苦蕎FtF5H基因克隆及表達(dá)分析

段迎 楊曉琳 蔡蘇云 賀潤(rùn)麗 尹桂芳 王艷青 盧文潔 孫道旺 王莉花

摘 要：? 阿魏酸-5-羥基化酶（Ferulate 5-hydroxylase）是調(diào)控S型木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，為研究其在苦蕎木質(zhì)素生物合成途徑中的分子機(jī)制，該文從苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得一個(gè)F5H基因，命名為FtF5H（GenBank登錄號(hào)：MW455111），采用生物信息學(xué)方法對(duì)苦蕎F5H蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、親疏水性、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析FtF5H基因在厚果殼苦蕎與薄果殼苦蕎的葉、花、莖、果殼中的差異表達(dá)。結(jié)果表明：（1）FtF5H基因序列包含1 395 bp的完整cDNA開(kāi)放閱讀框，編碼464個(gè)氨基酸。（2）FtF5H蛋白具有P450超家族結(jié)構(gòu)，為親水性穩(wěn)定酸性蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，且為非分泌性蛋白。（3）FtF5H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示FtF5H蛋白與5ylw.1.A的相似度較高。（4）系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示FtF5H屬于CYP84A亞家族。（5）qRT-PCR顯示FtF5H基因在兩種苦蕎中的不同部位均有表達(dá)，且在厚果殼苦蕎果殼中的表達(dá)量是薄果殼的5倍，表達(dá)具有極顯著差異。該研究為進(jìn)一步研究苦蕎木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)苦蕎新品種的培育具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 苦蕎， RT-PCR克隆， 阿魏酸-5-羥基化酶， 生物信息學(xué)分析， 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2022）02-0304-11

Cloning and expression analysis of FtF5H gene from

tartary buckwheat? （Fagopyrum tataricum）

DUAN Ying1， YANG Xiaolin1， CAI Suyun1， HE Runli1*， YIN Guifang2，

WANG Yanqing2， LU Wenjie2， SUN Daowang2， WANG Lihua2

（ 1.? College of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering， Shanxi University of Chinese Medicine， Taiyuan 030619， China; 2. Yunnan

Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology/ Key Laboratory of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm

Innovation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Biotechnology and Germplasm Resources Institute，

Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650201， China ）

Abstract：? Ferulate 5-hydroxylase is a key enzyme that regulates the synthesis of S-type lignin. To study the molecular mechanism of ferulate 5-hydroxylase in lignin synthesis pathway of Fagopyrum tataricum， a FtF5H（GenBank accession number： MW455111） gene identified from F. tataricum RNA-seq data was screened and analyzed by bioinformatics methods including the physicochemical properties， signal peptide， transmembrane structure， subcellular localization， hydrophilicity， protein secondary structure and tertiary structure， amino acid structure， as well as phylogenetic tree. In addition， the real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was applied to analyze the expression pattern of FtF5H gene in leaves， flowers， stems and husks of thick husk tartary buckwheat and thin husk tartary buckwheat. The results were as follows：? （1） FtF5H gene sequence included completed open reading frame with 1 395 bp， coding for 464 amino acids. （2） The FtF5H protein was predicted to have P450 superfamily structure， and FtF5H protein， a non-secretory protein， was a hydrophilic， stable and acidic protein without transmembrane domain. （3） The FtF5H protein secondary structure was predicted to be mainly composed of α-helix and random coil， and its prediction of tertiary structure showed a high similarity with 5ylw.1.A. （4） Phylogenetic analysis showed that FtF5H belonged to the CYP84A subfamily. （5） In addition， qRT-PCR showed that the FtF5H gene was expressed in different parts of the two kinds of tartary buckwheat， and the expression level in the thick husk tartary buckwheat was four times higher than that in the thin husk，with extremely significant differences. The research establish a foundation for further study on the molecular regulation mechanism of lignin synthesis in tartary buckwheat， and has important research significance for the cultivation of new tartary buckwheat varieties.

Key words： tartary buckwheat， RT-PCR cloning， ferulate 5-hydroxylase， bioinformatics analysis， gene expression

苦蕎（Fagopyrum tataricum）為藥食兩用作物，性味苦、平、寒，具益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣、寬腸健胃等作用，被譽(yù)為“五谷之王” “三降食品”（朱云輝和郭元新，2014）。栽培苦蕎通常果殼較厚，殼比率為20%～30%，果殼堅(jiān)韌，脫殼率從2%到6%不等（Song et al.，2019），難以脫殼生產(chǎn)整粒苦蕎米，不易制得高蘆丁含量麩皮層全營(yíng)養(yǎng)苦蕎米，一定程度上降低了苦蕎的活性物質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)功效（陳慶富等，2015）;在苦蕎種子直接磨粉加工中會(huì)有少量殼粉混入，導(dǎo)致適口性下降，也限制了苦蕎產(chǎn)品的精深加工，嚴(yán)重影響苦蕎產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?！∶资w’是我國(guó)云南、貴州等地的一種易脫殼地方品種，脫殼率最高達(dá)93%（Song et al.，2019），作為一種特殊資源，‘小米蕎’對(duì)研究苦蕎薄果殼特性的遺傳規(guī)律、功能基因、品種培育及加工生產(chǎn)等方面均具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

F5H屬于細(xì)胞色素P450的單氧化物酶（Meyer et al.，1998），Meyer等人于1996年第一次從香楓中分離得到，是CYP84家族成員，具有重要的生物學(xué)功能，該基因能催化阿魏酸、松柏醇、松柏醛生成5-羥基阿魏酸、5-羥基松柏醇和5-羥基松柏醛，是調(diào)控S型木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶（Humphreys & Chapple，2002）。目前，已經(jīng)從擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Franke et al.，2000）、當(dāng)歸（Angelica sinensis）（溫隨超，2015）、毛白楊（Populus tomentosa）（陳雪等，2015）、亞麻（Linum usitatissimum）（王進(jìn)，2009）、油菜（Brassica campestris）（李揚(yáng)等，2013）等植物中克隆到F5H基因，但尚未發(fā)現(xiàn)F5H基因在苦蕎中被克隆的相關(guān)報(bào)道。

吳朝昕（2020）對(duì)厚果殼和薄果殼苦蕎的果殼成分研究發(fā)現(xiàn)，不同品種厚果殼苦蕎的果殼木質(zhì)素平均含量均高于薄果殼苦蕎。課題組前期在‘云蕎1號(hào)’和‘小米蕎’雜交F2代群體中，對(duì)厚果殼和薄果殼進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析（數(shù)據(jù)未發(fā)表），發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素生物合成途徑大部分基因在苦蕎厚果殼的表達(dá)量高于薄果殼，推測(cè)苦蕎果殼厚可能由于積累了較多的木質(zhì)素。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明F5H基因在厚果殼的表達(dá)量顯著高于薄果殼。為研究F5H基因在苦蕎木質(zhì)素合成中的作用，本研究采用RT-PCR法克隆‘云蕎1號(hào)’和‘小米蕎’的FtF5H基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究該基因功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

苦蕎厚果殼材料‘云蕎1號(hào)’為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所選育品種，薄果殼材料‘小米蕎’為云南省地方品種。剝離‘云蕎1號(hào)’和‘小米蕎’不同發(fā)育期的果殼，將剝離的果殼分別混合在一起作為基因克隆的材料;實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析用‘云蕎1號(hào)’、‘小米蕎’不同組織部位材料（結(jié)實(shí)期的葉、花、莖、果殼）。

1.2 RNA提取與cDNA第一鏈合成

根據(jù)Trizol提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行總RNA提取，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所有樣品RNA的完整性。cDNA第一鏈合成：在0.2 mL PCR管中加入5 μL總RNA、1 μL 隨機(jī)引物、1 μL ddH2O，70 ℃溫浴5 min，冰浴2 min，離心加入2.0 μL 5 × First-Strand Buffer、0.5 μL 10 mmol·L-1 dNTP、0.25 μL Rnase inhibitor、0.25 μL Reverse Transcriptase，總體系10.0 μL，42 ℃溫浴60 min，72 ℃溫浴10 min。

1.3 FtF5H基因克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的阿魏酸-5-羥基化酶（FtF5H）基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)4條特異引物（表1）。RT-PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板1 μL、dNTPs（10 mmol·L-1）0.2 μL、2×GC BufferⅠ12.5 μL、 TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL、ddH2O 10.1 μL、F（10 μmol·L-1） 0.5 μL、R （10 μmol·L-1） 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環(huán)33次;72 ℃修復(fù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，把目的條帶切膠回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 克隆基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI ORF finder在線程序及Conserved domains數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序獲得的cDNA序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框及保守功能結(jié)構(gòu)域分析;通過(guò)ProtParam對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用ProtScale對(duì)蛋白親疏水性進(jìn)行分析;采用TMHMM Server v.2.0 分析編碼氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域;利用SignalP 5.0 Server 預(yù)測(cè)信號(hào)肽;利用NetPhos 3.1 Server進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè);利用Psort分析亞細(xì)胞定位情況;通過(guò)SOPMA及SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu);編碼蛋白多重序列比對(duì)采用DNAMAN軟件;Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)用MEGA 6.0構(gòu)建（陳媞穎等，2017）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

采用Trizol總RNA抽提試劑盒分別提取‘云蕎1號(hào)’和‘小米蕎’葉、花、莖、果殼8個(gè)組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，以其為模板進(jìn)行qRT-PCR分析，每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：10 μL 2 × SG Fast qPCR Master Mix、2 μL cDNA模板、上下引物各0.4 μL、ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min ，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)45次。以苦蕎H3（JF769134.1）為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算FtF5H的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)所用引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎總RNA提取與FtF5H基因克隆

提取的總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射光下觀察RNA條帶清晰可見(jiàn)，亮度比在1∶1～2∶1之間，表明RNA基本未降解，可用于后續(xù)基因克隆。利用RT-PCR分別克隆獲得‘云蕎1號(hào)’和‘小米蕎’的F5H基因，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序拼接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘云蕎1號(hào)’和‘小米蕎’的F5H基因核酸序列完全一致，且與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列相同。ORF finder分析結(jié)果表明，2條基因序列均含有一個(gè)完整的長(zhǎng)度為1 395 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼464個(gè)氨基酸，將該基因命名為FtF5H（GenBank登錄號(hào)：MW455111）。利用DNAMAN將核苷酸序列翻譯成氨基酸，如圖2所示。

2.2 FtF5H基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 利用ProtParam軟件對(duì)FtF5H蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)FtF5H蛋白分子式為C2346H3677N637O680S28，理論分子量52 583.54 Da，親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.234，不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）為36.57，為穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)為82.65，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）63個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）56個(gè)，理論等電點(diǎn)5.76，偏酸性，推測(cè)該蛋白為親水性穩(wěn)定酸性蛋白。通過(guò)Conserved domains數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FtF5H保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有一個(gè)P450保守域，屬于P450超家族（圖3）。

通過(guò)ProtScale在線軟件，以Hphob./Kyte & Dodittle為標(biāo)度，對(duì)苦蕎FtF5H蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，以氨基酸序列為橫坐標(biāo)，氨基酸標(biāo)度為縱坐標(biāo)，親水性越強(qiáng)，則分值越小。FtF5H最高分值1.967出現(xiàn)在多肽鏈中的第256位氨基酸，該位點(diǎn)的氨基酸疏水性最強(qiáng);最低分值-2.856出現(xiàn)在362位氨基酸，證明該位點(diǎn)的氨基酸親水性最強(qiáng)。NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)tF5H整條多肽鏈中分值在閾值0.5以上的氨基酸位點(diǎn)共有36個(gè)，其中絲氨酸（Ser）22個(gè)，蘇氨酸（Thr）13個(gè)，酪氨酸（Tyr）1個(gè)。這些位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化反應(yīng)，從而對(duì)蛋白的活性與功能產(chǎn)生調(diào)控作用。

通過(guò)SignalP 5.0 Server在線軟件對(duì)苦蕎、芭蕾蘋(píng)果（XP 008372753.2）、白梨（AGR44939.1）、喜樹(shù)（AAT39511.1）、稻（BAF43423.1）、桃（XP 007203643.1）、柳枝稷（AFH89638.1）、歐洲甜櫻桃（XP 021802881.1）、藜麥（XP 021718110.1）及大葉藻（KMZ63113.1）10種植物的F5H基因的蛋白質(zhì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)比對(duì)，結(jié)果均不存在信號(hào)肽，為非分泌性蛋白（表2）。因此，推測(cè)F5H基因可能在游離核糖體上合成后不經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，直接在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的特定部位中行使催化功能（張?zhí)龋?013）。利用Psort對(duì)該10種植物F5H蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)除柳枝稷定位在細(xì)胞骨架外，其余均在葉綠體?；贔5H基因編碼蛋白的信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位進(jìn)行SPSS聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，雙子葉陸生植物桃、歐洲甜櫻桃、芭蕾蘋(píng)果、白梨、苦蕎、喜樹(shù)、藜麥聚為一支，稻、大葉藻聚為一支，柳枝稷單獨(dú)為一支，推測(cè)與F5H的作用機(jī)制有關(guān)。

TMHMM軟件預(yù)測(cè)顯示，苦蕎、柳枝稷、大葉藻不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。芭蕾蘋(píng)果、白梨、喜樹(shù)、稻、桃、歐洲甜櫻桃、藜麥均各含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明植物種類不同，其F5H基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域存在情況不同。

2.2.2 FtF5H的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)FtF5H含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)則卷曲占36.21%，α-螺旋占46.12%，延伸鏈占12.28%，β-轉(zhuǎn)角占5.39%（圖5）。利用SWISS-MODEL對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6：A。FtF5H蛋白第5位～455位氨基酸與數(shù)據(jù)庫(kù)目標(biāo)蛋白5ylw.1.A的序列相似度為33.49%。QMEAN值是-2.83。GMQE（global model quality estimation，全球性模型質(zhì)量估測(cè)）值為0.71，GMQE值在0～1之間，越接近1，建模質(zhì)量越好，表明建模可信度高。結(jié)合芭蕾蘋(píng)果（XP 008372753.2）、白梨（AGR44939.1）、新疆梨（QHS84908.1）、喜樹(shù)（AAT39511.1）、葡萄（XP 002272644.1）、桃（XP 007203643.1）、扁桃（BBH07995.1）、紫苜蓿（ABB02161.1）、歐洲甜櫻桃（XP 021802881.1）的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的結(jié)構(gòu)域，即含鐵原卟啉功能域（圖6：B）和錳離子功能域（圖6：C）（張?zhí)龋?015）。

2.2.3 氨基酸結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 采用NCBI的BlastP在線程序，查找FtF5H的同源氨基酸序列，比對(duì)結(jié)果表明FtF5H氨基酸序列與GenBank中相關(guān)序列同源性在73.12%～77.42%之間。利用DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì)， 發(fā)現(xiàn)苦蕎FtF5H與參與比對(duì)植物的F5H氨基酸序列的相似性高達(dá)84.79%，含有血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域FxxGxxxCxG（圖7），其中保守的半胱氨酸充當(dāng)血紅素鐵的第五個(gè)配體（Chapple，1998），證明FtF5H屬于P450家族。

運(yùn)用MEGA 6.0軟件并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示苦蕎FtF5H與藜麥的CYP84A1聚為一小簇，說(shuō)明其同源性最高，相關(guān)研究報(bào)道擬南芥阿魏酸-5-羥化酶AtCYP84A1的表達(dá)與木質(zhì)素生物合成的定量以及發(fā)育調(diào)控有關(guān)（Ruegger et al.，1999），本研究克隆得到的苦蕎FtF5H與擬南芥及其他植物的CYP84A1聚在一支（圖8），說(shuō)明其可能與苦蕎木質(zhì)素合成及調(diào)控有關(guān)（Zhang et al.，2019）。

2.2.4 FtF5H基因相對(duì)定量分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析FtF5H基因在厚果殼與薄果殼苦蕎不同器官的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FtF5H

基因在苦蕎不同器官的表達(dá)量不同， 在厚果殼‘云蕎1號(hào)’中的相對(duì)表達(dá)量由小到大依次為葉、花、莖、果殼，而在薄果殼‘小米蕎’中則是莖、果殼、花、葉。同一器官相比，除葉外，F(xiàn)tF5H在厚果殼‘云蕎1號(hào)’各個(gè)部位的表達(dá)量均高于薄果殼‘小米蕎’，且差異極顯著（圖9）。FtF5H在苦蕎厚果殼中的表達(dá)量是薄果殼的5倍，與前期轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

苦蕎作為自然界中少見(jiàn)的藥食兩用作物，具有極高的藥用價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)功效。如何將薄果殼性狀轉(zhuǎn)入栽培品種，育成既易脫殼又高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的苦蕎新品種成為研究熱點(diǎn)。Song等（2019）對(duì)厚殼苦蕎和薄殼苦蕎纖維素和木質(zhì)素含量變化與脫皮效率之間關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明隨著脫殼效率的降低（厚殼），木質(zhì)素含量減少，纖維素含量增加;吳朝昕（2020）發(fā)現(xiàn)薄殼苦蕎果殼纖維素和木質(zhì)素含量顯著低于厚殼苦蕎，二者研究結(jié)果不同。本課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素生物合成途徑大部分基因在苦蕎薄果殼表達(dá)量低于厚果殼。為了進(jìn)一步探究苦蕎薄果殼形成的分子機(jī)制，本研究克隆了薄果殼和厚果殼的F5H基因，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)二者序列完全一致，且與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

F5H是調(diào)控植物木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶基因，在木質(zhì)素形成過(guò)程中起重要作用，通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)克隆的苦蕎F5H蛋白有一個(gè)P450保守域，屬于P450超家族，與石榴（馮立娟等，2018）、尾葉桉（肖玉菲等，2018）、毛白楊（王軼男等，2014）中的研究結(jié)果一致?？嗍wF5H蛋白有數(shù)量不同的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，與石榴（馮立娟等，2018）中的研究結(jié)果一致。F5H磷酸化后可以改變蛋白質(zhì)活性，從而調(diào)節(jié)苦蕎的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)苦蕎FtF5H與其他植物F5H氨基酸序列的相似性高達(dá)84.79%，證明該基因比較保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，苦蕎FtF5H基因與藜麥親緣關(guān)系最近，且與其他雙子葉植物的F5H基因親緣較近，而與單子葉植物水稻、柳枝稷、稷、黃藤的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明該基因在雙子葉及單子葉植物綱之間同源性差異較大。

Shafrin等（2015）下調(diào)黃麻的F5H基因，發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因植物相比，整個(gè)莖中酸不溶性木質(zhì)素含量降低約25%，纖維木質(zhì)素降低12%～15%。肖玉菲等（2018）在對(duì)尾葉桉的研究中發(fā)現(xiàn)，EuF5H在半木質(zhì)化莖中表達(dá)量最高，在嫩莖中最低。甘藍(lán)型油菜植株根、根莖和莖中木質(zhì)素含量高低與抗倒能力成正相關(guān)，且F5H基因在抗倒伏油菜薹期根部、莖部以及開(kāi)花期根部表達(dá)量明顯高于易倒伏材料（李堯臣和戚存扣，2011）。本研究FtF5H基因在厚果殼‘云蕎1號(hào)’莖、花、果殼的表達(dá)量均高于薄果殼‘小米蕎’，各器官之間的表達(dá)有極顯著差異，且FtF5H在厚果殼中的表達(dá)量是薄果殼的5倍，推測(cè)FtF5H基因在薄果殼苦蕎低表達(dá)與薄果殼的木質(zhì)素合成和積累少有關(guān)。

Takeda等（2017）對(duì)水稻的研究發(fā)現(xiàn)，OsF5H1表達(dá)是控制水稻細(xì)胞壁中S/G木質(zhì)素組成的主要因素。徐超等（2015）對(duì)碭山酥梨果實(shí)F5H基因的研究發(fā)現(xiàn)PbF5H參與調(diào)控梨果實(shí)S木質(zhì)素單體的合成，影響木質(zhì)素G/S比值。Tetreault等（2020）的研究發(fā)現(xiàn)，高粱F5H（SbF5H）的過(guò)表達(dá)增加了S-木質(zhì)素含量。木質(zhì)素合成有著復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，多個(gè)基因共同調(diào)控它的代謝。F5H基因作為一個(gè)多基因家族，并非所有F5H基因均在G/S的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。因此，本研究獲得的FtF5H基因在薄果殼苦蕎木質(zhì)素生物合成途徑的功能仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）

收稿日期：? 2021-03-11

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（31460379）;國(guó)家燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系“蕎麥病蟲(chóng)害防控”項(xiàng)目（CARS-07-C-2）;山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201803D221012-6）;陽(yáng)泉市中藥材產(chǎn)業(yè)專項(xiàng)（SZY-YQZX-2019005） [Supported by? National Natural Science Foundation of China （31460379）;? National Technical System of Oat and Buckwheat “Plant Diseases and Insect Pests Control of Buckwheat”（CARS-07-C-2）; Key Research and Development Project of Shanxi （201803D221012-6）; Special Project of Traditional Chinese Medicine Industry in Yangquan City （SZY-YQZX-2019005）]。

第一作者： 段迎（1996-），碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)與利用，（E-mail）18434376630@163.com。

*通信作者：? 賀潤(rùn)麗，博士，教授，主要研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)與利用，（E-mail）herunli666@163.com。

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