帕內(nèi)特細胞相關(guān)的克羅恩病易感基因在克羅恩病發(fā)生中的作用

愛麗斯,于巖波

愛麗斯,山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(第一臨床學(xué)院) 山東省濟南市 250012

于巖波,山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 山東省濟南市 250012

0 引言

克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是一種以典型的節(jié)段性和透壁性潰瘍?yōu)樘卣餍员憩F(xiàn)的、慢性炎癥性消化道疾病,和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)同屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)[1].自1900年以來,CD在新興工業(yè)化國家的發(fā)病率不斷上升,并給患者和社會帶來負擔[2],因此需要我們更深入的探究CD可能的發(fā)病機制,從而再認識疾病的預(yù)防及潛在的治療新靶點.CD的病因尚不完全清楚,目前普遍認為它是由遺傳易感性、環(huán)境因素和腸道菌群相互作用導(dǎo)致異常的黏膜免疫反應(yīng)和上皮屏障功能受損[3].研究表明[4],腸上皮屏障有助于維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài),腸道免疫系統(tǒng)可以對共生菌群及食物抗原產(chǎn)生免疫耐受,而對腸道病原體產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答,兩者在正常情況下保持平衡.然而由于腸黏膜穩(wěn)態(tài)遭到破壞,引起腸黏膜對共生非致病性細菌的異常免疫反應(yīng),導(dǎo)致CD患者腸道防御能力減弱,繼而在其他因素的共同作用下引發(fā)了慢性炎癥反應(yīng)[5,6].

帕內(nèi)特細胞(Paneth cell,PC)是一種在隱窩內(nèi)自干細胞分化的小腸特化的上皮細胞[7],有助于維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)[8],它通過表達表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α等多種信號分子,使位于小腸隱窩底部的G蛋白偶聯(lián)受體5干細胞完成小腸隱窩的不斷更新[9,10].PC可以分泌包括抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)在內(nèi)的多種抗菌蛋白.防御素是AMPs重要的蛋白質(zhì)家族之一[11,12],PC主要表達兩種α-防御素-人類防御素5(human α-defensin 5,HD5)和人類防御素6(human α-defensin 6,HD6).HD5可以調(diào)節(jié)腸道微生物群組成[13],HD6保護人類小腸免受多種腸道病原體入侵[14],PC功能障礙可能導(dǎo)致AMPs表達降低或活性受損,從而對腸道內(nèi)微生物產(chǎn)生不利影響[15,16].研究表明[17],CD防御素的相對缺乏,使AMPs和腔內(nèi)細菌之間的平衡被打破,腸道微生物黏附并侵入黏膜引發(fā)炎癥.PC功能障礙不僅阻礙小腸上皮細胞的更新,而且無法抵御細菌在黏膜的附著和入侵[18,19],在CD的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用.綜上所述,CD很可能是一種復(fù)雜的PC相關(guān)疾病[20].

1 帕內(nèi)特細胞相關(guān)的CD易感基因

PC整合腸道微生物群、腸上皮屏障功能障礙和免疫異常等因素參與CD的發(fā)病[9],因此被認為可能是CD發(fā)病中的關(guān)鍵[20],分子遺傳學(xué)和流行病學(xué)研究表明,約50%的CD起源于宿主的基因構(gòu)成[21],全基因組關(guān)聯(lián)研究確定了163個與IBD相關(guān)的基因變異,110個是CD和UC共同的變異位點,另有30個是CD特異性基因變異位點[22],其中有數(shù)個PC相關(guān)基因與CD易感性顯著相關(guān)[23,24],如核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2 (nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)、自噬相關(guān)16樣蛋白1(autophagyrelated 16-like 1,ATG16L1)、免疫相關(guān)鳥苷三磷酸酶家族M(immunity-related GTPase family M,IRGM)、無翅相關(guān)集合位點(wingless-related integration site,Wnt)、富亮氨酸重復(fù)激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)、組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8,Casp8)、X盒結(jié)合蛋白1(X-boxbinding protein-1,XBP1)等[25].

2 先天性模式識別受體相關(guān)基因

NOD2是第一個發(fā)現(xiàn)的與PC相關(guān)的CD易感基因[26,27].目前已知約80%的CD易感性與NOD2在R702W,G908R,1007fs這3個位點的突變相關(guān)[28,29],該基因通過識別細菌細胞壁中的壁基二肽分子(muramyl dipeptide,MDP)直接激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng),或通過α-防御素、免疫刺激分子、輔助受體等途徑間接激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[30].另一方面,NOD2參與AMPs的分選:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的AMPs,在高爾基體中形成專一的高密度核心囊泡(dense core vesicles,DCV)[31],保留有AMPs的DCV從高爾基體中分泌后[32],NOD2首先將LRRK2招募到DCV表面,MDP強化NOD2的DCV定位,繼而招募受體相互作用蛋白2(receptor interacting protein 2,RIP2),LRRK2增強或穩(wěn)定由共生細菌來源信號傳導(dǎo)所觸發(fā)的NOD2-RIP2復(fù)合體[33],在DCV成熟過程中指導(dǎo)溶菌酶的分選[32].研究發(fā)現(xiàn)[34,35],如果NOD2缺乏,AMPs將不再繼續(xù)留存在DCV中從而影響溶菌酶分選,使腸道抗菌能力下降.已行回腸造瘺的活動期CD患者其回腸分泌物內(nèi)HD5的含量低于健康對照組[36],當存在NOD2突變時HD5表達下降更明顯[37],因此,NOD2基因突變可以導(dǎo)致腸黏膜免疫反應(yīng)異常啟動從而引發(fā)CD[36,37].

3 自噬相關(guān)基因

自噬在上皮細胞中起著重要的穩(wěn)態(tài)作用,包括避免宿主細胞損傷,抑制炎癥反應(yīng),降解病原體[38,39].自噬相關(guān)的遺傳變異可能導(dǎo)致病原體清除能力降低,在其他因素的共同作用下引發(fā)炎癥反應(yīng)[40,41].因此,PC功能缺失可能是CD上皮細胞缺陷的基礎(chǔ)[42].

ATG16L1基因是編碼處理細胞內(nèi)細菌自噬體途徑中的一種蛋白質(zhì)[43],ATG16L1T300A是目前已知的與CD易感性最顯著的ATG16L1變異類型,攜帶ATG16L1T300A突變基因的人群的CD患病率是正常人群的2倍[44].ATG16L1和NOD2 通過同一途徑發(fā)揮抗菌作用,NOD2招募ATG16L1到細菌入侵部位的質(zhì)膜表面啟動細菌自噬[45].研究發(fā)現(xiàn)ATG16L1 缺陷引起的自噬損傷會改變PC中的蛋白質(zhì)組豐度譜[46],使PC分泌抗菌蛋白功能受到抑制.攜帶ATG16L1T300A基因的小鼠其沙門氏菌感染引起的結(jié)腸炎發(fā)生率增加[47].此外,ATG16L1對于防止PC細胞過度死亡至關(guān)重要,ATG16L1通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)來防止TNF-α介導(dǎo)的PC壞死性凋亡,通過抑制上皮細胞的壞死來維持腸道屏障[48,49].

免疫相關(guān)的IRGM是一種在PC中介導(dǎo)炎癥和自噬的蛋白質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)其對CD發(fā)揮保護作用[50].IRGM基因可通過穩(wěn)定細胞核心自噬調(diào)控因子、激活自噬、防止過度炎癥、增強IRGM組裝自噬核心機制等四種方式發(fā)揮其抗炎和抗微生物特性[41].IRGM通過抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)從而抑制促炎細胞因子(白細胞介素1β、白細胞介素18和腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子-α)的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗炎作用[51],IRGM1基因敲除的小鼠暴露于葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)后腸炎癥狀加劇,即使不暴露于DSS溶液,IRGM1基因敲除的小鼠也存在明顯的PC功能障礙[52].McCarroll等[53]發(fā)現(xiàn)了一個常見的IRGM缺失多態(tài)性,該多態(tài)性與CD的一個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)相關(guān),他們還報道IRGM抑制了與CD相關(guān)的胞內(nèi)細菌的自噬;Rufini等[54]報道IRGM多態(tài)性對CD的易感性和表型調(diào)節(jié)(纖維狹窄行為、回腸疾病、肛周疾病和腸切除)的重要性,表明IRGM變異可能調(diào)節(jié)CD的臨床特征.

LRRK2是一種具有多個可識別結(jié)構(gòu)域的大型蛋白[55],研究發(fā)現(xiàn)[56]LRRK2表達增加的小鼠表現(xiàn)出Dectin-1介導(dǎo)的細胞因子反應(yīng)增加,雖然LRRK2 轉(zhuǎn)基因小鼠沒有出現(xiàn)自發(fā)性腸炎,但暴露于DSS溶液后,這些小鼠的結(jié)腸炎發(fā)生率增加,由此說明,LRRK2轉(zhuǎn)基因小鼠在炎癥刺激后表現(xiàn)出對腸道炎癥的易感性.此外LRRK2還具有抑制自噬等功能,LRRK2信號介導(dǎo)的自噬抑制導(dǎo)致LRRK2的增加,從而可能導(dǎo)致炎癥的增強,此外,LRRK2介導(dǎo)的自噬抑制還具有促炎作用的可能[56],這些研究說明,LRRK2的激活會引發(fā)先天免疫反應(yīng)從而引發(fā)CD.此外,LRRK2作用于RIP2定位到DCV的過程中,通過NOD2-LRRK2-RIP2-Rab2a組成的遺傳通路負責(zé)PC溶菌酶的分選,與NOD2共同作用并指導(dǎo)PC的溶菌酶分選[33].

4 帕內(nèi)特細胞分化相關(guān)基因

Wnt是保持腸上皮干細胞增殖狀態(tài)的重要因子[57],能夠刺激PC的分化和成熟過程,從而調(diào)節(jié)HD5和HD6的表達[58].經(jīng)典的Wnt通路是通過PC釋放Wnt配體與細胞表面受體結(jié)合而激活[59],激活后的Wnt通路介導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定,并使之轉(zhuǎn)移到細胞核中結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF-4、TCF-1等[60],并啟動HD5、HD6等靶基因轉(zhuǎn)錄.研究表明回腸CD患者的TCF-4、TCF-1的表達降低進而導(dǎo)致HD5和HD6的表達下降[61,62].回腸CD患者表現(xiàn)出較高頻率的TCF-4基因變異(rs3814570,rs10885394,rs10885395)[63],此外,另一個在β-連環(huán)蛋白的細胞質(zhì)穩(wěn)定中起關(guān)鍵作用的Wnt因子-低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(low density lipoprotein receptor-related protein 6,LRP6),也在CD中被修飾從而導(dǎo)致HD5表達減少,18歲以下的回腸CD患者LRP6(rs2302685)突變率達10.63%[63].CD患者單核細胞Wnt配體表達減少對HD5和HD6的分泌產(chǎn)生負面影響,導(dǎo)致了細菌入侵和黏膜慢性炎癥[15].

5 維持腸上皮屏障相關(guān)基因

HDAC是一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)的酶,共有10多種亞型,其中HDAC1、HDAC2和HDAC3與PC和CD有關(guān);研究發(fā)現(xiàn)[64],HDAC1和HDAC2都是重要的腸上皮細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子,其缺失會改變Notch和mTOR信號通路,從而導(dǎo)致慢性炎癥和內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡[65,66].并表現(xiàn)出PC分化改變[65].腸上皮細胞特異性HDAC3基因敲除的小鼠(intestinal epithelial cell specific deletion of the epigenomemodifying enzyme histone deacetylase 3,HDAC3ΔIEC)表現(xiàn)出廣泛的腸上皮細胞抗菌相關(guān)的基因表達下降[67],且對腸道損傷和炎癥的易感性顯著增加,表明HDAC3的表達在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起著重要作用,另外將HDAC3ΔIEC小鼠置于無菌環(huán)境中,發(fā)現(xiàn)腸道屏障功能在很大程度上得到了恢復(fù),這一結(jié)果說明了HDAC3是整合共生細菌信號的關(guān)鍵因子,在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了重要作用[67].

Casp-8是一種半胱氨酸蛋白酶,在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起關(guān)鍵作用.在腸道中,Casp-8介導(dǎo)的細胞凋亡對腸上皮細胞的更新和塑造腸道結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[68].Casp-8通過抑制受體相互作用的絲蘇氨酸激酶1(receptor-interacting serine-threonine kinase 1,RIPK1)和受體相互作用的絲蘇氨酸激酶3(receptor-interacting serine-threonine kinase 3,RIPK3)抑制TNF-α誘導(dǎo)的壞死性凋亡,以此在預(yù)防PC壞死性凋亡和末端回腸炎中起關(guān)鍵作用[69,70],在鼠傷寒沙門氏菌感染過程中,Casp-8對于維持腸道屏障功能和阻止病原體定植至關(guān)重要[71],研究發(fā)現(xiàn)Casp-8缺失與暴發(fā)性腸上皮壞死、嚴重PC凋亡、繼發(fā)性腸炎相關(guān)[72].但目前為止Casp-8基因在CD中的作用尚未完全確定[73].

XBP1是核內(nèi)體應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在CD患者中發(fā)現(xiàn)了XBP1的基因變異[74].一方面,XBP1通過阻止細胞凋亡、介導(dǎo)細胞更新來調(diào)節(jié)PC水平[74].研究表明[75],上皮細胞特異性XBP1基因缺失的小鼠表現(xiàn)PC功能顯著受損從而導(dǎo)致了AMPs的分泌不足,使腸道對致病菌的防御能力下降,另一方面,XBP1通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑影響了PC的發(fā)育,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增強腸上皮細胞中促炎JNK/SAPK信號通路[76].因此,XBP1在CD的發(fā)病中整合了腸道菌群和黏膜免疫系統(tǒng)因素,并且兩種機制共同作用,互相促進,進而導(dǎo)致腸炎的發(fā)生.

6 結(jié)論

帕內(nèi)特細胞具有多種功能,它對黏膜發(fā)育、宿主防御和微生物群調(diào)節(jié)的貢獻是維持腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵.PC維持腸道穩(wěn)態(tài)的研究主要集中在其產(chǎn)生的抗菌肽以及抗菌肽與腸黏膜表面微生物的動態(tài)相互作用上,PC分泌的抗菌肽可以調(diào)節(jié)腸道菌群組成,腸道菌群中的特定細菌種類能夠驅(qū)動宿主的免疫反應(yīng),促進炎癥的發(fā)生.因此,腸道黏膜表面細菌與抗菌肽等的互動能夠維持腸道內(nèi)環(huán)境的平衡.由此,很容易理解PC功能障礙與CD的易感性相關(guān),這種特化細胞的遺傳缺陷導(dǎo)致抗菌肽缺陷可能是CD的致病關(guān)鍵,這為CD的預(yù)防及治療新靶點帶來了全新的認識,因此我們需要進一步重視PC在CD發(fā)生中的重要作用.