王挺進(jìn) 袁 璐 劉 柯 劉玲娟 劉勝龍 陳利萍,* 文香英

(1浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系，浙江 杭州 310058; 2浙江鳳陽山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，浙江 龍泉 323700；3中國科學(xué)院華南植物園，廣東 廣州 510650)

廣西越桔(Vacciniumsinicum)是杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)的小灌木，生長于海拔1 200～1 700 m的山林、山谷石等地，主要分布于我國湖南、廣東及廣西地區(qū)[1]。葉立新等[2]于2001年首次在浙江省鳳陽山發(fā)現(xiàn)廣西越桔，標(biāo)志著其分布區(qū)域向東北擴(kuò)展。因個(gè)體數(shù)極少、自然更新能力差，鳳陽山上的廣西越桔面臨局部地區(qū)滅絕的危險(xiǎn)。2012年，廣西越桔被列入《浙江省重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》[3]。因此，廣西越桔的保護(hù)和繁育對(duì)維護(hù)種質(zhì)資源多樣性有著十分重要的意義[4-5]。目前關(guān)于廣西越桔的研究主要集中在分布地域、生境、植株形態(tài)、花果期等方面[6-7]，而對(duì)其進(jìn)行保護(hù)的研究尚鮮見。

鳳陽山上的廣西越桔雖然每年都開花結(jié)果，但未觀察到自然更新后代。研究表明，對(duì)于自然界中難以自然更新的種群，可以通過早期胚培養(yǎng)減少胚育的發(fā)生，使其繼續(xù)生長發(fā)育成完整植株，并以此開展人工保護(hù)和繁育研究[8-11]。因此，通過培養(yǎng)未成熟種子獲得有性后代及其離體快繁是保護(hù)廣西越桔種質(zhì)資源遺傳多樣性、擴(kuò)大種群數(shù)量的有效途徑。

本研究以采集于浙江省鳳陽山的廣西越桔未成熟果實(shí)為材料，通過未成熟種子培養(yǎng)獲得試管實(shí)生苗。以試管實(shí)生苗莖段為外植體，培養(yǎng)于木本植物培養(yǎng)基(woody plant medium, WPM)[12]，附加不同濃度6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine, 6-BA)或玉米素(zeatin, ZT)和α-萘乙酸(naphthalene acetic acid, NAA)，建立離體快繁體系。在此基礎(chǔ)上，通過相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)[13]分析原生株與后代群體間的遺傳多樣性，以期將遺傳多樣性豐富的試管苗群體經(jīng)煉苗后回歸至鳳陽山-百山祖國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，并為相近處境珍稀植物的保育和利用提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以采集于浙江省鳳陽山的廣西越桔原生株的未成熟果實(shí)為材料，未成熟果實(shí)表皮堅(jiān)硬，呈淺綠色。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料消毒與滅菌 將未成熟果實(shí)用潔凈流水沖洗2 h后，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用75%酒精浸泡30 s， 無菌水沖洗3次。再用0.1% HgCl2水溶液浸泡處理10 min，無菌水沖洗3次。最后在無菌濾紙上將果實(shí)的表面水分吸干。

1.2.2 未成熟種子培養(yǎng) 縱向切開果實(shí)后取下未成熟種子及部分子房組織，接種至發(fā)育培養(yǎng)基(表1)，先于溫度25℃的黑暗條件下培養(yǎng)24 h后，再于光照強(qiáng)度20 μmol·m-2·s-1、 光照時(shí)間12 h·d-1條件下培養(yǎng)24 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)育率。

待未成熟種子種皮變?yōu)榘岛稚?、種子飽滿即發(fā)育完全，接種至萌發(fā)培養(yǎng)基(表1)，于溫度25℃、光照強(qiáng)度20 μmol·m-2·s-1、光照時(shí)間12 h·d-1條件下培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/發(fā)育完全種子數(shù)×100%；總萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Component of medium

1.2.3 增殖培養(yǎng)與生根培養(yǎng) 種子露白后轉(zhuǎn)移至生長培養(yǎng)基(表1)培養(yǎng)。生長至6～7 cm時(shí)，取帶有一個(gè)腋芽的莖段，接種至1～8號(hào)增殖培養(yǎng)基(表1)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，以接種至生長培養(yǎng)基為對(duì)照。增殖培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)(增殖系數(shù)=總再生芽數(shù)/總外植體數(shù)×100%)和莖段長度。再生芽長至3～4片葉時(shí)接種至生根培養(yǎng)基(表1)。培養(yǎng)條件均為：溫度25℃、光照強(qiáng)度50 μmol·m-2·s-1、光照時(shí)間12 h·d-1。

1.2.4 種群增強(qiáng)與回歸 培養(yǎng)得到完整再生植株，株高達(dá)6～7 cm后，用清水洗去培養(yǎng)基，移栽入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的基質(zhì)中(泥炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1)進(jìn)行煉苗。煉苗條件為：溫度22℃/18℃、光照強(qiáng)度50 μmol·m-2·s-1、 光照時(shí)間12 h·d-1。煉苗期間每14 d澆施少量水溶肥，30 d后選取壯苗移栽至保護(hù)區(qū)苗圃，在苗圃中生長6個(gè)月后于回歸試驗(yàn)地進(jìn)行種群增強(qiáng)與回歸，6個(gè)月后觀察植株生長情況。期間由保護(hù)區(qū)工作人員定期清除競爭植被，統(tǒng)計(jì)移栽前后成活率、株高、株幅、成熟葉長、成熟葉寬、一級(jí)分枝數(shù)。

1.2.5 SRAP-PCR體系建立及遺傳多樣性分析 通過SRAP分子標(biāo)記對(duì)鳳陽山野生廣西越桔原生株及試管實(shí)生苗后代進(jìn)行遺傳多樣性分析。提取葉片DNA，采用2×Taq PCR Master Mix進(jìn)行SRAP-PCR反應(yīng)。在20 μL體系中，對(duì)反應(yīng)的退火溫度、模板DNA含量、引物濃度進(jìn)行五水平優(yōu)化，其中退火溫度設(shè)置為46、48、50、52、54℃，模板DNA含量設(shè)置為40、60、80、100、120 ng，引物濃度設(shè)置為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1。研究退火溫度、模板DNA含量、引物濃度對(duì)反應(yīng)的影響時(shí)，固定其他影響因素水平為模板DNA含量120 ng、引物濃度0.5 μmol·L-1、退火溫度48℃。經(jīng)初步篩選采用引物組合Me7+Em8和Me8+Em1(表2)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在20 μL體系擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4 μL 6×Loading Buffer，94℃變性5 min。冷卻后利用6%聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)進(jìn)行電泳分離和強(qiáng)堿銀染檢測(cè)。記泳道中清晰易辨的條帶為“1”，同一遷移率處無清晰條帶的為“0”，建立0/1矩陣，并用NTSYS-pc2.1軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity, GS)。

表2 試驗(yàn)所用SRAP引物Table 2 SRAP primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 未成熟種子培養(yǎng)

為了解決廣西越桔無自然更新后代的問題，本試驗(yàn)以其未成熟果實(shí)為材料，開展了未成熟種子培養(yǎng)。從原生株上取得4顆未成熟果實(shí)，果實(shí)直徑6.31±0.34 mm，表皮堅(jiān)硬，呈綠色，蠟質(zhì)不明顯，萼片開放呈淺粉紫色(圖1-a)。4顆未成熟果實(shí)中共有未成熟種子27粒，呈長卵形或紡錘形，種皮淺黃褐色，較飽滿；敗育種子共3粒，形狀不規(guī)則，種皮淺黃色，較干癟。

27粒未成熟種子在發(fā)育培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后，其中23粒種皮顏色加深，由淺黃褐色(圖1-b)轉(zhuǎn)為深棕褐色(圖1-c)，種子體積略增大，視為發(fā)育完成，發(fā)育率為85.19%。將發(fā)育完成的種子接種至萌發(fā)培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d后共萌發(fā)7顆種子，萌發(fā)率達(dá)30.43%，總萌發(fā)率為25.92%。種子萌發(fā)后，生長成為試管實(shí)生苗(圖1-d)。在未成熟種子培養(yǎng)過程中，無污染發(fā)生。因此，可以通過未成熟種子培養(yǎng)獲得廣西越桔有性后代，改變鳳陽山廣西越桔無有性后代的現(xiàn)狀。

2.2 離體快繁體系建立

為了擴(kuò)大個(gè)體數(shù)量以迅速建立種群，本試驗(yàn)以未成熟種子培養(yǎng)得到的試管實(shí)生苗為外植體，利用不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基，建立了離體快繁體系。結(jié)果顯示，相比6-BA，ZT處理能更有效地誘導(dǎo)芽的發(fā)生(表3，表4)，6～8號(hào)增殖培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)出叢生芽(圖2-a)，其中6號(hào)增殖培養(yǎng)基對(duì)芽的誘導(dǎo)率最高，為106.67%(表4)，1～4號(hào)增殖培養(yǎng)基與生長培養(yǎng)基均只誘導(dǎo)出單個(gè)再生芽。在一定濃度范圍內(nèi)，6-BA和ZT處理后再生枝長度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，ZT處理更有效地促進(jìn)再生枝的生長，再生枝長度均大于對(duì)照組(表3，表4)，其中6號(hào)增殖培養(yǎng)基中再生枝長度最長，為4.88 cm(表4)。因此，確定6號(hào)增殖培養(yǎng)基為最佳增殖培養(yǎng)基，可達(dá)到較高的增殖系數(shù)并有效促進(jìn)再生枝的生長。

注：a：未成熟果實(shí)； b：未成熟種子；c：發(fā)育完全種子；d：試管實(shí)生苗。Note: a: Immature fruit. b: Immature seed. c: Fully developed seed. d: In ritro seedling.圖1 廣西越桔未成熟種子培養(yǎng)Fig.1 Immature seeds culture of V. sinicum

再生枝長至3～4片葉后接種至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)45 d后，成活率及生根率達(dá)100%，根系生長旺盛且再生植株生長良好(圖2-b)。在離體快繁體系建立過程中，無污染發(fā)生。

表3 6-BA對(duì)廣西越桔莖段增殖系數(shù)及長度影響Table 3 Effects of 6-BA on the multiplication coefficient and the length of stem in V. sinicum

2.3 種群增強(qiáng)與回歸

種群增強(qiáng)與回歸可改善種群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)種群動(dòng)態(tài)，使現(xiàn)存天然種群得到恢復(fù)壯大。本試驗(yàn)將生長至6～7 cm的完整再生植株進(jìn)行煉苗并回歸至原發(fā)現(xiàn)地。煉苗過程中再生植株生長良好，未發(fā)生污染，成活率達(dá)100%。經(jīng)過30 d的煉苗處理，將其中23株壯苗回歸至保護(hù)區(qū)苗圃，6個(gè)月后存活23株，成活率為100%。再回歸至試驗(yàn)地，6個(gè)月后存活22株，成活率為95.65%，生長良好(表5，圖3)。結(jié)果表明，離體快繁得到的再生植株適應(yīng)回歸試驗(yàn)地生境，有望建立起具

表4 ZT對(duì)廣西越桔莖段增殖系數(shù)及長度影響Table 4 Effects of ZT on the multiplication coefficient and the length of stem in V. sinicum

注：a：叢生芽的誘導(dǎo)；b：生根培養(yǎng)。Note: a: Induction of cluster buds. b: Root induction.圖2 廣西越桔快繁體系的建立Fig.2 In vitro propagation of V. sinicum

有一定適應(yīng)能力，且能自然更新的種群。

通過對(duì)已回歸植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其中2株(記為Ⅱ類，圖4-a)在葉形、葉色、葉質(zhì)上與其他植株(記為Ⅰ類，圖4-b)及原生株存在差異(表6)：Ⅱ類葉形為闊橢圓形近圓形、葉色淺綠、葉質(zhì)革質(zhì)化淺；Ⅰ類和原生株葉形為闊橢圓形，葉色濃綠、葉質(zhì)革質(zhì)化深，表明未成熟種子培養(yǎng)獲得的后代與原生株相比發(fā)生表型變異。

2.4 遺傳多樣性分析

為了探究原生株與未成熟種子培養(yǎng)后代群體的遺傳多樣性，本試驗(yàn)以原生株與后代群體為材料，以初篩Me7+Em8、Me8+Em1引物組合為前后引物，發(fā)現(xiàn)在退火溫度48℃、模板DNA濃度80 ng、引物濃度0.4 μmol·L-1條件下獲得最多清晰條帶(表7)。

以原生株(記為P)及未成熟種子培養(yǎng)后代(記為S1～S7)為模板DNA，利用上述反應(yīng)條件，以不同引物組合擴(kuò)增并進(jìn)行后續(xù)分析(圖5)。通過統(tǒng)計(jì)分析建立

表5 植株回歸前后生長情況Table 5 Growth states of seedlings before and after reintroduction

表6 植株葉形差異Table 6 The difference of leaf shape

0/1矩陣，采用NTSYS-pc2.1軟件計(jì)算得到P和S1～S7群體的遺傳相似系數(shù)在0.727 1～0.977 8之間，平均相似系數(shù)為0.841 0，極差為0.250 7(表8)。結(jié)合回歸結(jié)果，原生株與未成熟種子培養(yǎng)后代群體在遺傳結(jié)構(gòu)上確實(shí)存在差異且可能引起表型變異。

注：a：2017年10月生長情況；b：2018年4月生長情況。Note: a: Situation of plant growth in Oct. 2017. b: Situation of plant growth in Apr. 2018.圖3 植株回歸前后生長情況Fig.3 Growth state of seedlings before and after reintroduction

注：a：Ⅱ類植株；b：Ⅰ類植株。Note: a: Type Ⅱ plant. b: Type Ⅰ plant.圖4 回歸植株群體的兩種表型Fig.4 Two phenotypes of plant populations after reintroduction

表7 不同反應(yīng)條件對(duì)廣西越桔SRAP-PCR體系的影響Table 7 Effects of different reaction conditions on SRAP-PCR of V. sinicum

3 討論

浙江省廣西越桔種群數(shù)量極小，亟需保護(hù)其種質(zhì)資源并擴(kuò)大種群數(shù)量，為此本研究采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行未成熟種子培養(yǎng)及其離體快繁。研究表明，組織培養(yǎng)克服了傳統(tǒng)無性繁殖方法速度慢、繁殖系數(shù)低等缺點(diǎn)，便于集約化管理和工廠化生產(chǎn)，可用于越桔屬植物及其他眾多珍稀瀕危植物的快速培育[14-16]，并且可避免不利環(huán)境因素影響，尤為適用于珍稀植物種質(zhì)資源的離體保存[17]。對(duì)于野生珍稀植物而言，其遺傳多樣性越豐富，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[18]，因此必須通過有性繁殖保護(hù)其遺傳多樣性，單純通過無性繁殖擴(kuò)大種群數(shù)量難以改變珍稀現(xiàn)狀。本研究以廣西越桔未成熟果實(shí)中的未成熟種子為起始材料，保存了不同基因型的有性后代，并通過離體快繁增加了種群數(shù)量。

注：紅色方框內(nèi)為顯著差異區(qū)域。Note: Significantly different areas are in the red box.圖5 部分引物組合SRAP擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 SRAP amplification results of parts of primer combinations

表8 樣本間的遺傳相似系數(shù)Table 8 Genetic similarity coefficients among samples

野生越桔屬植物主要依靠種子繁殖，但自然條件下其種子萌發(fā)率低，種群自然更新能力弱。富晶晶等[10]研究發(fā)現(xiàn)，幼嫩種子經(jīng)培養(yǎng)后萌發(fā)率可達(dá)44.5%，高于成熟種子的32.0%。本研究中，廣西越桔的未成熟種子經(jīng)離體培養(yǎng)后可發(fā)育完全直至萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)30.43%，而鳳陽山未觀察到自然更新后代，因此采用未成熟種子培養(yǎng)進(jìn)行保護(hù)是科學(xué)的。此外，王明潔等[19]以400 mg·L-1GA3溶液浸泡篤斯越桔種子，使萌發(fā)率達(dá)91.3%，而本研究中，廣西越桔種子的萌發(fā)率僅為25.92%，一方面可能是物種本身特性引起的種子活力不足，另一方面可能是發(fā)育完全的種子進(jìn)入休眠，因此在后續(xù)研究中可通過誘導(dǎo)未成熟胚萌發(fā)或適當(dāng)提高培養(yǎng)基中的GA3濃度等方式進(jìn)一步提高廣西越桔種子的萌發(fā)率。通過離體快繁可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量長勢(shì)良好的組培苗，這一研究結(jié)果與前人觀點(diǎn)一致[20]，相比愈傷組織再生途徑，本研究主要通過“短枝發(fā)生型”再生途徑獲得再生芽，雖然增殖系數(shù)較低，但遺傳變異少。Cheng等[21]發(fā)現(xiàn)ZT對(duì)越桔屬植物不定芽再生具有良好的促進(jìn)作用，本研究也發(fā)現(xiàn)ZT的促進(jìn)效果優(yōu)于6-BA，因此在野生越桔屬植物離體保護(hù)中，可優(yōu)先考慮ZT。

利用高共顯性的SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，有性后代與原生株群體間的相似系數(shù)在0.727 1～0.977 8之間，平均為0.841 0，極差為0.250 7，說明群體遺傳結(jié)構(gòu)在部分特定區(qū)域存在差異，這種差異可能來自雜合原生株有性繁殖過程中的自交分離、基因重組或自然變異等。采用SRAP分子標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)后代群體的早期鑒定[22]，據(jù)此本研究通過篩選不同基因型的后代個(gè)體回歸至原分布的自然或半自然生境中，以期建立具有一定規(guī)模且適應(yīng)環(huán)境變化，能夠自然維持與更新的新種群，這對(duì)種群以及生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)具有重要意義。因種群內(nèi)個(gè)體由原生株自交(或近交)產(chǎn)生，導(dǎo)致遺傳多樣性水平較低。但研究表明，在遺傳多樣性水平低的情況下，增加表型多樣性也有利于種群適應(yīng)環(huán)境[23]，因此觀察到的廣西越桔后代表型變異也是適應(yīng)環(huán)境變化的潛在基礎(chǔ)。通常因生長速度慢、環(huán)境適應(yīng)性差等不足，珍稀瀕危植物回歸后處于弱勢(shì)，難以與生長繁殖能力強(qiáng)和爭奪光照、養(yǎng)分及空間等能力強(qiáng)的植物如禾本科植物競爭，導(dǎo)致回歸試驗(yàn)成功率較低，植株長勢(shì)不良甚至逐漸死亡[24-25]。而鳳陽山杜鵑花科植被資源豐富，如灌木層的優(yōu)勢(shì)種即鹿角杜鵑(Rhododendronlatoucheae)、杜鵑(Rhododendronsimsii)等[2]，一定程度上說明了鳳陽山生境適宜杜鵑花科植物生長，且土壤中杜鵑花類菌根真菌豐富，其在杜鵑花科植物的營養(yǎng)吸收、逆境生理、生態(tài)適應(yīng)等方面具有重要作用[26]。前人研究表明藍(lán)莓雖缺失根毛，但內(nèi)生菌根真菌對(duì)其具有顯著的促生作用，可支持其迅速生長[27]。得益于適宜的生境和杜鵑花類菌根真菌的共生，回歸的廣西越桔成活率達(dá)95.65%。因此，在鳳陽山建立廣西越桔回歸種群是科學(xué)可行的。但廣西越桔生長緩慢，回歸后仍未開花結(jié)實(shí)，可在后代達(dá)到開花年限后采用人工授粉的方式增加坐果率和萌發(fā)率[28]，并進(jìn)一步探究種群能否完成自然更新。此外，廣西越桔果徑大、觀賞性強(qiáng)，隨著種群數(shù)量的擴(kuò)大，可有目的性地進(jìn)行開發(fā)利用，如作為栽培越桔育種的親本，培育更適于南方地區(qū)生產(chǎn)的越桔品種。

4 結(jié)論

本研究通過未成熟種子培養(yǎng)和離體快繁等試管保育技術(shù)獲得了廣西越桔試管實(shí)生苗和再生植株。未成熟種子經(jīng)發(fā)育培養(yǎng)后萌發(fā)，獲得試管實(shí)生苗。以試管實(shí)生苗為外植體，在WPM培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-1ZT 和0.5 mg·L-1NAA可達(dá)到最高增殖系數(shù)并促進(jìn)再生芽的生長；在添加0.1 mg·L-1IBA后達(dá)到最高生根率。經(jīng)煉苗后將種群回歸，植株長勢(shì)良好、株幅顯著增加。SRAP分析表明原生株與后代群體具有一定的遺傳多樣性。