陳靜，魏鑒騰，陳文雅，劉曄瑋

（蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000）

記憶是人腦對(duì)過去經(jīng)驗(yàn)的保持和再現(xiàn)，它是進(jìn)行思維、想象等高級(jí)心理活動(dòng)的基礎(chǔ)[1]。應(yīng)激、衰老、代謝綜合征及危險(xiǎn)基因等都是引起記憶障礙的危險(xiǎn)因素[2]。隨著社會(huì)的高速發(fā)展，生活節(jié)奏加快，學(xué)習(xí)、工作壓力增加，而由壓力引起的焦慮、抑郁、失眠等狀態(tài)會(huì)對(duì)大腦造成一定的損傷，最直接的結(jié)果便是頭痛、記憶力下降等癥狀[3]。記憶障礙的持續(xù)發(fā)展會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知障礙，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、亨廷頓病（Huntington disease，HD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等[4]。因此，研究和開發(fā)改善記憶障礙的功能食品已成為研究的熱點(diǎn)。

生物活性肽由結(jié)構(gòu)多樣的氨基酸組成，通過蛋白質(zhì)水解獲得[5]，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、保護(hù)心血管等多種生物學(xué)作用[6]。此外，許多研究表明一些生物活性肽具有改善記憶的功能，如裴新榮等[7]以鮭魚魚皮等深海魚皮為主要原料制備的海洋膠原肽，林海生[8]以牡蠣為原料制備的牡蠣蛋白肽及Wu等[9]研究了五肽Gln-Met-Asp-Asp-Gln與Ala-Gly-Leu-Pro-Met對(duì)小鼠記憶改善的協(xié)同作用。魚籽多肽是以魚籽為原料經(jīng)蛋白酶水解后得到的多肽，氨基酸種類及含量豐富、營養(yǎng)價(jià)值較高、具有多種生物活性。但目前關(guān)于魚籽多肽改善記憶的研究鮮有報(bào)道。本文通過研究魚籽多肽對(duì)小鼠記憶改善的作用，為魚籽多肽的高值化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鲅魚魚籽：市售。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性KM種小鼠（144只，體重為18g～22g）：北京華阜康生物科技股份有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物房內(nèi)溫度20℃～22℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗，均標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物質(zhì)量合格證：No.110322200101173261。

1.1.3 主要儀器及試劑

YLS-3TB型跳臺(tái)儀、YLS-17B型穿梭箱、XRXR101型Morris水迷宮儀：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)：深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 魚籽多肽的制備

魚籽多肽的制備參考文獻(xiàn)[10]稍作修改。魚籽和水經(jīng)高速剪切、酶切、滅酶、離心、烘干等，獲得魚籽多肽。

1.2.2 動(dòng)物分組及干預(yù)

144只KM種雌性小鼠分為3組，分別用于跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。48只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和魚籽多肽低、中、高劑量組4個(gè)組，灌胃劑量分別為 0、0.17、0.33、1.00 g/kg BW，經(jīng)口灌胃量為10 mL/kg BW，空白對(duì)照組給予等量無菌水，1次/d，持續(xù) 41 d。

1.2.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11]的方法略作修改。末次給受試物后次日開始訓(xùn)練，將小鼠放置在絕緣平臺(tái)上，記錄每只小鼠第1次跳下平臺(tái)的潛伏期和5 min內(nèi)跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)。24 h后重新測試，記錄每只小鼠3 min內(nèi)第1次跳下平臺(tái)的潛伏期及跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)和受到電擊的小鼠總數(shù)。5 d后進(jìn)行消退實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 穿梭箱實(shí)驗(yàn)

穿梭箱實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]的方法略作修改。末次給受試物后次日開始訓(xùn)練。小鼠在箱內(nèi)適應(yīng)60 s后，持續(xù)燈光15 s，給予10 s電刺激（電流0.2 mA）。間隔1 d訓(xùn)練一回，每回30次，連續(xù)訓(xùn)練3回記錄并分析小鼠主動(dòng)、被動(dòng)回避次數(shù)，小鼠主動(dòng)、被動(dòng)回避時(shí)間，計(jì)算小鼠主動(dòng)回避率。24 h后重新測試。5 d后進(jìn)行消退實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[13]的方法略作修改。末次給受試物后次日開始訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)全程嚴(yán)格保持室內(nèi)物體位置固定以及光照強(qiáng)度恒定（25 W）后開始測試。將小鼠從同一象限放入水中開始實(shí)驗(yàn)，若小鼠進(jìn)入平臺(tái)停留時(shí)間超過3 s或總時(shí)長60 s后停止計(jì)時(shí)，記錄數(shù)據(jù)。若小鼠60 s內(nèi)未進(jìn)入平臺(tái)，手動(dòng)將其放入平臺(tái)停留30 s。24 h后重新測試。5 d后進(jìn)行消退實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)或Dunnett T3檢驗(yàn)，以p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)及受電擊動(dòng)物數(shù)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)主動(dòng)和被動(dòng)回避次數(shù)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)穿臺(tái)次數(shù)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚籽多肽對(duì)小鼠體重的影響

魚籽多肽對(duì)小鼠體重的影響見表1。

表1 魚籽多肽對(duì)小鼠體重的影響Table 1 The effect of polypeptides from fish roes on the weight of mice

由表1可見，經(jīng)連續(xù)灌胃給予小鼠不同劑量的魚籽多肽41 d后，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)低、中、高劑量組小鼠的體重與對(duì)照組相比，無顯著差異（p＞0.05）。結(jié)果表明魚籽多肽對(duì)小鼠的體重?zé)o不良影響。

2.2 魚籽多肽對(duì)小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響

魚籽多肽對(duì)小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響見表2～表4。

由表2可見，高劑量組小鼠測驗(yàn)時(shí)跳下平臺(tái)的潛伏期與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；低、中劑量組雖未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出潛伏期有延長的趨勢。由表3可見，高劑量組小鼠測驗(yàn)時(shí)跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；低、中劑量組雖未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)有減少的趨勢。由表4可見，高劑量組小鼠測驗(yàn)時(shí)受電擊動(dòng)物數(shù)與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；低、中劑量組雖未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出受電擊動(dòng)物數(shù)有減少的趨勢。

表2 魚籽多肽對(duì)小鼠跳臺(tái)潛伏期的影響Table 2 The effect of polypeptides from fish roes on diving latency in mice jumping platform

表3 魚籽多肽對(duì)小鼠跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)的影響Table 3 The effect of polypeptides from fish roes on the number of errors in mice jumping platform

表4 魚籽多肽對(duì)小鼠跳臺(tái)受電擊動(dòng)物數(shù)的影響Table 4 The effect of polypeptides from fish roes on the number of animals subjected to electric shock in mice jumping platform

2.3 魚籽多肽對(duì)小鼠穿梭箱實(shí)驗(yàn)的影響

魚籽多肽對(duì)小鼠穿梭箱實(shí)驗(yàn)的影響見表5～表7。

由表5可見，中劑量組小鼠測試時(shí)主動(dòng)回避時(shí)間與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；低、高劑量組雖未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出主動(dòng)回避時(shí)間有縮短的趨勢。由表6可見，各劑量組小鼠測驗(yàn)時(shí)被動(dòng)回避時(shí)間與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），但是從結(jié)果中可以看出小鼠被動(dòng)回避時(shí)間有縮短的趨勢。由表7可見，各劑量組小鼠測驗(yàn)時(shí)主動(dòng)回避只數(shù)與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），但是從消退期的結(jié)果中可以看出主動(dòng)回避的小鼠數(shù)有增多的趨勢。

表5 魚籽多肽對(duì)小鼠穿梭箱主動(dòng)回避時(shí)間的影響Table 5 The effect of polypeptides from fish roes on active evading time of shuttle box of mice

表6 魚籽多肽對(duì)小鼠穿梭箱被動(dòng)回避時(shí)間的影響Table 6 The effect of polypeptides from fish roes on passive evading time of shuttle box of mice

表7 魚籽多肽對(duì)小鼠穿梭箱主動(dòng)回避數(shù)的影響Table 7 The effect of polypeptides from fish roes on actively evadingin the shuttle box of mice

2.4 魚籽多肽對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

魚籽多肽對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響見表8～表 9。

表8 魚籽多肽對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響Table 8 The effect of polypeptides from fish roes on the latent period of Morris water maze test in mice

表9 魚籽多肽對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)穿臺(tái)次數(shù)的影響Table 9 The effect of polypeptides from fish roes on the number of crossing the platform in the Morris water maze test in mice

由表8可見，各劑量組小鼠測驗(yàn)潛伏期與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。但是從結(jié)果中可以看出潛伏期有縮短的趨勢。由表9可見，中劑量組小鼠測試時(shí)的穿臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；低、高劑量組雖未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出穿臺(tái)次數(shù)有增多的趨勢。

3 結(jié)論與討論

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)以及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是常用來研究改善記憶的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[14]。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)把小鼠放在平臺(tái)上時(shí)，它會(huì)立即跳下平臺(tái)，如果小鼠跳下平臺(tái)時(shí)受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害刺激。多數(shù)小鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)。因此，小鼠跳臺(tái)潛伏期越長、跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)越少和受電擊動(dòng)物數(shù)越少證明小鼠的記憶能力越好。穿梭箱實(shí)驗(yàn)是將小鼠放入箱子中，待小鼠適應(yīng)環(huán)境后，利用暗箱中的鐵柵與小鼠的雙腳形成閉合回路，給予小鼠電擊，若小鼠在受到聲音刺激時(shí)主動(dòng)逃到箱體的一端，則不會(huì)被電擊，否則將會(huì)遭到電擊。因此小鼠的主被動(dòng)回避時(shí)間越短證明小鼠的記憶能力越好。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)主要用于檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和空間位置記憶能力，同時(shí)能較準(zhǔn)確地反映與海馬體功能直接相關(guān)的動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[15]。在實(shí)驗(yàn)中，將小鼠在固定位置面向池壁輕放入水中并開始計(jì)時(shí)，若小鼠在60 s內(nèi)找到站臺(tái)并停留10 s，則以停留10 s后的時(shí)間作為潛伏期。若小鼠在60 s內(nèi)未找到站臺(tái)則將其引至站臺(tái)并停留10 s，潛伏期記為60 s。小鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d后，觀察記錄其上站臺(tái)的潛伏期。在定位航行實(shí)驗(yàn)完成后，待小鼠休息一段時(shí)間，撤去站臺(tái)，在固定位置將小鼠面向池壁放入水中，記錄其60 s內(nèi)其穿越站臺(tái)區(qū)的次數(shù)。因此，當(dāng)小鼠的穿臺(tái)次數(shù)越多、潛伏期越短證明小鼠的記憶力越好。

本實(shí)驗(yàn)的魚籽多肽以魚籽為原料，經(jīng)高速剪切及酶解得到[10]。研究表明，魚籽多肽中有較為豐富的谷氨酸、天冬氨酸和L-亮氨酸[16]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體，進(jìn)而產(chǎn)生長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)（long-term potentiation，LTP），實(shí)現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶過程[17]。L-亮氨酸通過激活mTOR及其下游底物（4E-BP1和P70S6K）對(duì)記憶損傷有一定的改善作用[18]。推測谷氨酸和L-亮氨酸為使魚籽多肽具有記憶改善作用的主要氨基酸成分。魚籽多肽是經(jīng)酶解得到的多肽混合物，其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果表明，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)高劑量組小鼠測驗(yàn)時(shí)跳下平臺(tái)的潛伏期延長、跳下平臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)、跳下平臺(tái)動(dòng)物數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少（p＜0.05）。穿梭箱實(shí)驗(yàn)中劑量組小鼠測驗(yàn)時(shí)主動(dòng)回避時(shí)間與對(duì)照組相比明顯縮短（p＜0.05）。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中劑量組小鼠測試時(shí)的穿臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組相比明顯增加（p＜0.05）。綜上所述，魚籽多肽對(duì)小鼠的記憶功能有一定的改善作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為魚籽多肽改善記憶功能食品的應(yīng)用開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。