋁、釩、鉻、鐵、鈷、鎳、砷、鎘、錫、銻、汞、鉛元素按照限度值的80%、100%、120%加入標(biāo)準(zhǔn)溶液作為低、中、高水平供試品溶液。按1.2.2制備供試品溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測定元素含量，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3份平行樣進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算RSD，結(jié)果見表6。由表6可知，15種元素加標(biāo)回收率在92.67%～132.90%之間, RSD在1.42%～7.00%之間，表明本方法回收率良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

本文用微波消解對蛋黃卵磷脂樣品進(jìn)行前處理，用ICP-MS測定其中的15種金屬元素含量。結(jié)果表明，該方法各元素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.999。各元素方法檢出限在0.03～0.65 ng/mL之間，定量限在0.10～1.97 ng/mL之間。該方法的儀器精密度良好，RSD(n=6)在0.45%～4.67%之間，重復(fù)性RSD(n=6)在1.78%～8.72%之間，中間精密度RSD(n=12)在2.24%～9.45%之間。15種金屬元素低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收率在92.67% ～132.90%之間, RSD在1.42%～7.00%之間。樣品溶液在2～8℃條件下保存72 h穩(wěn)定性良好，RSD在0.56%～3.93%之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合方法學(xué)考察要求，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高, 可用于蛋黃卵磷脂中15種金屬元素的同時(shí)測定。