陳銘中 ，秦小明，鐘旭美，林海生

1廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，湛江 524088；2陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系； 3陽江市功能性食品研發(fā)與質(zhì)量評價重點實驗室，陽江 529566

香蕉(Musaspp.)是世界上第四大消費水果，在中國水果產(chǎn)量位居第五，其中廣東、廣西和海南等地是主要產(chǎn)區(qū)[1]。香蕉營養(yǎng)豐富，含多種人體所需的微量元素，其收獲后不耐貯藏，容易腐爛變質(zhì)，而揮發(fā)性組分是評價香蕉等果蔬的新鮮程度的重要品質(zhì)指標(biāo)。固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)具有無污染、成本低、操作簡單方便等優(yōu)點[2]，是目前樣品中揮發(fā)性組分測定的一種常用的前處理技術(shù)。SPME與GC-MS聯(lián)合測定樣品的揮發(fā)性組分是廣泛應(yīng)用的一種模式，要得到研究樣品的揮發(fā)性組分并準(zhǔn)確地鑒定混合物的化學(xué)成分，其關(guān)鍵的技術(shù)包括合適的萃取頭、萃取條件、獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量、豐富的質(zhì)譜庫和良好的定性鑒定參數(shù)。目前關(guān)于香蕉揮發(fā)性組分的報道較多，Tao等[3]應(yīng)用PDMS萃取頭分析鑒定出成熟香蕉的揮發(fā)性組分39個；Zhu等[4]采用SPME-GC-MS對不同成熟階段香蕉的揮發(fā)性組分進(jìn)行了鑒定分析，確定了黃熟階段香蕉的揮發(fā)性組分主要有41個；Shen等[5]以SPME-GC-MS分析成熟與未成熟香蕉中的揮發(fā)性組分，比較了二者的化學(xué)成分差異，鑒定出成熟香蕉有30個揮發(fā)性組分。近年來根據(jù)報道，應(yīng)用合適劑量的短波紫外線(short-wave ultraviolet，UV-C)用于水果和蔬菜的保鮮，能夠增強果蔬的防御系統(tǒng)，減少外界因素的傷害，提高果蔬的品質(zhì)和延長其貯藏時間[6]。盡管已有采用SPME-GC-MS分析香蕉揮發(fā)性組分的報道，但有關(guān)UV-C處理后貯藏至黃熟期的香蕉揮發(fā)性組分差異的研究尚未見報道。

本研究將在正交試驗設(shè)計優(yōu)化組合得到尋找SPME萃取的最優(yōu)參數(shù)基礎(chǔ)上，采用MS-DIAL軟件減少重疊峰、背景信號的干擾，鑒定出香蕉的揮發(fā)性組分，進(jìn)而通過數(shù)理統(tǒng)計分析手段比較UV-C處理后香蕉的揮發(fā)性組分差異，評價UV-C處理采后香蕉的貯藏對其香氣的影響效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗以成熟香蕉果肉為實驗材料。氯化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；分析純 2-辛醇(上海源葉生物科技有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)品正構(gòu)烷烴混標(biāo)(C7～C40，1 000 μg/mL；GC≥99.5%)(上海安譜實驗科技股份有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2020型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS；日本島津儀器有限公司)；島津 SH-Rxi-5Sil MS 氣相色譜柱；50/30 μm DVB/CAR/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR /PDMS萃取頭，SPME手動進(jìn)樣器(美國Supelco公司)；SPME專用襯管(島津(上海)有限公司)；90-2A磁力加熱攪拌器(天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠)；SHT -060SD超聲波清洗機(深圳市深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司)；FA224電子天平(上海舜宇恒平科技儀器有限公司)；A11分析研磨機(德國IKA公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPME萃取頭的選擇[7]

準(zhǔn)確稱取4份2.0 g經(jīng)均勻研磨的香蕉果肉，分別置于20 mL 的頂空瓶中，加入飽和氯化鈉溶液5 mL，蓋上頂空瓶蓋，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，在40.0 ℃、800 rpm轉(zhuǎn)速磁力攪拌器上攪拌5 min。均勻后，在超聲波清洗機中超聲平衡20 min，在40.0 ℃水浴，用4種老化后不同的萃取頭DVB/CAR/PDMS、PDMS、PDMS/DVB、CAR/PDMS分別插入頂空瓶中萃取40 min。萃取結(jié)束后，注入GC儀解析3 min，進(jìn)行GC-MS分析。根據(jù)總峰面積結(jié)合鑒定峰數(shù)目，分析不同萃取頭的影響。

1.3.2 SPME萃取前超聲平衡時間的影響[8]

準(zhǔn)確稱取5份2.0 g經(jīng)均勻研磨的香蕉果肉，分別置于20 mL的頂空瓶中，加入飽和氯化鈉溶液5 mL，蓋上頂空瓶蓋，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，在40.0 ℃、800 rpm攪拌器攪拌5 min。均勻后，分別在超聲波清洗機中超聲平衡10、15、20、25、30 min，用“2.1”項優(yōu)選的萃取頭插入頂空瓶中萃取40 min。萃取結(jié)束后，注入氣相色譜儀解析3 min，進(jìn)行GC-MS分析。根據(jù)總峰面積結(jié)合總峰數(shù)目，分析超聲平衡時間的影響。

1.3.3 SPME萃取樣品量的影響[9]

準(zhǔn)確稱取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g經(jīng)均勻研磨的香蕉果肉，分別置于20 mL的頂空瓶中，加入飽和氯化鈉溶液5 mL，蓋上頂空瓶蓋，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，40.0 ℃，轉(zhuǎn)速為800 rpm磁力攪拌器上攪拌5 min，均勻后，分別于在超聲波清洗機中超聲平衡20 min，用“2.1”項優(yōu)選的萃取頭插入頂空瓶，40.0 ℃水浴萃取40 min。萃取結(jié)束后，注入氣相色譜儀解析3 min，進(jìn)行GC-MS分析。根據(jù)總峰面積結(jié)合總峰數(shù)目，分析樣品加入量的影響。

1.3.4 SPME萃取溫度的影響

準(zhǔn)確稱取5份2.0 g經(jīng)均勻研磨的香蕉果肉，分別置于20 mL的頂空瓶中，加入飽和氯化鈉溶液5 mL，蓋上頂空瓶蓋，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，40.0 ℃，轉(zhuǎn)速為800 rpm磁力攪拌器上攪拌5 min，均勻后，在超聲波清洗機中超聲平衡20 min，用“2.1”項優(yōu)選的萃取頭插入頂空瓶，分別于30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 ℃水浴萃取40 min。萃取結(jié)束后，注入GC-MS聯(lián)用儀解析3 min，進(jìn)行GC-MS分析。根據(jù)總峰面積結(jié)合總峰數(shù)目，分析萃取溫度的影響。

1.3.5 GC-MS條件

參考Dou等[10]的實驗條件，并稍做修改。

色譜條件：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱，載氣為氦氣，其他色譜條件進(jìn)行比較篩選后確定。程序升溫，初始溫度40 ℃，保持1 min；以2 ℃/min的速率升至60 ℃；保持2 min；再以5 ℃/min的速率升至150 ℃，保持2 min；以10 ℃/min的速率升至180 ℃，保持1 min；載氣為高純氦(He)，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為220 ℃，不分流。

質(zhì)譜條件：EI電離源；電子能量70 eV，電壓350 V，掃描范圍m/z35～400。

1.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定SPME萃取的超聲時間、樣品量和溫度3個水平(見表1)，選用L9(34)正交表進(jìn)行超聲時間、樣品量和萃取溫度三個參數(shù)優(yōu)化組合，以總峰面積為評價指標(biāo)進(jìn)行分析，由正交試驗的結(jié)果得到的組合進(jìn)行驗證試驗。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 UV-C處理組和對照組香蕉的揮發(fā)性組分定性和定量分析

1.5.1 香蕉樣品

綠熟香蕉采摘于廣東省陽春市果園，八成熟，挑選大小一致、無病害、無損傷的香蕉，當(dāng)天運回實驗室，把香蕉去柄分開，用自來水緩慢清洗香蕉果實表面物理雜質(zhì)，再用蒸餾水潤洗三遍，風(fēng)扇晾干，隨機分為對照組和UV-C處理組。根據(jù)前期實驗，確定UV-C處理組照射劑量為0.02 kJ/m2劑量。先將UV-C燈(飛利浦，20 W)打開，待能量穩(wěn)定后，用0.02 kJ/m2劑量的紫外線照射香蕉，對照組不照射。對照組和處理組香蕉放置于恒溫恒濕箱(溫度25 ℃、濕度85%)中避光貯藏，在第18天采對照組和處理組樣品，將香蕉果肉快速切碎，用液氮預(yù)冷后研磨成勻漿，用于GC-MS測定。

1.5.2 Kováts保留指數(shù)(RI)測定

取稀釋濃度至100 μg/L的正構(gòu)烷烴C7～C40混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 μL，按“1.3.5”的GC-MS條件測定，在AMDIS軟件建立本實驗的保留指數(shù)校正庫(RIcal)，采用Kováts程序升溫公式[11]計算揮發(fā)物的實際保留指數(shù)值(RIact)，RIact計算公式如式(1)。

(1)

式中，RIact為本實驗條件下的實際保留指數(shù)值，n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)，tR(x)為待鑒定的揮發(fā)性組分的保留時間，tR(n)、tR(n+1)分別為最鄰近揮發(fā)性組分x的正構(gòu)烷烴的保留時間，tR(n)位于組分x的左側(cè)，tR(n+1)位于組分x的右側(cè)。

1.5.3 定性和定量分析

應(yīng)用正交試驗優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行香蕉揮發(fā)性組分的HS-SPME萃取和GC-MS測定，將原始數(shù)據(jù)在島津GC-MS工作站中轉(zhuǎn)為CDF格式，導(dǎo)入MS-DIAL ver 4.48軟件進(jìn)行色譜峰解卷積、匹配、對齊等處理[12]后，得到MSP文件，導(dǎo)入NIST 17質(zhì)譜庫進(jìn)行組分搜索與鑒定，鑒定選取的參數(shù)是未知組分在NIST 17質(zhì)譜庫中的正向匹配度(match factor，MF)、反向匹配度(reverse match factor，RMF)均≥800，同時參考未知組分的RIact值與NIST 17質(zhì)譜庫的RI參考值(RIref)最接近原則，確定該組分名稱。將組分信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，根據(jù)P<0.05與差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.2或FC<0.83篩選出對照組和處理組的差異組分，應(yīng)用R言語繪制火山圖。

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)物2-辛醇的濃度為0.99 mg/mL，加標(biāo)體積為5.0 μL，計算公式如式(2)：

(2)

式中：Cx為某揮發(fā)性組分的濃度，Ax為某揮發(fā)性組分的峰面積，Cs為添加到香蕉樣品中的內(nèi)標(biāo)物2-辛醇的濃度，As為內(nèi)標(biāo)物2-辛醇的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME萃取頭的選擇

SPME聯(lián)合GC-MS進(jìn)行揮發(fā)性組分測定能夠有效地分析出食品中的揮發(fā)性組分，是目前最常用和有效的分析方法，而選擇合適的SPME萃取頭是十分關(guān)鍵的步驟[2]。SPME萃取頭的纖維涂層不同，極性和吸附對象也不同，對研究對象的萃取效果會有很大差異。本研究應(yīng)用DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)、PDMS(100 μm)、PDMS/DVB(65 μm)、CAR/PDMS(75 μm)4種不同極性的SPME萃取頭萃取香蕉果肉揮發(fā)性組分，以確定最合適的萃取頭。4種不同的SPME萃取頭萃取香蕉揮發(fā)性組分的GC-MS總離子流圖、總峰面積和鑒定物質(zhì)數(shù)量見圖1，圖1B的鑒定峰數(shù)是根據(jù)各種萃取頭得到的GC-MS圖，在島津GC-MS工作站中設(shè)定匹配相似度≥80%，進(jìn)行定性鑒別篩選出來的目標(biāo)化合物的數(shù)量。由圖1A可知，CAR/PDMS萃取頭得到的離子流信號明顯強于其他3種萃取頭，結(jié)合圖1B，4種萃取頭萃取得到的香蕉揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積順序是CAR/PDMS>DVB/CAR/PDMS>PDMS>PDMS/DVB；鑒定峰數(shù)順序是CAR/PDMS(90個)>PDMS(70個)>DVB/CAR/PDMS(68個)>PDMS/DVB(54個)，CAR/PDMS萃取頭得到的總峰面積大于其他3種的總峰面積之和，同時可良好地鑒定出化合物的數(shù)量(峰數(shù))明顯大于其他3種萃取頭，因此在后續(xù)的SPME操作中，采用CAR/PDMS萃取頭。

圖1 4種不同SPME萃取頭萃取香蕉揮發(fā)性組分的影響Fig.1 Influence of four different SPME extraction heads on banana volatile components extraction注：(A)GC-MS總離子流圖；(B)總峰面積和鑒定峰數(shù)量。Note：(A)GC-MS total ion chromatograms;(B)Total peak area and number of identified peaks.

2.2 SPME萃取前的超聲時間影響

研磨后的香蕉果肉在加入飽和氯化鈉溶液后，具有較大的粘稠性，不利于揮發(fā)性組分的逸出，在SPME萃取前采用一定時間的超聲處理，利用超聲波震蕩產(chǎn)生的強烈空化效應(yīng)、熱效應(yīng)等可以提高分子運動速度，加快傳質(zhì)過程，使揮發(fā)性組分快速逸出至頂空瓶液面上空達(dá)到平衡，有利于后續(xù)SPME萃取[13]。SPME萃取前的超聲波震蕩平衡的影響見圖2，由圖2可知，隨著超聲平衡時間增大，總峰面積也增大，在超聲平衡時間達(dá)到20 min時，總峰面積達(dá)到最大，再增加超聲時間，總峰面積反而下降，可能是超聲時間過長，導(dǎo)致溫度過高，造成揮發(fā)性組分分解和重新溶于溶液中；離子流圖的總峰數(shù)也是隨超聲時間增加而增長，在25 min時達(dá)到最大值。綜合總峰面積和總峰數(shù)情況，本試驗采用超聲時間為15、20、25 min進(jìn)行正交試驗。

圖2 超聲時間對SPME萃取香蕉揮發(fā)性組分的總峰面積和總峰數(shù)的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on total peak area and peak number of volatile compounds extracted from banana by SPME

2.3 樣品量

樣品量對SPME萃取香蕉揮發(fā)性組分的總峰面積和總峰數(shù)的影響如圖3所示，總峰面積從2.0 g到3.0 g是增加的過程，且3.0 g的總峰面積為最大，從4.0 g到6.0 g，總峰面積呈下降趨勢，主要是因為剛開始隨著樣品用量的增加，逸出的揮發(fā)性組分富集在頂空瓶內(nèi)液面上部的濃度增加，萃取頭富集的揮發(fā)性組分的量也增加，但隨著樣品量的增加，樣品溶液明顯粘稠，特別是樣品量增加到6.0 g時，磁力攪拌均勻變得相當(dāng)困難，不能再增加樣品用量，粘稠的樣品溶液不利于揮發(fā)性組分的逸出，因此萃取頭能夠富集的揮發(fā)性組分總量下降，總峰面積相應(yīng)變??；總峰數(shù)也有總峰面積類似的變化趨勢，在樣品量為4.0 g時，離子流圖的總峰數(shù)最大。綜合總峰面積和總峰數(shù)情況，本試驗采用樣品量為2.0、3.0、4.0 g進(jìn)行正交試驗。

圖3 樣品量對SPME萃取香蕉揮發(fā)性組分的總峰面積和總峰數(shù)的影響Fig.3 Effect of sample weight on total peak area and peak number of volatile compounds extracted from banana by SPME

2.4 萃取溫度

溫度對HS-SPME萃取效果影響較大，一般來說提高溫度可以加快揮發(fā)性組分逸出至頂空瓶上部空間，增加液面以上空間的揮發(fā)性組分濃度，縮短平衡時間，可提高萃取效率，但增加至一定溫度后，過高溫度反而影響揮發(fā)性組分在氣相和萃取涂層的分配比例，降低萃取頭的揮發(fā)性組分吸附量。萃取溫度對HS-SPME的影響見圖4。由圖4可知，隨著SPME的萃取溫度升高，總峰面積逐漸增大，當(dāng)萃取溫度為50 ℃時，總峰面積達(dá)到最大值，溫度繼續(xù)升高，總峰面積反而下降。而相應(yīng)的總峰數(shù)在40 ℃時最大，溫度繼續(xù)升高，總峰數(shù)也下降了。可能是溫度過高引起化合物發(fā)生分解或化學(xué)變化，造成化合物的分配和種類發(fā)生變化，進(jìn)而影響萃取頭的萃取效果。綜合總峰面積和總峰數(shù)情況，本試驗采用萃取溫度為40、50、60 ℃進(jìn)行正交試驗。

圖4 萃取溫度對SPME萃取香蕉揮發(fā)性組分的總峰面積和總峰數(shù)的影響Fig.4 Effect of extracting temperature on total peak area and peak number of volatile compounds extracted from banana by SPME

2.5 正交試驗分析

SPME以超聲時間、樣品量、萃取溫度為因素變量，總峰面積為評價指標(biāo)的正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果(見表2)。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果表Table 2 design and result of orthogonal experiment

由表2可知，SPME各因素對總峰面積的影響依次表現(xiàn)為：超聲時間>萃取溫度>樣品量，SPME最佳工藝條件：A2B3C2，即正交試驗得出SPME條件為：超聲時間為20 min，樣品量為4.0 g，萃取溫度為50 ℃。根據(jù)正交試驗結(jié)果的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果為總峰面積2.992×107(n=3)。

2.6 兩組香蕉揮發(fā)性組分的定性和定量分析

2.6.1 香蕉樣品情況

采用UV-C合適的照射劑量照射后的處理組(UV-C組)與無照射的對照組(CK組)在25 ℃貯藏18天后采樣，兩組香蕉的外觀情況見圖5。由圖5可知，UV-C處理組香蕉色澤青黃、飽滿、有光澤，個別香蕉果實出現(xiàn)很少黑點，剛好處于成熟期，而對照組香蕉色澤淡黃，已經(jīng)出現(xiàn)大量黑點，同時部分香蕉果實開始有腐爛斑塊，處于過成熟狀態(tài)，兩組香蕉的外觀狀態(tài)存在明顯差異，UV-C處理后延長了香蕉的貯藏時間。

圖5 UV-C組和對照組香蕉常溫貯藏18天后香蕉果實的外觀狀況Fig.5 Appearance of banana fruits in UV-C group and CK group stored at 25 ℃ for 18 days

2.6.2 兩組香蕉揮發(fā)組分的OPLS-DA分析

揮發(fā)性組分變化不僅是判斷果實采后貯藏及貨架壽命的一個重要指標(biāo)，還是評價果實品質(zhì)的一個重要依據(jù)。圖6為UV-C香蕉樣品與CK香蕉樣品的GC-MS總離子流圖，將原始數(shù)據(jù)在MS-DIAL軟件進(jìn)行預(yù)處理后，導(dǎo)入NIST 17質(zhì)譜庫進(jìn)行組分鑒定。從本研究的UV-C組和CK組香蕉揮發(fā)性組分共鑒定出169個組分，將169個組分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行OPLS-DA分析(見圖7)。由圖7A可見OPLS-DA很好地區(qū)分兩組間的差異，說明經(jīng)UV-C處理后兩組香蕉之間的代謝途徑發(fā)生變化，相應(yīng)的揮發(fā)性代謝組分有差異。OPLS-DA模型的R2X=0.464、R2Y=0.999、Q2=0.992、R2Y和Q2均>0.99，說明建立的模型穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。OPLS-DA模型200次迭代驗證結(jié)果見圖7B。其中截距R2=(0.0，0.647)，截距Q2=(0.0，-0.854)，圖中所有左邊的Q2值都比右邊的原始點低，且Q2回歸直線的截距<0，可知OPLS-DA模型沒有過度擬合，說明此模型的建立是有效的，可用于本研究的差異代謝揮發(fā)性組分的篩選[14]。

圖6 UV-C與CK香蕉樣品的GC-MS總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatograms of UV-C and CK banana samples

2.6.3 兩組香蕉揮發(fā)組分的顯著差異組分

根據(jù)上述建立的OPLS-DA模型，得到了兩組香蕉169個揮發(fā)性組分的FC值和T檢驗(Student’s t-test)的P值(P-value)，采用P<0.05與FC>1.2或FC<0.83篩選差異代謝揮發(fā)性組分[15]，共篩選出38個香蕉顯著差異的揮發(fā)性代謝組分，圖8為篩選結(jié)果的火山圖(Volcano plot)，圖中綠色的點和數(shù)字代表顯著下調(diào)的組分，紅色的點和數(shù)字代表顯著上調(diào)的組分。38個顯著差異組分占169個鑒定組分含量的8.72%，其中含量顯著下調(diào)的有34個組分，顯著上調(diào)的組分有4個，具體組分見篩選結(jié)果(見表3)。

表3 UV-C組和CK組香蕉中的差異代謝揮發(fā)性組分Table 3 The difference of volatile components in banana metabolism between UV-C group and CK group

圖8 UV-C組和CK組香蕉差異代謝揮發(fā)性組分的火山圖Fig.8 Volcanic map of the difference in volatile components metabolism between UV-C group and CK group

3 討論

3.1 香蕉揮發(fā)性組分的鑒定

由于SPME聯(lián)合GC-MS具有環(huán)境友好、使用簡易和受樣品基質(zhì)干擾低而被廣泛應(yīng)用于果蔬等的揮發(fā)性組分(或香氣成分)的研究，其用于香蕉的揮發(fā)性組分分析的研究早有報道，主要集中于討論選擇合適的SPME萃取頭、不同時期的香蕉揮發(fā)性組分的鑒定。選擇合適的SPME纖維頭對于香蕉揮發(fā)性組分的測定和后續(xù)的組分鑒定是十分重要的，可以更有效地富集揮發(fā)性組分和得到更準(zhǔn)確的定性和定量結(jié)果。Liang等[16]應(yīng)用DVB/CAR/PDMS萃取頭，分析“桂蕉1號”香蕉的綠熟期、黃熟和過熟期的揮發(fā)性成分，共鑒定出44個揮發(fā)性成分。Dou等[10]應(yīng)用DVB/CAR/PDMS萃取頭，分析不同季節(jié)黃熟期“巴西”香蕉和“廣粉1號”粉蕉的揮發(fā)性組分，共鑒定出63個揮發(fā)性組分，不同季節(jié)的組分含量有差異，其中3月份的樣品的揮發(fā)性組分含量更高。Li等[17]用DVB/CAR/PDMS萃取頭，探討了整個采后貯藏后熟過程黃熟期的“巴西”香蕉和“廣粉1號”粉蕉的揮發(fā)性組分，分別共檢測到45個和27個揮發(fā)性組分，其中“巴西”香蕉在黃熟期的揮發(fā)性組分主要是酯類和醛類。

續(xù)表3(Continueed Tab.3)

上述關(guān)于香蕉揮發(fā)性組分的研究報道，在SPME萃取頭使用種類上多應(yīng)用DVB/CAR /PDMS萃取頭，在組分定性鑒別上主要根據(jù)工作站配套的NIST質(zhì)譜庫進(jìn)行相似度檢索，原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)存在信息干擾、重峰等鑒定的不足，因此其鑒定出來的組分?jǐn)?shù)量較少，一般少于50個，而香蕉果實中已鑒定的揮發(fā)性組分有250多個[18]，因此如何選擇和優(yōu)化實驗條件，應(yīng)用圖譜預(yù)處理軟件(如AMDIS或MS-DIAL等)對測得的原始質(zhì)譜圖進(jìn)行“減少重疊峰、背景信號的干擾等”處理，得到“純化”的質(zhì)譜圖，增加與目標(biāo)質(zhì)譜庫的匹配程度，提高鑒定組分能力和數(shù)量，是十分必要的。MS-DIAL軟件能夠?qū)C-MS總離子流圖(TIC)解卷積，消除干擾峰和重疊峰，得到相對純凈的質(zhì)譜圖，提高待鑒定組分與質(zhì)譜庫組分的匹配度，使未知組分鑒定的結(jié)果更準(zhǔn)確和可靠[12]。本研究在綜合前人報道的基礎(chǔ)上，比較了DVB/CAR/PDMS、PDMS、PDMS/DVB、CAR/PDMS四種萃取頭聯(lián)合GC-MS測定成熟期香蕉揮發(fā)性組分，根據(jù)豐度大小和鑒定出組分?jǐn)?shù)量篩選出CAR/PDMS萃取頭用于本研究后續(xù)SPME條件優(yōu)化和兩組香蕉揮發(fā)性差異組分比較。為了使質(zhì)譜鑒定結(jié)果更加可靠，先用MS-DIAL軟件對原始質(zhì)譜圖進(jìn)行圖譜預(yù)處理，然后導(dǎo)入NIST 17質(zhì)譜庫中進(jìn)行鑒定，由檢索的正向匹配度(MF)、反向匹配度(RMF)均≥800和正構(gòu)烷烴得到的Kováts保留指數(shù)(RI)相結(jié)合，鑒定出兩組香蕉的揮發(fā)性組分共169個。

3.2 UV-C處理后的香蕉揮發(fā)性組分的變化

UV-C應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品、食品的保鮮，主要集中在提高果蔬的抗氧化性、抗菌性和生物活性成分的變化等研究，對于UV-C處理后貯藏的果蔬等的揮發(fā)性組分(或香氣成分)變化研究較少。S?beli等[19]使用合適UV-C劑量降低牛腰肉排中微生物數(shù)量，延長保存時間，發(fā)現(xiàn)牛排的有些揮發(fā)性組分含量增加了，主要是己醛和2-庚醛等。Severo等在2015年報道對草莓進(jìn)行采后UV-C處理，表明UV-C能夠通過基因激活誘導(dǎo)草莓的相關(guān)酶類，增加草莓的生物活性和酯揮發(fā)性化合物含量，導(dǎo)致果實更結(jié)實，生物活性分子水平更高，以及更強的香氣。Severo等[20]在2017年報道UV-C輻射采前草莓，影響草莓代謝物含量和揮發(fā)性有機化合物產(chǎn)量，UV-C處理增加了總揮發(fā)性有機物的產(chǎn)量，主要是總揮發(fā)性酯，但減少了草莓特征香氣物質(zhì)呋喃和間甲基呋喃的產(chǎn)量。

本研究應(yīng)用前期實驗得到合適的香蕉保鮮UV-C劑量處理香蕉后，對對照組和UV-C組的揮發(fā)性組分的差異進(jìn)行了深入探討。香蕉果實各揮發(fā)性組分的相對含量通過內(nèi)標(biāo)法(2-辛醇為內(nèi)標(biāo))計算得到，169個組分主要由酯、醛、酮、醇和其他類物質(zhì)組成，其中酯類有58個(占CK組和UV-C組含量分別為75.98%±0.39%、76.61%±0.25%)、醛類有34個(占CK組和UV-C組含量分別為8.09%±0.08%、8.29%±0.05%)、酮類有27個(占CK組和UV-C組含量分別為7.72%±0.11%、6.78%±0.07%)、醇類有17個(占CK組和UV-C組含量分別為2.46%±0.07%、2.36%±0.04%)、其他類有33個(占CK組和UV-C組含量分別為5.75%±0.09%、5.49%±0.06%)，酯類是成熟香蕉果肉主要的揮發(fā)性組分[3-5]。圖9為兩組香蕉的揮發(fā)性組分中相對含量較高的前10個組分，可見兩組香蕉的前10個組分的種類是相同的，分別是乙酸異戊酯、丁酸異戊酯、1-甲基乙酸丁酯、異戊酸異戊酯、乙酸-2-庚酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、3-甲基-2-丁酮、乙酸乙酯、乙酸己酯，除了第2組分(丁酸異戊酯)、第9組分(乙酸乙酯)含量有顯著性差異，其他8個組分無顯著性差異。這些相對高含量的酯類構(gòu)成了香蕉果實的特征香氣，同時是香蕉揮發(fā)性組分中的主要類別，與Wendakoon[21]和Boudhrioua[22]的研究一致。通過對兩組香蕉的169個組分展開OPLS-DA建模分析，篩選差異代謝組分，由表3和圖8可知，經(jīng)UV-C處理后，處理組和對照組香蕉有38個差異代謝揮發(fā)性組分，含量下調(diào)的有34個，含量上調(diào)的有4個(分別是己醛、正己醇、2-乙基己醇、丁酸2-戊酯)。Zhu等[23]研究低溫貯藏對香蕉果實揮發(fā)性物質(zhì)的影響，結(jié)果表明低溫抑制了揮發(fā)物的生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因MaHPL、MaLOX和MaAAT的表達(dá)來減少在貯藏期內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生?？赡鼙緦嶒炦x擇的合適劑量的UV-C處理香蕉在一定程度上抑制了MaHPL、MaLOX和MaAAT 3種基因的部分表達(dá)，起到類似低溫貯藏的作用，但同時引起了香蕉的抗逆性，激活誘導(dǎo)了苯丙氨酸解氨酶等酶類的活性[24]，因此沒有表現(xiàn)出完全統(tǒng)一的揮發(fā)性組分含量的增加或下降。UV-C處理后香蕉的揮發(fā)性組分有部分的含量顯著降低了，也有部分的含量下降了，但因為香蕉的香氣來源主要是酯類組分，乙酸異戊酯、丁酸異戊酯這兩個組分是揮發(fā)性組分含量較高的前2個，同時也是香蕉的主要特征香氣成分，對比處理前后這兩個組分含量均提高了，乙酸異戊酯含量提高不顯著(P>0.05)，而丁酸異戊酯含量提高顯著(P<0.05，差異倍數(shù)FC=1.19)，同時UV-C組總酯含量略高于對照組，因此總體而言，UV-C處理后的香蕉氣味會略有增強。

圖9 UV-C組和CK組香蕉前10個揮發(fā)性組分相對含量Fig.9 Relative contents of the first 10 volatile components of banana in UV-C group and CK group注：組分1～10分別代表乙酸異戊酯、丁酸異戊酯、1-甲基乙酸丁酯、異戊酸異戊酯、乙酸-2-庚酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、3-甲基-2-丁酮、乙酸乙酯、乙酸己酯。Note：Components 1-10 represent isoamyl acetate,isoamyl butyrate,2-pentylacetate,isopentyl isopentanoate,2-heptyl acetate,isobutyl acetate,butyl acetate,3-methyl-2-butanone,ethyl acetate,hexyl acetate,respectively.

4 結(jié)論

本文優(yōu)選CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行SPME操作，應(yīng)用正交試驗設(shè)計對SPME的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化組合，得到香蕉揮發(fā)性組分測定的SPME萃取優(yōu)化條件為：超聲時間為20 min、樣品量為4.0 g、萃取溫度為50 ℃。在此基礎(chǔ)上，通過測定經(jīng)UV-C處理后具有保鮮效果的處理組香蕉和對照組香蕉的揮發(fā)性組分，實驗結(jié)果表明兩組香蕉的代謝途徑發(fā)生了變化，共有38個差異代謝揮發(fā)性組分、34個差異代謝揮發(fā)組分的相對含量下調(diào)了，4個差異代謝揮發(fā)性組分相對含量上調(diào)了，經(jīng)UV-C處理后貯藏的香蕉總酯含量、主要特征香氣成分乙酸異戊酯和丁酸異戊酯均高于對照組香蕉，而酯類是成熟香蕉果肉主要的揮發(fā)性組分和香氣組成，因此應(yīng)用UV-C處理香蕉進(jìn)行保鮮貯藏，不僅不會造成香蕉的香氣成分下降，反而有利于香蕉香氣的產(chǎn)生，本研究結(jié)果可為SPME-GC-MS測定農(nóng)產(chǎn)品等食品中揮發(fā)性組分提供定性參考和UV-C處理保鮮水果后的香氣變化提供借鑒。目前對于香蕉等果實香氣成分的物質(zhì)代謝途徑、果實貯藏和加工過程揮發(fā)性成分變化、相應(yīng)基因和酶的生理功能的機理等方面的研究還不完善，對于本研究中的UV-C處理后導(dǎo)致香蕉相關(guān)揮發(fā)性組分的上調(diào)或下調(diào)的相關(guān)基因和酶類變化的機理還有待進(jìn)一步探索。