三種茶葉的抑菌作用研究

宋軍霞 ， 祁紅兵 ，彭 璐

（1. 嶺南師范學(xué)院 地理科學(xué)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2. 嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

茶是我國的國飲，是天然的綠色飲料。我國是最早發(fā)現(xiàn)茶樹和茶飲品的國家[1]。茶葉中的活性物質(zhì)有 白 蛋 白 、維 生 素 、 無 機 鹽 、 茶 多 酚 、 茶 嘌 呤 堿 、茶多糖等。茶葉生物堿具有興奮、松馳平滑肌、助消化作用；茶多糖具有防物理輻射、抗凝血、抗血栓、降低血糖及增強免疫功能；茶多酚具有抗氧化、抗癌、抗菌、消炎，治療痤瘡等作用[2-3]。

有關(guān)報道中提出，6 種茶葉對牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌、具核梭桿菌、中間普氏菌等口腔致 病菌都有很好的抑制作用，綠茶效果最好，紅茶效果最差[4]。也有試驗指出六大類茶葉對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌都有抑制效果，不發(fā)酵的綠茶和中等發(fā)酵程度的烏龍茶、黃茶和白茶抑菌效果較好[5]。由此可見茶葉抗菌譜廣，抗菌效果很強且不易產(chǎn)生耐藥性。茶葉的主要抑菌物質(zhì)為茶多酚、茶黃素等物質(zhì)。由于不同的制作工藝致使不同茶葉的活性物質(zhì)改變，抑菌效果也不同。學(xué)者研究茶葉的抑菌活性時傾向于研究六大類茶葉，而較少研究茉莉花茶（再加工茶） 的抑菌效果。在前者的基礎(chǔ)上選取人們在日常生活中較喜歡飲用的青茶 （半發(fā)酵茶） 和紅茶作為研究對象。其中，鐵觀音和茉莉花茶同屬于青茶 （半發(fā)酵茶的一種），其茶多酚水平較一致。不同的是在制作過程中將茉莉花用窨制的方法濃縮在茶葉中[6]；作為一種全發(fā)酵茶，紅茶在加工過程中，沒有抑制茶多酚氧化酶的活性，從而促使兒茶素類物質(zhì)氧化成鄰醌進而形成茶黃素等氧化聚合物[7]。

以蘇云金芽孢桿菌和大腸埃希氏菌作為指示菌，采用 6 mm 濾紙片進行抑菌圈試驗。蘇云金芽孢桿菌和大腸埃希氏菌分別是革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的代表，測試 3 種茶葉，鐵觀音、紅茶、茉莉花茶對其的抑菌效果。同時，探究了不同的茶葉濃度、提取時間及提取溫度對指示菌抑菌效果的影響水平，得到較好的提取方案，方便日常生活中茶葉的沖泡，獲得更好的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 茶葉

鐵 觀 音 ， 廣 東 茗 上 茗 茶 葉 有 限 公 司 提 供 ； 紅 茶（滇紅）、茉莉花茶，廣西貴港天福茶葉有限公司提供。

1.1.2 供試菌種

蘇 云 金 芽 孢 桿 菌 、 大 腸 埃 希 氏 菌 ， 均 來 自 嶺 南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實驗室。

1.1.3 藥品

營 養(yǎng) 肉 湯 ， 青 島 高 科 園 海 博 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司提供；瓊脂，上海北諾生物科技有限公司提供。

1.2 儀器

FA2004B 型電子天平，上海天美天儀器有限公司產(chǎn)品；H22-X 型九陽電磁爐，九陽股份有限公司產(chǎn)品；GFL-23 型電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HH.S21-8-S 型電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；BCD-251WDGW 型海爾冰箱，青島海爾有限公司產(chǎn)品；LDZM-80KCS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；THZ-100 型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-IBu型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SPL-250 型生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 菌種活化

在無菌條件下，將指示菌種接入斜面營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，置于 37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h，然后放置在 0～4 ℃的冰箱中冷藏，備用。試驗前從斜面上挑取菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)皿中，置于 37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h，上述方案重復(fù) 3 次，菌種活化完畢。

2.2 菌懸液制備

在無菌條件下挑取 1 環(huán)指示菌置于 50 mL 的液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃條件下以轉(zhuǎn)速 160 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，放入 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 指示菌濃度

參照文獻方法并稍作修改[8]。將菌液進行濃度梯度稀釋，涂布平板，于 37 ℃條件下倒置培養(yǎng) 24 h后觀察菌落生長情況，根據(jù)培養(yǎng)后，菌落的生長情況及抑菌圈大小明顯程度，選取合適濃度作為供試菌懸液濃度。

2.4 茶葉粗提液的制備

5.0 g 茶葉浸泡在 100 mL 煮沸的蒸餾水中，靜置30 min，得到 5 mg/mL 茶葉浸出液[9]。用濾紙將茶葉的粗提取物過濾，得到均一、穩(wěn)定的液體。

2.5 浸出液濾紙片的制備

將干凈的濾紙用打孔器打成直徑為 6.0 mm 邊緣清晰的紙片，置于 121 ℃烘箱中干熱滅菌 2 h，冷卻備用[10]。將無菌濾紙片和粗提液在無菌操作臺中浸泡30 min，濾出，風干備用。

2.6 抑菌試驗

試驗采用抑菌圈法，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制成平板，分別均勻涂布 2 種菌懸液。每個培養(yǎng)皿放置 4 片濾紙，每組 3 個平行，以不加藥液作為空白對照。于 37 ℃下倒置培養(yǎng) 24 h 后，分別測量并比較各樣品的抑菌圈直徑 （mm）。

2.6.1 茶葉濃度對抑菌效果的影響

按照 2.4 所示的試驗方法，在基本條件為 100 ℃，30 min，制取質(zhì)量濃度分別為 1，2，3，4，5 mg/mL的茶葉提取液，用 2 種指示菌測試不同質(zhì)量濃度下的抑菌效果。

2.6.2 提取時間對抑菌效果的影響

按照 2.4 方法所示，以 100 ℃，5 mg/mL 為基本條件，探究提取時間分別為 10，20，30，40，50 min下，提取時間對抑菌效果的影響。

2.6.3 提取溫度對抑菌效果的影響

按照 2.4 的試驗基礎(chǔ)，以 5 mg/mL，30 min 為基本條件，提取溫度分別取 60，70，80，90，100 ℃為提取溫度。探究不同的提取溫度下，茶葉粗提物對指示菌效果的影響，采用 2.6 中的試驗方法進行試驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 茶葉種類對細菌的抑制效果的影響

3.1.1 3 種茶葉提取物對蘇云金芽孢桿菌的抑制效果

3 種茶葉提取物對蘇云金芽孢桿菌的抑制作用見圖 1。

由圖 1 可知，鐵觀音、茉莉花茶對蘇云金芽孢桿菌的抑制效果大于紅茶對蘇云金芽孢桿菌的抑制效果，抑菌效果為鐵觀音 = 茉莉花茶 > 紅茶，但 3種茶葉對蘇云金的都處于中度敏感。抑制強度隨著3種茶葉提取液質(zhì)量濃度的加大效果加強。

圖1 3 種茶葉提取物對蘇云金芽孢桿菌的抑制作用

在楊建英等人[11]的報道中提出，茶葉中主要的抑菌物質(zhì)為酚類物質(zhì)，茶多酚的抑菌機理是酚羥基和疏水的苯環(huán)與蛋白質(zhì)分子中的氨基或羧基結(jié)合，使細菌蛋白凝固、細菌細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細菌遺傳物質(zhì) DNA 牢固結(jié)合，改變細菌的生理生化功能，從而達到抑制細菌生長的效果。鐵觀音和茉莉花茶同屬于半發(fā)酵茶的一種 （青茶），紅茶屬于全發(fā)酵茶，發(fā)酵過程中在酶的作用下，茶葉中多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化和降解，產(chǎn)生茶紅素、茶黃素、茶褐素和多糖類物質(zhì)，造成茶多酚減少，從而鐵觀音和茉莉花茶的抑菌效果大于滇紅的抑菌效果。

3.1.2 3 種茶葉對大腸桿菌的抑制作用

3 種茶葉提取液對大腸桿菌的抑制效果見圖 2。

圖2 3 種茶葉提取液對大腸桿菌的抑制效果

由圖 2 可知，在茶葉粗提取液質(zhì)量濃度為 1～5 mg/mL 時、3 種茶葉對大腸桿菌 （革蘭氏陰性菌）的抑制效果均不強，呈現(xiàn)出低度敏感，與茶葉種類的相關(guān)性不大。在茶葉粗提物質(zhì)量濃度為 1 mg/mL時，抑菌圈無明顯邊界。

采用大腸埃希氏菌和蘇云金芽孢桿菌作為指示菌，其中大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性菌的代表，蘇云金芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌的代表。茶葉粗提物抑菌圈直徑的判定標準是: 抑菌圈直徑 >15 mm 為高度敏感、10～15 mm 為中度敏感、7～9 mm 時為低度敏感，無抑菌圈則為不敏感。由折線圖 1、2 的試驗結(jié)果對比下可看出，鐵觀音，滇紅和茉莉花茶對蘇云金芽孢桿菌 （革蘭氏陽性細菌） 抑菌圈直徑較大，綜合比較可得，抑菌效果為蘇云金芽孢桿菌 > 大腸桿菌。

通過抑菌圈試驗結(jié)果表明，茶葉粗提物對革蘭氏陽性細菌的抑菌效果高于對革蘭氏陰性細菌的抑菌效果。在茶葉粗提物質(zhì)量濃度為 5 mg/mL 時，對蘇云金芽孢桿菌的抑制作用達到中度敏感，而大腸桿菌的抑制作用處于低度敏感水平。在李輝[12]的報道指出，茶多酚對金黃葡萄球菌的抑制效果好于大腸桿菌的抑制效果，抑菌效果與茶多酚質(zhì)量濃度呈正比。而在孫昊等人[13]的試驗顯示明茶多酚中的兒茶素對于草生歐文氏桿菌、枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和大腸桿菌均有較明顯的抑菌效果，在茶葉粗體液質(zhì)量濃度為 2 mg/mL 時出現(xiàn)抑菌圈，5 mg/mL 時抑菌圈最大。結(jié)合圖 2 試驗結(jié)果，可以驗證當茶葉質(zhì)量濃度為 2 mg/mL 時，大腸桿菌才出現(xiàn)抑菌圈。

質(zhì)量濃度較低時，茶葉且 3 個平行組之間有無抑制作用的平板、增大了試驗的誤差。為了更好地進行試驗，探究提取時間和提取溫度對抑菌效果的影響和找出大腸桿菌抑制效果較好的質(zhì)量濃度，故在此試驗基礎(chǔ)上，增大了茶葉粗提取液的質(zhì)量濃度。

不同茶葉對大腸桿菌的抑菌效果見圖 3。

圖3 不同茶葉對大腸桿菌的抑菌效果

由圖 2 和圖 3 可知，在茶葉粗提物質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL 時，對大腸桿菌的抑制效果為茉莉花茶 >滇茶 > 鐵觀音。紅茶在加工的過程中茶多酚轉(zhuǎn)化酶活性沒有被抑制，大約有 90%的茶多酚氧化成茶黃素。有研究人員表明在低質(zhì)量濃度時，大腸桿菌對茶黃素的敏感程度強于金黃色葡萄球菌。茉莉花茶作為一種花茶 （再加工茶），是 2 種抑菌物質(zhì) （茶多酚和茉莉花） 效果的疊加，韋英亮等人[14]的試驗結(jié)果表明茉莉花渣黃酮對普通變形桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抗菌作用。

3.2 提取時間對抑菌圈直徑的影響

3.2.1 對蘇云金芽孢桿菌抑制效果的影響

按照 2.6.2 方法進行試驗?？刂撇枞~濃度和提取溫度不變，探究 3 種茶葉在不同溫度下對蘇云金芽孢桿菌的效果并繪制了折線圖。

提取時間對茶葉抑制蘇云金芽孢桿菌效果的影響見圖 4。

由圖 4 可知，在基礎(chǔ)條件為 5 mg/mL，100 ℃時，鐵觀音和茉莉花茶在提取時間為 20 min 時，對蘇云金芽孢桿菌有較強的抑制作用。茉莉花茶在提取時間為 20 min 時，屬于高度敏感 。 在 20 min 之后，鐵觀音和茉莉花茶對蘇云金芽孢桿菌的抑制作用都有一定下降。而紅茶的最佳提取時間出現(xiàn)在 40 min左右，較 30 min 的抑菌效果有些許上升。綜上可知，提取時間對不同茶葉抑制蘇云金芽孢桿菌的效果影響依次為鐵觀音 > 茉莉花茶 >紅茶。

圖4 提取時間對茶葉抑制蘇云金芽孢桿菌效果的影響

3.2.2 對大腸桿菌 的抑制效果 影響

按照試驗 2.6.2 所示方法進行試驗，探究 3 種茶葉在不同的提取時間下對大腸埃希氏菌的抑制效果。

提取時間對茶葉抑制大腸桿菌效果的影響見圖 5。

圖 5 提取時間對茶葉抑制大腸桿菌效果的影響

由試驗結(jié)果可得，以 10 mg/mL，100 ℃為基本提取條件，鐵觀音、茉莉花茶和紅茶隨著提取時間的增加，對大腸桿菌的抑制效果也增強。鐵觀音由抑菌圈直徑 9.9 mm 增加至 11.9 mm。而茉莉花茶則是由 12.4 mm 增加至 13.6 mm。而紅茶的抑菌圈直徑由 8.4 mm 增加至 11.4 mm。綜上可知，提取時間對抑制大腸桿菌的影響水平鐵觀音 > 茉莉花茶 >紅茶。

3.3 提取溫度對抑菌效果的影響

3.3.1 提取溫度對抑制蘇云金芽孢桿菌的影響

按照 2.6.3 的試驗方法進行試驗，探究提取溫度對茶葉提取液抑制蘇云金芽孢桿菌的效果影響。

不同提取溫度對茶葉粗提物抑制蘇云金芽孢桿菌的影響見圖 6。

由圖 6 可知，在 5 mg/mL，100 ℃的基本條件下，茉莉花茶和紅茶隨著提取溫度的上升，對蘇云金芽孢桿菌的抑制圈增大，但鐵觀音的提取效果在80 ℃達到了 15.3 mm，處于高度敏感水平。提取溫度對茶葉粗提物抑制蘇云金芽孢桿菌的影響效果為紅茶 > 鐵觀音 = 茉莉花茶。相關(guān)試驗曾指出提取溫度為 25～80 ℃時，茶多酚保持了很好的抑菌活性[15]；大于 80 ℃時，茶多酚的抑菌活性變化趨勢最大，抑菌效果得到抑制[16]。而紅茶的主要抑菌物質(zhì)是茶黃素，茶黃素具有熱穩(wěn)定性。

3.3.2 提取溫度對抑制大腸桿菌的影響

采用 2.6.3 所示的試驗方法，探究不同提取溫度下，茶葉粗提物對大腸桿菌的抑制效果的影響。

不同提取溫度對茶葉粗提物抑制大腸桿菌的影響見圖 7。

圖 6 不同提取溫度對茶葉粗提物抑制蘇云金芽孢桿菌的影響

圖 7 不同提取溫度對茶葉粗提物抑制大腸桿菌的影響

由圖 7 可知，提取溫度增加，紅茶和茉莉花茶的粗提物對大腸桿菌的抑制效果逐漸增加。不同的是鐵觀音在 90 ℃時提取效率達到最大值。提取溫度隨后下降。結(jié)合 3.3.1 和 3.3.2 的試驗結(jié)果，可得出綠茶的提取條件較茉莉花茶和紅茶溫和。綜合試驗結(jié)果可得，提取溫度對抑菌效果的影響為茉莉花茶 >綠茶 >紅茶。

3.4 茶葉提取正交試驗

3.4.1 正交試驗設(shè)計

正交試驗因素與水平設(shè)計見表 1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

從以上單因素結(jié)果分析，提取溫度、提取時間、茶葉粗提取液濃度因素之間存在著相互作用關(guān)系。在單因素試驗中鐵觀音對提取時間及提取溫度的敏感度較大，依據(jù)人們飲茶茶習(xí)慣，選取鐵觀音作為正交試驗材料。以鐵觀音 （綠茶） 抗蘇云金芽孢桿菌為例，將提取溫度 （A），提取時間 （B），茶葉質(zhì)量濃度 （C） 3 個因素及其水平值作為試驗條件，得到 L9（33）。

3.4.2 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果見表 2。

表2 正交試驗結(jié)果

由表 2 可知，提取時間對和茶葉質(zhì)量濃度對茶葉粗提物的抑菌效果影響最大。各因子的影響順序是B>C>A，提取時間的影響最大，茶葉濃度、提取溫度的影響效果較小。分析表中相對最好的提取方案是A2B2C3，即提取溫度 80 ℃，提取時間 20 min，質(zhì)量濃度 5 mg/mL，這與單因素結(jié)果一致。

4 結(jié)論

（1） 茶葉粗提物對革蘭氏陰性細菌的抑制效果為高度敏感，對革蘭氏陽性細菌的抑制效果為低度敏感。在茶葉質(zhì)量濃度為 2 mg/mL 時出現(xiàn)抑菌效果，最大抑菌效果為 5 mg/mL，抑菌效果與茶葉質(zhì)量濃度成呈相關(guān)。

（2） 試驗中 3 種茶葉的抑菌效果在革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌作為指示菌種的試驗中變化趨勢不同。在革蘭氏陽性細菌為指示菌的試驗中，抑菌效果為茉莉花茶 > 鐵觀音 >紅茶。而在革蘭氏陰性細菌為指示菌的試驗中，抑菌效果依次為茉莉花茶 >紅茶 >鐵觀音。

（3） 通過對鐵觀音的單因素試驗和正交試驗驗證，得到鐵觀音的沖泡條件為質(zhì)量濃度 5 mg/mL，80 ℃水溫，沖泡 20 min。