羅哌卡因抑制人肝癌細(xì)胞系Hep3B增殖、遷移和侵襲

孫全鵬，樊 超，展德璽，范怡明，孫偉峰

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 麻醉科, 河南 鄭州 450044；2.鄭州市骨科醫(yī)院 麻醉科, 河南 鄭州 450044；3.鄲城縣人民醫(yī)院 麻醉科, 河南 周口 477150)

外科手術(shù)是肝癌和其他實體腫瘤的主要治療手段[1]。然而，手術(shù)切除本身可能導(dǎo)致癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)促進(jìn)腫瘤擴散，同時圍手術(shù)期全麻藥和阿片類藥物的使用可抑制機體免疫應(yīng)答，促進(jìn)癌細(xì)胞的擴散和轉(zhuǎn)移[2]?；仡櫺苑治霰砻?，局部麻醉可降低癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，提高患者生存率[3]。羅哌卡因(ropivacaine)是一種新型酰胺類局麻藥，其通過阻斷神經(jīng)興奮與傳導(dǎo)，具有廣泛的鎮(zhèn)痛和治療功能。最近研究表明，羅哌卡因可抑制肝癌細(xì)胞活力和遷移能力，破壞線粒體功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。然而，其抗腫瘤作用機制并未完全闡明。長基因間非編碼RNA 00853(long intergene non-coding RNA 00853，LINC00853)是一種新型RNA轉(zhuǎn)錄本，肝癌組織中LINC00853表達(dá)增加，且血清和細(xì)胞外囊泡衍生的LINC00853是肝癌潛在的新型診斷標(biāo)志物[5]。然而，LINC00853在肝癌進(jìn)展中的作用鮮有研究。本研究以LINC00853為切入點，從細(xì)胞增殖、遷移侵襲角度探討羅哌卡因在肝癌中的抗腫瘤作用，為羅哌卡因在肝癌患者圍手術(shù)期麻醉中的應(yīng)用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸羅哌卡因注射液(AstraZeneca AB公司)；人肝癌細(xì)胞系Hep3B(中科院上海細(xì)胞研究所)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)(日本同仁生物公司)；所有序列片段、質(zhì)粒(廣州銳博生物公司)；Transwell小室(美國密理博公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；兔源增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單抗、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)單抗和兔源MMP9單抗、羊抗兔IgG二抗(上海艾博抗生物公司)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組和處理：Hep3B細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖杜爾比格伊戈爾培養(yǎng)基(DMEM)放入含5% CO2、37 ℃、無菌恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)。消化80%匯合的Hep3B細(xì)胞，按照1∶5稀釋轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，每周換液2次。用含0、100、200、400和800 μmol/L羅哌卡因的培養(yǎng)基分別孵育對數(shù)期Hep3B細(xì)胞48 h，確定羅哌卡因使用濃度(400 μmol/L)。將Hep3B細(xì)胞分為對照(不做處理)組、羅哌卡因(400 μmol/L羅哌卡因孵育48 h)組、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-LINC00853組(轉(zhuǎn)染si-LINC00853)、pcDNA-NC組(轉(zhuǎn)染pcDNA-NC)、pcDNA-LINC00853組(轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00853)、(羅哌卡因+pcDNA-NC)組(用含400 μmol/L羅哌卡因的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA-NC的Hep3B細(xì)胞48 h)、(羅哌卡因+ pcDNA-LINC00853)組(用含400 μmol/L羅哌卡因的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00853的Hep3B細(xì)胞48 h)。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：將未轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞接種96孔板，貼壁后用羅哌卡因終濃度為0、100、200、400和800 μmol/L培養(yǎng)基(100 μL/孔)孵育細(xì)胞48 h。將轉(zhuǎn)染si-NC、si-LINC00853、pcDNA-NC或pcDNA-LINC00853的Hep3B細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)48 h。將轉(zhuǎn)染pcDNA-NC或pcDNA-LINC00853的Hep3B細(xì)胞接種96孔板，貼壁后用羅哌卡因終濃度為400 μmol/L培養(yǎng)基(100 μL/孔)孵育48 h。設(shè)置3個復(fù)孔。每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度(A)值。增殖抑制率=(1-A實驗組/A對照組)×100%

1.2.3 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲：每組取200 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為1×104，不含胎牛血清)接種涂有基質(zhì)膠(檢測侵襲)或未涂基質(zhì)膠(檢測遷移)的Transwell小室中；將500 μL培養(yǎng)基(含有20%胎牛血清)加入到24孔板下室作為誘導(dǎo)劑。將Transwell小室至于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，去除Transwell膜上表面的基質(zhì)膠和細(xì)胞，甲醇固定Transwell膜下表面細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下計數(shù)，以5個視野的均值表示侵襲或遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 RT-qPCR檢測LINC00853表達(dá)：按照Trizol試劑盒步驟提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和下述引物說明進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算LINC00853相對表達(dá)量。引物序列如下：LINC00853上游5′-AAAGGCTAGGCGATC CCACA-3′，下游5′-ACTCCCTAGCTTGGCTCTCCT-3′；β-actin上游5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTA CGA-3′，下游5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAAT GG-3′。

1.2.5 Western bolt檢測PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)：用RIPA緩沖液裂解各組細(xì)胞。每泳道40 μg蛋白樣品，行SDS-PAGE，并在恒定電流下轉(zhuǎn)膜。封閉膜后，加入兔源PCNA、MMP2和MMP9抗體(均為1∶2 000稀釋)4 ℃孵育12 h。用二抗(1∶2 500 稀釋)室溫下孵育膜2 h。增強型化學(xué)發(fā)光試劑暗室顯影，Image J軟件分析PCNA、MMP2和MMP9蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞增殖的影響

相較于對照組，羅哌卡因處理后Hep3B細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，PCNA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性(圖1，表1)。選擇增殖抑制率約為50%的羅哌卡因濃度(400 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 Western blot檢測PCNA蛋白的表達(dá)

表1 羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞增殖和PCNA蛋白表達(dá)的影響

2.2 羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞遷移和侵襲以及蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，羅哌卡因組Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖2，表2)。

A.cell migration and invasion were detected by Transwell assay(×200); B.MMP2 and MMP9 protein expressions were detected by Western blot

表2 羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞遷移和侵襲以及蛋白表達(dá)的影響

2.3 羅哌卡因?qū)INC00853表達(dá)的影響

與對照組比較，羅哌卡因組Hep3B細(xì)胞LINC00853表達(dá)為0.35±0.03顯著低于對照組的1.00±0.11(P<0.05)。

2.4 LINC00853對Hep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達(dá)的影響

與si-NC組比較，si-LINC00853組Hep3B細(xì)胞LINC00853表達(dá)水平以及PCNA、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-LINC00853組Hep3B細(xì)胞LINC00853表達(dá)水平、以及PCNA、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)顯著升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加，增殖抑制率顯著降低(P<0.05)(圖3，表3)。

表3 LINC00853對Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖3 Western blot檢測PCNA、MMP2和MMP9蛋白在Hep3細(xì)胞中的表達(dá)

2.5 LINC00853高表達(dá)可以降低羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達(dá)的影響

與(羅哌卡因+pcDNA-NC)組比較，(羅哌卡因+pcDNA-LINC00853)組Hep3B細(xì)胞LINC00853表達(dá)水平顯著升高，增殖抑制率顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(表4，圖4)。

表4 LINC00853高表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達(dá)的影響

圖4 Western blot檢測PCNA、MMP2和MMP9蛋白在Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

羅哌卡因通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲、耐藥在多種人腫瘤中具有抗腫瘤作用。臨床相關(guān)濃度羅哌卡因通過抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)磷酸化可降低胃癌細(xì)胞HGC-27的增殖和遷移能力，但對細(xì)胞侵襲影響的大小無統(tǒng)計學(xué)意義[6]。羅哌卡因以劑量依賴性方式抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的遷移和侵襲，加速細(xì)胞凋亡[7]。此外，羅哌卡因還可增強5-氟嘧啶和紫杉醇對食管癌細(xì)胞的抗增殖和促凋亡作用[8]。本研究表明羅哌卡因以劑量依賴方式抑制肝癌細(xì)胞Hep3B增殖能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，約50%增殖抑制率時羅哌卡因濃度還可顯著降低Hep3B細(xì)胞的遷移和侵襲能力。PCNA是一種細(xì)胞核非組蛋白，其參與DNA合成、復(fù)制和修復(fù)，是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志，下調(diào)PCNA表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的增殖能力[9]。MMP2和MMP9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。本研究中，羅哌卡因明顯下調(diào)PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，這進(jìn)一步說明羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞具有增殖、遷移和侵襲抑制作用，與報道[4]一致。

LncRNA通常定義為長于200個核苷酸且缺乏蛋白編碼功能的RNA分子，其通過影響表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝、遷移和侵襲等多種細(xì)胞生物學(xué)過程[11]。利多卡因通過上調(diào)lncRNA人母系表達(dá)基因3(maternal expression gene 3，MEG3)表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因處理后Hep3B細(xì)胞中LINC00853表達(dá)水平顯著降低，提示羅哌卡因的抗腫瘤作用與調(diào)控LINC00853表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，下調(diào)LINC00853表達(dá)可顯著降低Hep3B細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，下調(diào)PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平，而上調(diào)LINC00853具有相反作用，提示LINC00853在肝癌中具有致癌作用。此外，上調(diào)LINC00853表達(dá)還可部分減弱羅哌卡因?qū)ep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，這提示下調(diào)LINC00853表達(dá)可能是羅哌卡因在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制。然而，是否存在其他lncRNA介導(dǎo)羅哌卡因的抗肝癌作用仍有待研究。

總之，本研究證實羅哌卡因可抑制肝癌細(xì)胞Hep3B的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與下調(diào)LINC00853表達(dá)有關(guān)，這豐富了羅哌卡因的抗腫瘤作用機制，為羅哌卡因在肝癌患者圍手術(shù)期麻醉中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。