平 華, 趙 芳, 李 成, 王北洪, 孔紅玲, 李 楊, 馬智宏*

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心, 北京 100097; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京), 北京 100097)

草甘膦(GLY)和草銨膦(GLUF)均為滅生性除草劑,在世界范圍內(nèi)廣泛用于農(nóng)業(yè)及非農(nóng)業(yè)用地除草[1]。GLY和GLUF的大量使用在給農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的同時(shí),勢(shì)必會(huì)在土壤中累積,造成土壤污染,影響土壤微生態(tài)環(huán)境,還會(huì)通過淋溶遷移到地下水中[2-4]。Silva等[5]對(duì)歐盟成員國(guó)300份土壤樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),45%的樣品中檢出了GLY和氨甲基膦酸(AMPA)殘留。近年來(lái),僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)國(guó)內(nèi)土壤中GLY和GLUF進(jìn)行了監(jiān)測(cè),也檢出了GLY、AMPA及GLUF殘留[6-8],這與土壤中GLY、GLUF及其代謝物檢測(cè)困難有一定的關(guān)系。

由于GLY、GLUF及其代謝物均為強(qiáng)極性化合物,缺少發(fā)色和熒光基團(tuán),采用常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定性定量分析難度較大[6,9]。目前,文獻(xiàn)中報(bào)道的GLY、GLUF及其代謝物的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、離子色譜法[14,15]、毛細(xì)管電泳法[16]等,涉及的檢測(cè)對(duì)象以植物源性食品或者水樣居多。關(guān)于土壤中的檢測(cè)方法相對(duì)較少,目前國(guó)內(nèi)僅有一項(xiàng)關(guān)于土壤中GLY的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[17]。這是由于土壤中的有機(jī)質(zhì)、腐殖酸、金屬氧化物及重金屬離子等對(duì)GLY、GLUF及其代謝物有很強(qiáng)的吸附和絡(luò)合作用,導(dǎo)致其在土壤中提取困難[3,7,18,19]。文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)中土壤中GLY、GLUF檢測(cè)前處理多采用衍生化方法,但是衍生化方法存在步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、重復(fù)性差、須嚴(yán)格控制操作條件、對(duì)分析人員要求高等問題[3,11,20]。與衍生化方法相比,非衍生化方法具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái),孫文閃等[7]和周芹等[21]分別采用水-二氯甲烷、磷酸鈉-檸檬酸三鈉作為提取溶劑,非衍生化-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定土壤中GLY及其代謝物AMPA和GLUF等3種化合物,但是這兩種方法均需要過固相萃取小柱凈化,步驟繁瑣,且成本較高。目前關(guān)于土壤中GLY、AMPA、GLUF及其代謝物N-乙?；?草銨膦(NAG)、3-(甲基膦基)丙酸(MPP)等5種化合物同時(shí)測(cè)定的方法尚未見報(bào)道,因此有必要建立一套實(shí)施方便、試驗(yàn)成本低、靈敏度高、重復(fù)性好的快速同時(shí)測(cè)定土壤中GLY、GLUF及其代謝物等5種化合物的檢測(cè)技術(shù)。

本文采用氨水作為提取溶劑,無(wú)須過固相萃取小柱凈化,無(wú)須衍生化處理,以HILIC色譜柱為分離柱,實(shí)現(xiàn)了不同有機(jī)質(zhì)含量土壤中GLY、AMPA、GLUF、MPP和NAG等5種化合物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速同時(shí)測(cè)定。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、前處理無(wú)須有機(jī)試劑、綠色環(huán)保、成本低、準(zhǔn)確度和靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),可以滿足不同有機(jī)質(zhì)含量土壤樣品的批量檢測(cè),為研究其在土壤中的殘留狀況和環(huán)境行為提供可靠的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司); Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離(ESI)源(Waters公司); 3K30高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司); Classic UF純水機(jī)(美國(guó)Pall公司);水浴恒溫振蕩器(上海旻泉儀器有限公司); 0.2 μm微孔過濾膜(美國(guó)Gelman Laboratory公司);乙腈(HPLC級(jí),美國(guó)Fisher公司);氨水(色譜純,上海阿拉丁試劑公司);十八烷基鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

GLY(純度98.6%)、GLUF(純度99.2%)、AMPA(純度99.0%)、NAG(純度97.4%)、MPP(質(zhì)量濃度100 mg/L)購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。將5種除草劑標(biāo)準(zhǔn)品分別用純水配成10.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,實(shí)驗(yàn)時(shí)用土壤空白基質(zhì)溶液配成不同質(zhì)量濃度的工作液。

方法學(xué)考察試驗(yàn)用空白土壤樣品采自北京市順義區(qū)某桃園,低有機(jī)質(zhì)含量樣品(有機(jī)質(zhì)含量為2.89%, pH值為7.0,陽(yáng)離子交換量為12.3 cmol/kg),高有機(jī)質(zhì)含量樣品(有機(jī)質(zhì)含量為7.38%, pH值為7.1,陽(yáng)離子交換量為13.0 cmol/kg)。

1.2 樣品前處理方法

稱取土壤5 g(過60目篩)于50 mL離心管中,加入0.5 mol/L氨水溶液20 mL,渦旋混勻,置于水浴恒溫振蕩器中于50 ℃加熱振蕩提取60 min,在4 ℃下10 000 r/min離心5 min,取上清液過0.2 μm濾膜,HPLC-MS/MS測(cè)定。

土壤空白基質(zhì)溶液制備:選取空白土壤(不含目標(biāo)化合物的土壤)按照上述前處理方法進(jìn)行提取后,離心,取上清液過0.2 μm濾膜,即得。

1.3 分析方法

1.3.1高效液相色譜條件

色譜柱:Dikma Polyamino HILIC(150 mm×2.0 mm, 5 μm);色譜柱溫:40 ℃;樣品室溫度:10 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;流動(dòng)相A:水相(0.2 mmol/L乙酸銨+0.07%氨水溶液),流動(dòng)相B:乙腈,流速為0.25 mL/min;梯度洗脫條件:0～1.0 min, 25%A; 1.0～2.0 min, 25%A～95%A; 2.0～9.0 min, 95%A。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源;掃描方式:負(fù)離子模式;監(jiān)測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;毛細(xì)管電壓:2.5 kV;霧化氣溫度:500 ℃;去溶劑氣流量:1 000 L/h;碰撞氣流量:0.20 mL/min;離子源溫度:150 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

分別對(duì)5種化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,包括錐孔電壓、碰撞能量、毛細(xì)管電壓等,使每種化合物的母離子與特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大,將響應(yīng)值最大的碎片離子設(shè)定為定量離子,次級(jí)響應(yīng)離子為定性離子,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 5種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters for the five compounds

GLY和GLUF及其代謝物極性均較強(qiáng),在常規(guī)反相色譜柱上保留較小,因此應(yīng)選擇親水色譜柱進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)中分別比較了Restek Polar X離子色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Dikma Polyamino HILIC色譜柱(150 mm×2.0 mm, 5 μm)對(duì)5種化合物色譜峰形、響應(yīng)值、出峰時(shí)間的影響。結(jié)果表明,GLY、GLUF及其代謝物在HILIC色譜柱上峰形良好,且響應(yīng)值高,因此最終選擇了HILIC色譜柱。

考察了流動(dòng)相、柱溫、流速及梯度洗脫條件對(duì)目標(biāo)化合物峰形、響應(yīng)值和離子化效率的影響。其中,流動(dòng)相組成是一個(gè)重要的影響因素,分別考察了水相中加入不同濃度乙酸銨及不同比例氨水對(duì)色譜峰形及響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明,水相中加入0.2 mmol/L乙酸銨和0.07%氨水時(shí)有助于目標(biāo)化合物離子化,響應(yīng)值最高。最終優(yōu)化后的流動(dòng)相條件為水相(0.2 mmol/L乙酸銨+0.07%氨水溶液)和乙腈。各個(gè)化合物在MRM模式下的色譜圖見圖1。

圖 1 5種化合物在MRM模式下的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the five compounds under MRM mode

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化

考察了不同提取溶劑對(duì)GLY、GLUF及其代謝物提取效率的影響。分別選擇純水、水-乙腈(1∶1, v/v)、檸檬酸鹽緩沖溶液(4%檸檬酸鈉、2%檸檬酸氫二鈉)、氨水作為溶劑,結(jié)果表明,氨水提取和檸檬酸鹽提取回收率無(wú)明顯差別,其余溶劑提取回收率均較低。這是由于GLY、GLUF及其代謝物為酸性,采用堿性溶液作為提取溶劑,有利于將被土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合的GLY、GLUF及其代謝物變成離子形態(tài),從土壤中游離出來(lái),可以有效降低土壤對(duì)目標(biāo)化合物的吸附,從而提高回收率。文獻(xiàn)[21,22]采用磷酸鈉、檸檬酸三鈉作為提取溶劑,發(fā)現(xiàn)隨著提取液pH的增加,土壤對(duì)GLY和AMPA的吸附量減少,提取效率變高,此結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致?？紤]到檸檬酸鹽為不揮發(fā)性鹽,進(jìn)入質(zhì)譜后會(huì)在離子源部分結(jié)晶、沉積,影響目標(biāo)化合物電離,需要經(jīng)常清洗和保養(yǎng)。由于氨水具有揮發(fā)性,可以直接進(jìn)入質(zhì)譜,省去轉(zhuǎn)換溶劑的步驟,因此選用氨水作為提取溶劑?？疾炝瞬煌瑵舛劝彼芤?0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3 mol/L氨水)對(duì)GLY、GLUF及其代謝物色譜峰形、響應(yīng)值和回收率的影響(見圖2)。結(jié)果表明,采用0.5 mol/L和1.0 mol/L氨水溶液提取5種化合物,回收率均在70%～120%之間,從節(jié)省試劑的角度出發(fā),最終選擇0.5 mol/L氨水溶液作為提取溶劑;在該條件下,5種目標(biāo)化合物在質(zhì)譜中的離子化效率高,響應(yīng)值高,而且峰形好。

圖 2 氨水濃度對(duì)GLY、GLUF及其代謝物回收率的影響Fig. 2 Effect of ammonia concentrations on the recoveries of GLY, GLUF and its metabolites

圖 3 提取溫度對(duì)GLY、GLUF及其代謝物回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of extraction temperature on the recoveries of GLY, GLUF and its metabolites (n=3)

2.2.2凈化方法的優(yōu)化

目前常用的凈化方法有分散固相萃取法和固相萃取法。C18和PSA是農(nóng)藥殘留凈化中常用的分散固相萃取吸附劑,分別考察了這兩種吸附劑對(duì)5種化合物回收率的影響。C18主要用于吸附脂類和甾醇類等非極性化合物,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C18凈化和未凈化無(wú)明顯差別,這說明提取液中的疏水性基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)無(wú)明顯影響。PSA凈化后回收率低,這是由于目標(biāo)化合物含有羧基、膦酸基等基團(tuán),PSA在吸附提取液中極性色素、有機(jī)酸、脂肪酸等雜質(zhì)的同時(shí),對(duì)目標(biāo)化合物也產(chǎn)生了吸附[6,23]。固相萃取法中常將HLB固相萃取小柱用于GLY等極性化合物檢測(cè)的樣品凈化,可以有效地去除色素、脂肪及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[7,21]。對(duì)于提取液過HLB固相萃取小柱和不過小柱做了對(duì)比試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)回收率無(wú)明顯差異;過HLB柱后,GLUF和NAG的基質(zhì)效應(yīng)反而增強(qiáng);而且采用固相萃取柱凈化成本高,操作復(fù)雜,不適用于大批量樣品檢測(cè)。為節(jié)省成本,滿足大批量樣品快速測(cè)定的需要,因此最終選擇不使用吸附劑和固相萃取小柱進(jìn)行凈化。

2.2.3提取溫度的優(yōu)化

溫度也是影響提取效率的一個(gè)因素,該實(shí)驗(yàn)對(duì)25、40、50、60、70 ℃ 5個(gè)不同提取溫度進(jìn)行了考察,結(jié)果見圖3。除NAG隨著提取溫度升高回收率不斷提高以外,其他幾種化合物回收率受溫度影響不太明顯。綜合考慮,優(yōu)化后的提取溫度為50 ℃。

2.2.4提取次數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了提取1次和提取2次對(duì)5種化合物回收率的影響,發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)對(duì)回收率無(wú)明顯影響,因此從提高效率和節(jié)約成本的角度考慮,最終選擇提取次數(shù)為1次。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

基質(zhì)效應(yīng)可能會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的離子化效率、響應(yīng)值造成影響,這是由于樣品基質(zhì)中存在的其他干擾成分在離子化過程中與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng),表現(xiàn)為增強(qiáng)或者抑制效應(yīng),如果基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物的定量結(jié)果不準(zhǔn)確[24]?；|(zhì)效應(yīng)計(jì)算方法見公式(1)[25,26]:

(1)

其中,Am為土壤基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積,As為純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)溶液峰面積。|ME|≤20%,表明無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng);20%<|ME|≤50%,表明基質(zhì)效應(yīng)中等;|ME|>50%,表明對(duì)目標(biāo)化合物有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中比較了0.05 mg/L溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和土壤基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積,平行測(cè)定6次。結(jié)果表明,GLY、AMPA、GLUF、MPP、NAG基質(zhì)效應(yīng)分別為33.9%、31.0%、8.6%、21.4%、4.7%, GLY、AMPA和MPP表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng),GLUF和NAG無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)中選用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式來(lái)進(jìn)行定量分析,以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表 2 5種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、 方法檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), method LODs and LOQs of the five compounds

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍與檢出限

配制2.0、5.0、10、50、100、200、500 μg/L的土壤基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見表2)。結(jié)果表明,GLY及其代謝物在5.0～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,GLUF及其代謝物在2.0～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99,可以滿足定量分析的要求。以3倍信噪比計(jì)算,GLY及其代謝物的方法檢出限(LOD)為4.0 μg/kg,GLUF及其代謝物的LOD值為2.0 μg/kg;以10倍信噪比計(jì)算,GLY及其代謝物的方法定量限(LOQ)為13.3 μg/kg,GLUF及其代謝物的LOQ值為6.7 μg/kg(見表2)。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比[17],該方法GLY的線性范圍較寬、檢出限較低。

表 3 低有機(jī)質(zhì)含量土壤中5種化合物的加標(biāo)回收率和 精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions of the five compounds in soil with low organic matter(n=6)

2.4.2精密度和準(zhǔn)確度

由于土壤有機(jī)質(zhì)含量是影響GLY、GLUF及其代謝物吸附的主要因素,分別對(duì)低有機(jī)質(zhì)含量(有機(jī)質(zhì)含量在5%以下)和高有機(jī)質(zhì)含量(有機(jī)質(zhì)含量在5%～10%之間)的土壤樣品按照上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別在不同有機(jī)質(zhì)含量的空白土壤樣品中添加0.02、0.05、0.2 mg/kg 3個(gè)水平的5種除草劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,低有機(jī)質(zhì)含量土壤中5種化合物的平均加標(biāo)回收率在74.2%～101%之間,RSD在0.93%～6.8%之間(見表3);高有機(jī)質(zhì)含量土壤中5種化合物的平均加標(biāo)回收率在90.8%～116%之間,RSD在0.40%～7.1%之間(見表4)。說明本方法精密度和準(zhǔn)確度良好,對(duì)于有機(jī)質(zhì)含量在10%以下的土壤均適用,方法穩(wěn)定可靠。

2.4.3與其他方法比較

表5對(duì)本方法和文獻(xiàn)方法進(jìn)行了比較。本方法中GLY和AMPA的LOD值低于絕大多數(shù)文獻(xiàn)中報(bào)道的非衍生化方法[7,15,27]。周芹等[21]建立的土壤中GLY和AMPA的非衍生化-UPLC-MS/MS測(cè)定方法雖然LOD值低于本方法,但是線性范圍的最低濃度為20 μg/L,高于本方法(5 μg/L);而且前處理需要過HLB固相萃取小柱,操作較繁瑣,成本高,不適用于大批量土壤樣品的快速檢測(cè)。目前文獻(xiàn)中報(bào)道的非衍生化方法均未注明所用土壤樣品的來(lái)源及類型,方法的適用范圍不明確。本文建立的方法可以適用于不同有機(jī)質(zhì)含量土壤中GLY、GLUF及其代謝物等5種化合物的同時(shí)測(cè)定,而且提取液無(wú)須過固相萃取小柱凈化,無(wú)須衍生化處理,操作步驟簡(jiǎn)單,具有檢出限低,準(zhǔn)確度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

經(jīng)前期調(diào)研發(fā)現(xiàn),在我國(guó)禁用百草枯后,桃園中普遍使用GLY和GLUF除草。采集了20份北京不同桃園的土壤樣品(有機(jī)質(zhì)含量在1.47%～8.48%之間),對(duì)其GLY、GLUF及其代謝物殘留量進(jìn)行了測(cè)定,進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的適用性。所有土壤樣品中AMPA、GLY、MPP、GLUF、NAG的檢出率分別為45%、25%、10%、5%、5%,GLY及其代謝物檢出率均高于GLUF及其代謝物,說明在這些桃園中GLY使用較多。AMPA檢出率和含量均高于母體GLY,這是由于AMPA為GLY的主要代謝物,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[5,6]。GLY母體最大殘留量為35.2 μg/kg, AMPA最大殘留量為147 μg/kg,檢出GLY母體的土壤樣品都同時(shí)檢測(cè)出其代謝物AMPA。GLY殘留量以GLY和AMPA殘留量之和計(jì),GLUF殘留量以GLUF、MPP和NAG殘留量之和計(jì),GLY最大殘留量為182 μg/kg,GLUF最大殘留量為187 μg/kg。因此,GLY和GLUF的使用在土壤造成的殘留需要引起一定的關(guān)注。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速同時(shí)測(cè)定土壤中草甘膦、草銨膦及其代謝物殘留量的方法。與文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比,該方法具有簡(jiǎn)單、快速、前處理無(wú)須有機(jī)試劑、綠色環(huán)保、成本低、準(zhǔn)確度和靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),可以滿足不同有機(jī)質(zhì)含量大批量土壤樣品中草甘膦、草銨膦及其代謝物的快速同時(shí)檢測(cè),為研究其在土壤中的殘留狀況和環(huán)境行為提供可靠的技術(shù)支持。