基于代表性植株二次選擇和多元統(tǒng)計(jì)分析的蘆筍芽期苗期耐鹽性鑒定及綜合評(píng)價(jià)

儀澤會(huì) 毛麗萍 趙 婧 孫黛珍

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太原 030031)

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要限制因素之一，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。據(jù)估計(jì)，全球約有20%的耕地和33%的可灌溉農(nóng)田嚴(yán)重遭受鹽堿脅迫影響[1]，同時(shí)，耕地受氣候、地層鹽性及不當(dāng)農(nóng)事操作等因素影響，鹽漬化問(wèn)題呈日益加重的趨勢(shì)，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅[2]。生物改良措施因效果好、成本低，已成功應(yīng)用于鹽堿地改良，其中，以種植耐鹽植物輔以其他農(nóng)業(yè)措施的綜合改良法較為常見(jiàn)，不僅可以增加經(jīng)濟(jì)效益，而且可對(duì)鹽漬化土壤進(jìn)行生態(tài)修復(fù)[3-5]。蘆筍(Asparagusofficinalis)，又名石刁柏，富含蘆丁、氨基酸等多種功能成分，具有抗腫瘤[6]、降血糖[7]、增強(qiáng)免疫力[8]等作用。蘆筍種植效益高，且抗逆能力突出[9]，在鹽堿地開(kāi)發(fā)中具有較大應(yīng)用潛力。因此，開(kāi)展耐鹽種質(zhì)鑒定對(duì)蘆筍耐鹽品種選育、耐鹽機(jī)理研究和鹽堿地開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

高效可靠的耐鹽性鑒定方法和評(píng)價(jià)體系是準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蘆筍耐鹽性的基礎(chǔ)。目前，耐鹽性鑒定主要為田間鑒定法和室內(nèi)鑒定法。鹽堿地、人工鹽池等田間全生育期鑒定方法更貼近生產(chǎn)實(shí)際，但成本較高且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)鑒定結(jié)果易受到鹽分、水分等外界不可控環(huán)境條件影響，不適宜進(jìn)行大規(guī)模資源鑒定[10]。植物芽期和苗期易受鹽害，是耐鹽性鑒定的關(guān)鍵時(shí)期[11]。良好的出苗率和壯苗率是作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的基礎(chǔ)，基質(zhì)栽培和營(yíng)養(yǎng)液水培等室內(nèi)芽期苗期鑒定方法具有成本低、周期短、受外界環(huán)境影響小的特點(diǎn)，適于大規(guī)模資源鑒定，但因參與脅迫處理的是代表性植株，選擇依據(jù)是大小、長(zhǎng)勢(shì)一致，常以經(jīng)驗(yàn)為主。 為了消除不同種質(zhì)間的固有性狀差異，常采用代表性植株的耐鹽系數(shù)(即鹽脅迫處理與對(duì)照的性狀相對(duì)值)來(lái)對(duì)耐鹽性進(jìn)行描述。因此，代表性植株的選擇對(duì)鑒定結(jié)果起決定作用。蘆筍屬典型的雌雄異株植物，嚴(yán)格自交難度大，致使育種資源基因型難以純合，品種純度不高[12]。前人就蘆筍耐鹽性開(kāi)展了少量研究。謝啟鑫等[9]對(duì)25份蘆筍種質(zhì)進(jìn)行耐鹽性室內(nèi)鑒定，篩選出耐鹽品種6個(gè)，將冠軍和Apollo劃分為較耐鹽類(lèi)型，而將碩豐劃分為中度耐鹽。胡淑明等[13]以生育指數(shù)為指標(biāo)，篩選出8份耐鹽性材料，認(rèn)為碩豐耐鹽性明顯強(qiáng)于冠軍和Apollo。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜栽培課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基于傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)選擇的蘆筍代表性植株在同一處理下的各單株性狀值仍存在較大差異，說(shuō)明該選擇方法僅適用于純度較高的植物品種(如陸地棉[14])，對(duì)蘆筍等純度不高的植物長(zhǎng)勢(shì)判斷存在較大偏差，導(dǎo)致性狀相對(duì)值反映的不完全是耐鹽系數(shù)，從而影響鑒定結(jié)果。然而，目前客觀判斷長(zhǎng)勢(shì)是否一致的方法尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。植物耐鹽機(jī)理極為復(fù)雜，涉及多個(gè)途徑，采用單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，運(yùn)用隸屬函數(shù)法、主成分分析法、聚類(lèi)分析等多元統(tǒng)計(jì)分析方法可以克服單一指標(biāo)和單一方式評(píng)價(jià)的局限性，目前已成功應(yīng)用于有色大麥[2]、蘆筍[9]、長(zhǎng)果黃麻[10]、粒用高粱[11]、陸地棉[14]、甘薯[15]、白花草木樨[16]、薏苡[17]等眾多作物。

本研究以49份蘆筍品種為材料，采用二次選擇法選擇代表性植株，即首次選擇株高和根長(zhǎng)一致的植株為預(yù)代表性植株，培養(yǎng)若干天后，再次根據(jù)株高和根長(zhǎng)進(jìn)行二次選擇確定為代表性植株，然后以310 mmol·L-1NaCl溶液進(jìn)行芽期苗期脅迫處理，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為蘆筍耐鹽品種選育、耐鹽機(jī)理研究及鹽堿地開(kāi)發(fā)利用提供種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為49份蘆筍品種，包括常用育成品種及新選育組合，其中國(guó)內(nèi)25份、國(guó)外24份(表1)。試驗(yàn)于2020年6月30日在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所生理實(shí)驗(yàn)室實(shí)施，選取籽粒飽滿(mǎn)、大小一致的種子，采用3% NaClO溶液消毒，經(jīng)40℃溫水浸種48 h后，一部分進(jìn)行正常催芽，另一部分進(jìn)行芽期鹽脅迫處理。待催芽種子大部分露白時(shí)，進(jìn)行播種育苗。育苗基質(zhì)自配，V椰糠∶V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖=2∶1∶1∶1，穴盤(pán)規(guī)格為32孔。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培，購(gòu)自福州飛凈生物科技有限公司。為確定耐鹽性鑒定的適宜鹽濃度，隨機(jī)選擇京綠蘆筍3號(hào)、翡翠明珠、冠軍和UC157共4個(gè)品種，設(shè)置NaCl濃度梯度為110、210、310和410 mmol·L-1，以0 mmol·L-1NaCl為對(duì)照(CK)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。通過(guò)測(cè)定芽期、苗期指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，310 mmol·L-1NaCl處理下4個(gè)品種的耐鹽系數(shù)差異最明顯，確定為適宜鹽濃度。

芽期耐鹽性鑒定方法：以一次性透明塑料飯盒(底部14.3 cm×9.2 cm，頂部16.8 cm×11.8 cm，高4.3 cm)為容器，向其中倒入500 mL營(yíng)養(yǎng)液，漂浮裝置為一次性透明塑料水杯杯底(高度約1 cm)，杯底打10個(gè)直徑為3 mm的圓洞，種胚朝下放入浸種處理過(guò)的種子，保證種胚可接觸到營(yíng)養(yǎng)液且不會(huì)掉入營(yíng)養(yǎng)液中，標(biāo)記液面位置，分3 d連續(xù)向營(yíng)養(yǎng)液中添加NaCl至預(yù)定濃度。每組50粒種子，隨機(jī)區(qū)組，3次重復(fù)，期間添加純水保持液面高度。以胚芽和胚根長(zhǎng)度均超過(guò)種子直徑的1/3為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，第4天開(kāi)始每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，在第10天結(jié)束統(tǒng)計(jì)。然后，依據(jù)株高和根長(zhǎng)選擇代表性植株，兩次選擇間隔3 d，再經(jīng)5 d培養(yǎng)后測(cè)定芽高和胚根長(zhǎng)。

幼苗期耐鹽性鑒定方法：在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽(yáng)試驗(yàn)基地日光溫室進(jìn)行穴盤(pán)育苗，苗后45 d時(shí)，選取各品種株高、根長(zhǎng)大致一致的植株進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，容器為一次性透明水杯(底部半徑2.6 cm，頂部半徑3.4 cm，高8.1 cm)，放入營(yíng)養(yǎng)液150 mL，標(biāo)記液面位置；培養(yǎng)10 d后，再次根據(jù)幼苗株高和根長(zhǎng)每組選取10株為代表性植株，然后同芽期鹽脅迫處理方法處理15 d，隨機(jī)區(qū)組，設(shè)3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

發(fā)芽率(germination rate，GR)和發(fā)芽勢(shì)(germination potential，GP)通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)測(cè)定。

發(fā)芽率=第10天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)=第7天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

芽高(sprout height，SH)、胚根長(zhǎng)(radicle length，RDL)、幼苗株高(plant height，PH)和幼苗根長(zhǎng)(root length，RL)用直尺測(cè)定；幼苗地上部鮮重(plant shoot fresh weight，PSFW)和幼苗地下部鮮重(plant root fresh weight，PRFW)用分析天平稱(chēng)量；將材料于110℃殺青15 min，85℃烘至恒重，稱(chēng)量幼苗地上部(plant shoot dry weight，PSDW)和地下部干重(plant root dry weight，PRDW)；葉綠素(chlorophyll，CHL)含量采用丙酮-無(wú)水乙醇浸提比色法測(cè)定。

表1 供試49個(gè)蘆筍品種信息Table 1 The information of 49 asparagus varieties used in this study

根冠比(rootshoot ratio，RSR)=地下部干重/地上部干重

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

耐鹽性用測(cè)定指標(biāo)的耐鹽系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)，單項(xiàng)耐鹽系數(shù)(salt tolerance coefficient，SC)和綜合耐鹽系數(shù)(comprehensive salt tolerance coefficient，CSC)分別按照公式(1)和(2)進(jìn)行計(jì)算，并對(duì)SC值進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)、相關(guān)性分析和方差分析。

SC=鹽處理測(cè)定值/對(duì)照處理測(cè)定值

(1)

(2)

i=1, 2,3,…,n；j=1,2,3,…,m

(3)

μ(Xj)=(Xj-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(4)

(5)

(6)

以D值為參考序列，SC值為比較序列，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。分別按照公式(7)～(10)計(jì)算各性狀測(cè)定指標(biāo)關(guān)聯(lián)系數(shù)[ξi(h)]、關(guān)聯(lián)度(γD)、權(quán)重系數(shù)[ωi(γ)]和加權(quán)耐鹽系數(shù)(weight salt tolerance coefficient, WSC)。其中，h表示品種編號(hào)，△i(h)表示品種h的單項(xiàng)指標(biāo)i與參考序列指標(biāo)i的差的絕對(duì)值，△min和△max和分別表示二級(jí)最小差和最大差，即△i(h)的最小值和最大值，ρ為分辨系數(shù)(取值0.5)。

ξi(h)=(Δmin+ρ×Δmax)/[Δi(h)+ρ×Δmax],

h=1,2,3,…,p;i=1,2,3,…,n

(7)

(8)

(9)

h=1,2,3,…,

p；i=1,2,3,…,n

(10)

基于D值進(jìn)行聚類(lèi)分析并劃分耐鹽等級(jí)。采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、隸屬函數(shù)分析和灰色關(guān)聯(lián)度分析，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、主成分分析及聚類(lèi)分析等多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)蘆筍芽期苗期各單項(xiàng)指標(biāo)的影響

NaCl脅迫對(duì)蘆筍芽期和苗期各單項(xiàng)指標(biāo)均產(chǎn)生了極顯著影響(表2)，各指標(biāo)平均耐鹽系數(shù)(SC)均明顯偏離1。與CK相比，處理組發(fā)芽率(GR)、發(fā)芽勢(shì)(GP)、芽高(SH)和胚根長(zhǎng)(RDL)及苗期株高(PH)、根長(zhǎng)(RL)、地上部鮮重(PSFW)、地下部鮮重(PRFW，井岡111除外)、地上部干重(PSDW)和葉綠素(CHL)含量均有所下降(SC<1)，而苗期34個(gè)品種的地下部干重(PRDW)和46個(gè)品種的根冠比(RSR)則均有所上升(SC>1)。同一指標(biāo)的耐鹽系數(shù)在不同品種中存在較大變幅，其中苗期指標(biāo)的變幅(11.66%～28.87%)明顯大于芽期指標(biāo)(10.49%～21.43%)，說(shuō)明苗期單項(xiàng)指標(biāo)具有更強(qiáng)的基因型依賴(lài)性。各單項(xiàng)指標(biāo)的平均耐鹽系數(shù)、處理值與對(duì)照值的相關(guān)系數(shù)分別介于0.444～1.554 和0.428～0.941，且同一品種不同單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽性排序存在較大差異，說(shuō)明不同單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)NaCl脅迫處理的響應(yīng)存在明顯不同，采用單項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)會(huì)影響準(zhǔn)確性，需綜合使用多個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)耐鹽性。

2.2 各單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽系數(shù)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(表3)，芽期單項(xiàng)指標(biāo)間均存在極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，苗期單項(xiàng)指標(biāo)間大部分存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)相關(guān)性，而芽期和苗期指標(biāo)間絕大多數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性。其中，根冠比(RSR)與地上部干重(PSDW)和地下部干重(PRDW)分別呈極顯著正相關(guān)性和極顯著負(fù)相關(guān)性，葉綠素含量(CHL)與株高(PH)和地上部鮮重(PSFW)呈極顯著正相關(guān)性、與PSDW呈顯著正相關(guān)性。這說(shuō)明單項(xiàng)指標(biāo)描述的耐鹽性信息間存在交叉重疊，直接使用難以客觀、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，需要采用隸屬函數(shù)法、主成分分析法、聚類(lèi)分析法等多元統(tǒng)計(jì)方法有效整合單項(xiàng)指標(biāo)信息，綜合評(píng)價(jià)耐鹽性。

表3 鹽脅迫下蘆筍13個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽系數(shù)的相關(guān)性Table 3 Correlation of salt tolerance coefficients among 13 single indexes of asparagus under salt stress

2.3 49個(gè)蘆筍品種的芽期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

蘆筍芽期單項(xiàng)指標(biāo)僅有4個(gè)，均與耐鹽性呈正相關(guān)，因此根據(jù)單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽系數(shù)計(jì)算單項(xiàng)指標(biāo)隸屬函數(shù)值[μ(xj)]及各品種平均隸屬函數(shù)值(U)，并以U值為參考序列，SC值為比較序列，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，計(jì)算芽期加權(quán)耐鹽系數(shù)(WSC)，綜合評(píng)價(jià)蘆筍品種芽期耐鹽性(表4)。49個(gè)品種的U、CSC和WSC值分別介于0.092～0.919、0.419～0.803和0.416～0.801，均值分別為0.623、0.668和0.666，變異系數(shù)(CV)分別為28.82%、12.44%和12.50%。據(jù)三者值的大小進(jìn)行排序，得到排序結(jié)果基本一致(表4)，三者之間存在極顯著相關(guān)(P<0.01)(圖1)。其中，U值排名為前5位的為特立龍、冠軍、綠寶麗、精品阿拉斯和荷蘭白筍王，排名后5位的為US825、井岡111、豐島2、浙豐811和京綠蘆3號(hào)。基于U值聚類(lèi)將49個(gè)品種芽期耐鹽性劃分為4個(gè)等級(jí)(圖2)：第一類(lèi)為強(qiáng)耐鹽品種，包括特立龍和冠軍2個(gè)品種，U值范圍為0.914～0.919，占總數(shù)的4.08%；第二類(lèi)為中耐鹽品種，包括綠寶麗、精品阿拉斯等25個(gè)品種，U值范圍為0.656～0.833，占總數(shù)的51.02%；第三類(lèi)為弱耐鹽品種，包括紫色陽(yáng)光、JX1914等18個(gè)品種，U值范圍為0.404～0.620，占總數(shù)的36.74%；第四類(lèi)鹽敏感品種，包括京綠蘆3號(hào)、浙豐811等4個(gè)品種，U值范圍為0.092～0.235，占總數(shù)的8.16%。

注：R同表2。Note：R same as Table 2.圖1 鹽脅迫條件下蘆筍芽期CSC值、U值和WSC值的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of CSC value, U value and WSC value at germination stage of asparagus under salt stress

表4 供試蘆筍品種芽期耐鹽性評(píng)價(jià)的CSC值、U值和WSC值Table 4 The CSC, U and WSC value of salt tolerance evaluation in tested 49 asparagus varieties at germination stage

2.4 49個(gè)蘆筍品種的苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

2.4.1 苗期主成分分析 苗期單項(xiàng)指標(biāo)共8項(xiàng)，且彼此間存在一定的相關(guān)性，為避免信息重疊，需使用主成分分析法進(jìn)行降維，共提取出特征根>0.8的主成分3個(gè)，分別以F1、F2和F3表示，貢獻(xiàn)率分別為40.573%、26.744%和10.488%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為77.805%，即可反映8個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)77.805%的信息，符合主成分分析要求(表5)。據(jù)各因子載荷可知，主成分(F1)主要代表苗期根長(zhǎng)、地下部鮮重、地下部干重和根冠比，主要反應(yīng)地下部生長(zhǎng)情況，可解釋F1的94.28%；F2主要代表苗期株高和葉綠素含量，主要反應(yīng)地上部外觀形態(tài)，可解釋F2的62.16%；F3主要代表地上部鮮重和地上部干重，主要反應(yīng)地上部質(zhì)量，可解釋F3的61.08%。F1、F2和F3的權(quán)重(Wj)分別為0.521、0.344 和0.135。

2.4.2 苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià) 以單項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定值為基礎(chǔ)，計(jì)算綜合指標(biāo)值(Xj)、綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值[μ(Xj)] 和耐鹽性綜合度量值(D)(表6)。49個(gè)蘆筍品種幼苗期D值介于0.147～0.718，均值為0.460，CV為35.94%。按D值大小進(jìn)行耐鹽性排序，前5名品種為綠寶麗、京綠蘆1號(hào)、伊諾斯、全雄奈特和冠軍，后5名為新科2030、京紫蘆2號(hào)、JX1913、UC157和TC。

注：Ⅰ: 強(qiáng)耐鹽；Ⅱ: 中耐鹽；Ⅲ: 弱耐鹽；Ⅳ: 鹽敏感。下同。Note：Ⅰ: Strong salt tolerance. Ⅱ: Medium salt tolerance. Ⅲ: Weak salt tolerance. Ⅳ: Salt sensitivity. The same as following.圖2 基于U值的49個(gè)蘆筍品種芽期耐鹽性聚類(lèi)圖Fig.2 The clustering dendrogram of salt tolerance in 49 asparagus varieties at germination stage based on U value

圖3 鹽脅迫條件下蘆筍苗期CSC值、D值和WSC值的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of CSC value, D value and WSC value at seedling stage of asparagus under salt stress

D值為參考序列，SC值為比較序列，采用灰色關(guān)聯(lián)分析法計(jì)算加權(quán)耐鹽系數(shù)(WSC)(表6)。49個(gè)蘆筍品種幼苗期CSC值和WSC值分別介于0.669～1.054 和0.672～1.070之間，均值分別為0.869 和0.876，CV為12.51%和12.77%。CSC值、WSC值和D值三者間的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平(圖3)，排序結(jié)果基本一致。49個(gè)品種基于D值聚類(lèi)可劃分為4個(gè)耐鹽等級(jí)(圖4)：第一類(lèi)為強(qiáng)耐鹽品種，包括京綠蘆1號(hào)、綠寶麗等12個(gè)品種，D值范圍為0.609～0.718，占總數(shù)的24.49%；第二類(lèi)為中耐鹽品種，包括艾麗絲、JX1914等20個(gè)品種，D值范圍為0.397～0.565，占總數(shù)的40.82%；第三類(lèi)為弱耐鹽品種，包括JX1913、豐島2號(hào)等14個(gè)品種，D值范圍為0.227～0.361，占總數(shù)的28.57%；第四類(lèi)鹽敏感品種，包括新科2030、京紫蘆2號(hào)等3個(gè)品種，D值范圍為0.147～0.185，占總數(shù)的6.12%。

表5 鹽脅迫下蘆筍苗期8個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的主成分分析Table 5 Principal component analysis of 8 single indexes of asparagus seedlings under salt stress

2.5 芽期苗期耐鹽性綜合分析

蘆筍芽期、苗期耐鹽性不一致(表7)，如京綠蘆3號(hào)、井岡111在幼苗期表現(xiàn)為強(qiáng)耐鹽，在芽期表現(xiàn)為鹽敏感；新科2030在芽期表現(xiàn)為中耐鹽，在幼苗期表現(xiàn)為鹽敏感。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分材料雖然芽期苗期耐鹽性排序不同，但屬于同一耐鹽等級(jí)，如冠軍、特立龍?jiān)趦蓵r(shí)期均表現(xiàn)為強(qiáng)耐鹽，華淼、銳力均表現(xiàn)為中耐鹽。相關(guān)性分析表明，芽期和苗期的耐鹽性相關(guān)系數(shù)為0.159 (P=0.275)，即無(wú)顯著相關(guān)性。

表6 各品種幼苗期綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值及CSC值、D值和WSC值Table 6 The subordinate function value, CSC value, D value and WSC value of asparagus varieties at seedling stage

圖4 基于D值的49個(gè)蘆筍品種苗期耐鹽性聚類(lèi)圖Fig.4 The clustering dendrogram of salt tolerance in 49 asparagus varieties at seedling stage based on D value

3 討論

3.1 蘆筍芽期苗期耐鹽性鑒定方法

蘆筍屬?gòu)?qiáng)耐鹽植物，是鹽堿地開(kāi)發(fā)利用和探索植物耐鹽機(jī)理的先鋒作物[9]。耐鹽性的鑒定方法是評(píng)價(jià)植物耐鹽性的基礎(chǔ)，影響因素包括鑒定方式、鑒定指標(biāo)和耐鹽性描述等。理想的鑒定方法是在確保準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，采取簡(jiǎn)化鑒定程序和節(jié)約鑒定成本等措施，從而實(shí)現(xiàn)快速化、便捷化和高效化，并實(shí)現(xiàn)大規(guī)模資源鑒定。本研究采用營(yíng)養(yǎng)液水培方式對(duì)蘆筍芽期苗期耐鹽性進(jìn)行鑒定，水培容器為一次性透明飯盒和一次性透明水杯，具有如下4點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：一、在蘆筍芽期苗期可快速、準(zhǔn)確地初篩耐鹽品種，大幅減少田間鑒定的成本和工作量[18]；二、水培溶液的鹽分濃度較為均勻，可防止土壤或基質(zhì)栽培中鹽分非均勻分布對(duì)鑒定結(jié)果造成影響；三，可以直觀鹽脅迫下的根系生長(zhǎng)過(guò)程，避免土壤或基質(zhì)栽培在選擇代表性植株時(shí)對(duì)根系造成傷害，防止傷勢(shì)差異對(duì)生長(zhǎng)速度造成影響；四、可實(shí)現(xiàn)一次性透明飯盒和水杯的廢物再利用，降低鑒定成本。

表7 49個(gè)蘆筍品種的芽期苗期耐鹽性綜合分析Table 7 Comprehensive analysis on salt tolerance in 49 asparagus varieties at the germination and seedling stage

植物耐鹽性由多基因控制，目前已在植物中發(fā)現(xiàn)多種耐鹽途徑，采用多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行耐鹽性鑒定更為客觀、合理[15-16]。因此，本研究選取發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)等4個(gè)芽期形態(tài)指標(biāo)和株高、根長(zhǎng)等8個(gè)苗期形態(tài)和生理指標(biāo)對(duì)蘆筍芽期和苗期耐鹽性進(jìn)行鑒定，并采用耐鹽系數(shù)進(jìn)行描述，該方法與謝啟鑫等[9]和高春華等[11]的方法一致，可消除品種間的固有性狀差異，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。長(zhǎng)勢(shì)是反映植株生長(zhǎng)速度的重要指標(biāo)，代表性植株的長(zhǎng)勢(shì)是否一致對(duì)鑒定結(jié)果具有重要影響。同一品種的鹽脅迫處理和對(duì)照處理的代表性植株長(zhǎng)勢(shì)不一致，說(shuō)明二者生物量差異不完全由鹽脅迫引起，還包括植株生長(zhǎng)速度差異因素，即二者性狀相對(duì)值反映的不完全是耐鹽系數(shù)，從而降低了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性?；趥鹘y(tǒng)經(jīng)驗(yàn)選擇的蘆筍代表性植株經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，同一處理不同單株間生物量仍存在較大差異，這說(shuō)明植株長(zhǎng)勢(shì)不一致，而品種純度不高則是造成該現(xiàn)象的主要原因，表明該方法不適用于純度不高的植物類(lèi)型。本研究提出了代表性植株二次選擇法，首次根據(jù)株高和根長(zhǎng)確定預(yù)代表性植株，共同培養(yǎng)一段時(shí)間后，可將株高和根長(zhǎng)仍一致的植株判定為長(zhǎng)勢(shì)一致的代表性植株。利用該方法選擇的代表性植株經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，同一處理不同單株間生物量整齊度大幅提升，說(shuō)明二次選擇法較傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)判斷更為科學(xué)、合理，對(duì)于提升蘆筍耐鹽性鑒定的準(zhǔn)確性具有一定作用。

3.2 蘆筍芽期苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)方法

科學(xué)合理的評(píng)價(jià)體系對(duì)植物耐鹽性鑒定也至關(guān)重要[17]。本研究中，除了幼苗期地下部干重和根冠比外，芽期4個(gè)指標(biāo)和苗期6個(gè)指標(biāo)均不同程度地受到鹽脅迫抑制，這與沙棗[18]、啤酒大麥[19]研究結(jié)果一致。一方面說(shuō)明根系補(bǔ)償生長(zhǎng)有助于緩解鹽害造成的根系功能損傷，對(duì)提高耐鹽性具有重要意義；另一方面說(shuō)明不同指標(biāo)對(duì)鹽脅迫反應(yīng)的敏感性差異較大，響應(yīng)機(jī)制不同，采用單項(xiàng)指標(biāo)或等權(quán)重使用多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)均會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果造成影響。近年來(lái)，采用隸屬函數(shù)法、主成分分析法、聚類(lèi)分析法等多方法相結(jié)合的綜合評(píng)價(jià)體系已廣泛應(yīng)用于蘆筍[9]、粒用高粱[11]、陸地棉[14]、甘薯[15]等作物的耐鹽性評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)法可將各指標(biāo)值歸一化為0～1之間的純數(shù)，同時(shí)對(duì)各指標(biāo)的權(quán)重進(jìn)行考量，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)指標(biāo)間的有效比較。

本研究中，蘆筍芽期以U值為主評(píng)價(jià)指標(biāo)，排序結(jié)果與聚類(lèi)分析一致，同時(shí)，以CSC和WSC值進(jìn)行輔助評(píng)價(jià)驗(yàn)證，三者之間呈極顯著正相關(guān)。蘆筍苗期大部分指標(biāo)間相關(guān)性較強(qiáng)，彼此間存在信息重疊。利用主成分降維思想可以將多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的單項(xiàng)指標(biāo)濃縮為少數(shù)幾個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，并根據(jù)貢獻(xiàn)率確定權(quán)重，采用綜合度量值對(duì)復(fù)雜性狀進(jìn)行全面準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，使評(píng)價(jià)結(jié)果更加接近種質(zhì)真實(shí)的耐鹽性。本研究采用主成分分析法將蘆筍株高、根長(zhǎng)等8個(gè)苗期單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，以D值為主評(píng)價(jià)指標(biāo)，CSC和WSC值為輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)，三者排序結(jié)果基本一致，基于D值采用聚類(lèi)分析法進(jìn)行耐鹽等級(jí)劃分，結(jié)果與D值排序結(jié)果一致。說(shuō)明該評(píng)價(jià)體系對(duì)蘆筍芽期苗期的耐鹽性評(píng)價(jià)結(jié)果具有較高可信度，在耐鹽性評(píng)價(jià)中使用D值和聚類(lèi)分析法即可對(duì)蘆筍耐鹽性進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。

3.3 蘆筍芽期苗期耐鹽性比較

植物的耐鹽性與生育期有關(guān)[20-21]。本研究中，蘆筍芽期和苗期的耐鹽性存在一定差異，如京綠蘆3號(hào)、井岡111在苗期強(qiáng)耐鹽而芽期鹽敏感。本結(jié)果與高粱[20]、小麥[21]的研究結(jié)果一致，其原因可能是芽期和苗期的耐鹽性機(jī)制不盡相同，如植物激素介導(dǎo)的種子萌發(fā)與芽期耐鹽性密切相關(guān)[22-24]，而Na+離子區(qū)隔化、K+選擇性吸收、泌鹽等則在苗期耐鹽性中發(fā)揮重要作用[25]。本研究鑒定出在芽期和苗期耐鹽性均較強(qiáng)的品種冠軍和特立龍，可用于后續(xù)蘆筍耐鹽機(jī)理研究。其中，冠軍在謝啟鑫等[9]研究中也被鑒定為耐鹽類(lèi)型，并且其強(qiáng)耐鹽性在山西忻州鹽堿地的生產(chǎn)實(shí)踐中得到了證實(shí)；特立龍尚不能應(yīng)用于鹽堿地規(guī)模化種植，主要由于其品種產(chǎn)量除與芽期苗期抗性有關(guān)外，仍與作物自身的產(chǎn)量情況及產(chǎn)量指標(biāo)的耐鹽情況密切相關(guān)[25-27]，需進(jìn)一步開(kāi)展鹽堿地全生育期鑒定。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，310 mmol·L-1NaCl脅迫對(duì)蘆筍芽期和苗期各指標(biāo)均有極顯著影響。本研究提出的代表性植株二次選擇與多元統(tǒng)計(jì)分析的耐鹽性鑒定方法和評(píng)價(jià)體系可消除代表性植株的長(zhǎng)勢(shì)差異，鑒定結(jié)果更為科學(xué)、合理，可用于大規(guī)模蘆筍種質(zhì)的早期耐鹽性鑒定篩選，大幅減少蘆筍鹽堿地全生育期鑒定的成本和工作量。同時(shí)，初步篩選出芽期苗期均表現(xiàn)為強(qiáng)耐鹽的蘆筍品種2個(gè)，可為后續(xù)耐鹽基因挖掘和耐鹽新品種選育提供種質(zhì)材料。