陳姣姣，林 玲，鄭金香，陳琳慧，耿寶榮

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117)

新煙堿類殺蟲劑(Neonicotinoid insecticides)是20世紀(jì)后期研發(fā)出的一類新型殺蟲劑[1]，是目前全球范圍內(nèi)最重要的一類殺蟲劑[2]．其作用機(jī)制是作為昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)的選擇性激動(dòng)劑，阻斷受體導(dǎo)致昆蟲癱瘓和死亡[3]．新煙堿類殺蟲劑在植株體內(nèi)具有較好的內(nèi)吸活性，對(duì)刺吸式口器害蟲及其他害蟲具有較高的殺蟲活性，現(xiàn)已在世界各地廣泛使用[4]．啶蟲脒(Acetamiprid)和噻蟲嗪(Thiamethoxin)是繼吡蟲啉之后研發(fā)出的新煙堿類殺蟲劑的代表，廣泛應(yīng)用于農(nóng)田害蟲防治中，具有較廣的發(fā)展空間．新煙堿類殺蟲劑對(duì)非靶生物有不同程度的影響[4-6]，但對(duì)兩棲動(dòng)物的影響則少見報(bào)道[7-8]．

兩棲類是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)農(nóng)作物病蟲害的防治起著重要作用．近半個(gè)世紀(jì)以來，世界范圍的兩棲類種群衰退引起了各國學(xué)者的廣泛關(guān)注[9-10]．研究表明，環(huán)境污染是兩棲類種群下降的重要原因之一[11]．兩棲動(dòng)物因具有特殊的生物學(xué)特征和生態(tài)學(xué)特征，對(duì)外界環(huán)境的變化極為敏感，一直被作為生態(tài)環(huán)境監(jiān)測的重要指示類群[12]；而體內(nèi)抗氧化活性的變化是常用的監(jiān)測指標(biāo)[13]．正常情況下，當(dāng)生物體處于逆境環(huán)境下，其抗氧化能力在一定程度上會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激提高，抵抗外界干擾以免機(jī)體損傷．但高強(qiáng)度或長時(shí)間的外界干擾則會(huì)抑制生物體的抗氧化能力，降低氧自由基的代謝能力，引起細(xì)胞損傷，產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)[14]．

本文利用靜態(tài)-換水法研究了啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙(Ranazhenhaiensises)蝌蚪的急性毒性，在此基礎(chǔ)上，檢測了這兩種新煙堿類殺蟲劑對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的生理毒性，即對(duì)蝌蚪抗氧化系統(tǒng)的毒性效應(yīng)，包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性、總抗氧化能力(Total antioxidative capacity，T-AOC)以及丙二醛(Malondialdehyd，MDA)含量等的影響，旨在了解新煙堿類殺蟲劑對(duì)兩棲動(dòng)物蝌蚪的生理生態(tài)毒性效應(yīng)，為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)和野生兩棲動(dòng)物資源的保護(hù)提供科學(xué)數(shù)據(jù)．

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)動(dòng)物鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪采自福州市晉安區(qū)壽山鄉(xiāng)農(nóng)田，將采來的卵群置于實(shí)驗(yàn)室的水簇箱中孵化與培養(yǎng)，孵化和培養(yǎng)蝌蚪所用的水為曝氣48 h以上的自來水，每天換水1次，用蛋黃或魚飼料喂養(yǎng)開食后的蝌蚪．蛙卵與蝌蚪培養(yǎng)過程中，存活率均達(dá)90%以上．實(shí)驗(yàn)時(shí)選取活動(dòng)性能好、沒有機(jī)械損傷的28-30期[15]的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)．

啶蟲脒(有效成分20%，EC)由江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；噻蟲嗪(有效成分25%，WDG)由上海悅聯(lián)化工有限公司生產(chǎn)．考馬斯亮蘭蛋白測試、SOD測試、T-AOC測試以及MDA含量測試等的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性

在水溫為15～20 ℃的實(shí)驗(yàn)室條件下，采用靜態(tài)-換水法[16]進(jìn)行毒性試驗(yàn)．根據(jù)預(yù)試驗(yàn)所得到的結(jié)果，以農(nóng)藥的有效成分濃度為標(biāo)準(zhǔn)，按20 mg·L-1的等質(zhì)量濃度間距將啶蟲脒和噻蟲嗪分別設(shè)置7個(gè)處理組(啶蟲脒：160～280 mg·L-1，噻蟲嗪：180～300 mg·L-1)，另設(shè)空白對(duì)照組，每組隨機(jī)放入蝌蚪8只，試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)平行．試驗(yàn)期間不喂食，試驗(yàn)持續(xù)96 h．每24 h更換1次試液，并記錄蝌蚪在24、48、72、96 h死亡的數(shù)量，及時(shí)清理出死亡的個(gè)體．

1.2.2 生理毒性

染毒：根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，在保證蝌蚪不死亡的條件下，以農(nóng)藥的有效成分濃度為標(biāo)準(zhǔn)，按20 mg·L-1的等質(zhì)量濃度間距將啶蟲脒和噻蟲嗪分別設(shè)置5個(gè)處理組(20～100 mg·L-1)，并設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組．每組隨機(jī)投放25尾蝌蚪，染毒期間不喂食，每24 h更換1次試液．

樣品制備：暴露24、48、72、96 h后，分別從各處理組及對(duì)照組中隨機(jī)取出5只蝌蚪(每只蝌蚪均單獨(dú)處理)，經(jīng)沖洗后用濾紙吸干蝌蚪體表的水分，按質(zhì)量體積比(1∶9)加入生理鹽水和適量石英砂，在冰浴條件下迅速充分研磨、靜置，然后取上層液體，制備成10%的組織勻漿，在2 500 r·min-1條件下離心10 min，取上清液測定．

測定方法：采用考馬斯亮蘭法測定蝌蚪體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，SOD活性、T-AOC以及MDA含量按照試劑盒中說明書的步驟進(jìn)行操作．SOD活性定義為每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位，以U·mg-1表示；T-AOC單位定義為在37 ℃時(shí)，每min每mg組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度(OD值)每增加0.01時(shí)為1個(gè)單位，以U·mg-1表示；MDA含量以n mol·mg-1表示．

1.3 數(shù)據(jù)處理

在急性毒性試驗(yàn)中，利用Excel計(jì)算半致死質(zhì)量濃度(ρLC50)．將兩種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與蝌蚪死亡百分率進(jìn)行線性回歸分析，得到毒性回歸方程；當(dāng)死亡率為50%，通過回歸方程計(jì)算得出24、48、72、96 h-ρLC50，安全質(zhì)量濃度按公式(ρSC)=0.1×96 h-ρLC50計(jì)算而求得[17]．在生理毒性試驗(yàn)中，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；在同一暴露時(shí)間內(nèi)，各處理組間及各處理組與對(duì)照組間的比較采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行LSD多重比較分析，顯著性水平設(shè)置為α= 0.05．

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性

經(jīng)不同質(zhì)量濃度的啶蟲脒和噻蟲嗪染毒處理后，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的累積死亡數(shù)及死亡率見表1．由表1可見，對(duì)照組蝌蚪無死亡，各處理組出現(xiàn)不同數(shù)量的蝌蚪死亡．經(jīng)回歸分析表明，兩種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與蝌蚪死亡率呈現(xiàn)顯著的線性關(guān)系，依據(jù)急性毒性的回歸方程計(jì)算可得，啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的96 h-ρLC50分別為215.83 mg·L-1和232.43 mg·L-1，ρSC分別為21.583 mg·L-1和23.243 mg·L-1(表2)．

表1 啶蟲脒和噻蟲嗪處理下鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的累積死亡數(shù)及死亡率

表2 啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪毒性影響的回歸參數(shù)

續(xù)表2

2.2 生理毒性

2.2.1 啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的SOD活性的影響

經(jīng)啶蟲脒和噻蟲嗪暴露48h和96h后，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的SOD活性變化見圖1．

注：同一處理時(shí)間中，標(biāo)注字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，a>b>c>d，P<0.05．下同．

由圖1可知，在啶蟲脒溶液中暴露48h后，20mg·L-1質(zhì)量濃度處理組中的鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的SOD活性與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而在40、60mg·L-1質(zhì)量濃度處理組，蝌蚪的SOD活性被誘導(dǎo)而上升，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，峰值出現(xiàn)在60mg·L-1質(zhì)量濃度組；隨著啶蟲脒質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，蝌蚪的SOD活性逐漸受到抑制而下降，最高質(zhì)量濃度組(100mg·L-1)蝌蚪的SOD活性降至與對(duì)照組相近的水平．暴露96h后，在低中質(zhì)量濃度處理組中(20、40、60mg·L-1)，蝌蚪的SOD活性與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；但在高質(zhì)量濃度處理組中(80、100mg·L-1)，蝌蚪的SOD活性則被抑制而下降，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)．

在噻蟲嗪溶液中暴露48h后，低質(zhì)量濃度處理組中(20、40mg·L-1)，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的SOD活性被誘導(dǎo)而逐漸升高，峰值出現(xiàn)在40mg·L-1質(zhì)量濃度組；隨著噻蟲嗪質(zhì)量濃度的繼續(xù)加大，蝌蚪的SOD活性被抑制而逐漸下降，最高質(zhì)量濃度組(100mg·L-1)蝌蚪的SOD活性降至與對(duì)照組一致的水平．暴露96h后，低質(zhì)量濃度處理組(20、40mg·L-1)的SOD活性與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，中高質(zhì)量濃度組的SOD活性被抑制顯著低于對(duì)照組，最高質(zhì)量濃度組(100mg·L-1)的SOD活性降至對(duì)照組的一半以下．

2.2.2 啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的T-AOC的影響

經(jīng)啶蟲脒和噻蟲嗪處理48h和96h后，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的T-AOC變化見圖2．

由圖2可知，在啶蟲脒溶液中暴露48h后，最低質(zhì)量濃度處理組(20mg·L-1)的鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的T-AOC與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在40mg·L-1質(zhì)量濃度處理組，蝌蚪的T-AOC被誘導(dǎo)而上升，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；隨著啶蟲脒質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，蝌蚪的T-AOC逐漸受到抑制而下降，最高質(zhì)量濃度組(100mg·L-1)蝌蚪的T-AOC降至與對(duì)照組相近的水平．暴露96h后，在20mg·L-1質(zhì)量濃度處理組中，蝌蚪的T-AOC與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；但隨著啶蟲脒質(zhì)量濃度的增大，蝌蚪的T-AOC則被抑制而下降，最高質(zhì)量濃度組(100mg·L-1)的T-AOC僅為對(duì)照組的40%左右．

圖2 啶蟲脒和噻蟲嗪溶液中鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的T-AOC變化

在噻蟲嗪溶液中暴露48h后，40mg·L-1質(zhì)量濃度組的T-AOC被誘導(dǎo)而上升，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；隨著噻蟲嗪質(zhì)量濃度的增大，蝌蚪的T-AOC被抑制而逐漸下降，最高質(zhì)量濃度組(100mg·L-1)的T-AOC顯著低于對(duì)照組(P<0.05)．暴露96h后，低中質(zhì)量濃度組(20、40、60mg·L-1)的活性與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但高質(zhì)量濃度組(80、100mg·L-1)則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)．

2.2.3 啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的MDA含量的影響

由圖3可知，在啶蟲脒溶液中暴露48h后，在低中質(zhì)量濃度處理組中(20、40、60mg·L-1)，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的MDA含量與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，高質(zhì)量濃度處理組(80、100mg·L-1)中的蝌蚪MDA含量則顯著高于對(duì)照組(P<0.05)．暴露96h后，低質(zhì)量濃度組(20、40mg·L-1)的MDA含量與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，中高質(zhì)量濃度組則高于對(duì)照組(P<0.05)．

圖3 啶蟲脒和噻蟲嗪溶液中鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的MDA含量變化

在噻蟲嗪溶液中暴露48h后，低中質(zhì)量濃度組(20、40、60mg·L-1)的MDA含量與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，最高質(zhì)量濃度組(100mg·L-1)的MDA含量則高于對(duì)照組(P<0.05)．暴露96h后，低質(zhì)量濃度組(20、40mg·L-1)的MDA含量與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，中高質(zhì)量濃度組則顯著高于對(duì)照組(P<0.05)．

由此可知，在啶蟲脒和噻蟲嗪暴露下，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的SOD活性和T-AOC總體上呈現(xiàn)出基本相同的變化規(guī)律，即在短時(shí)間內(nèi)先被誘導(dǎo)而提高，出現(xiàn)應(yīng)激效應(yīng)；但隨著農(nóng)藥暴露時(shí)間的延長，其活性逐漸被抑制而下降，機(jī)體的抗氧化能力顯著降低．

3 討論

關(guān)于新煙堿類殺蟲劑對(duì)非靶標(biāo)生物的急性毒性研究，已有許多報(bào)道[2]．研究表明，除了對(duì)魚苗毒性為中等級(jí)別外，多數(shù)新煙堿類殺蟲劑對(duì)魚類的急性毒性級(jí)別屬于低毒性或微毒性[18-19]．陳姣姣等[8]發(fā)現(xiàn)噻蟲嗪對(duì)中華蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪的急性毒性屬低毒級(jí)別．本研究表明啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的96h-ρLC50分別為215.83mg·L-1和232.43mg·L-1，其毒性級(jí)別為低級(jí)[20]．

SOD是一類可以清除機(jī)體內(nèi)過量超氧自由基的活性蛋白酶，是生物機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系中的重要組成部分，SOD活性下降易使機(jī)體受氧自由基受損．研究表明，亞致死劑量的吡蟲啉、噻蟲嗪和烯啶蟲胺等新煙堿類殺蟲劑短時(shí)間內(nèi)可誘導(dǎo)斑馬魚(Danio rerio)出現(xiàn)氧化應(yīng)激效應(yīng)，但長時(shí)間的暴露會(huì)抑制其活性[21-23]．短時(shí)間和低質(zhì)量濃度的噻蟲嗪暴露對(duì)中華蟾蜍蝌蚪的SOD活性影響不大，但高質(zhì)量濃度和長時(shí)間的暴露則會(huì)抑制SOD活性[8]．本研究結(jié)果表明，較低質(zhì)量濃度(啶蟲脒≤60mg·L-1，噻蟲嗪≤40mg·L-1)和較短時(shí)間(≤48h)的暴露，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的SOD活性會(huì)被誘導(dǎo)而提高，但高質(zhì)量濃度和長時(shí)間的暴露則會(huì)抑制蝌蚪的SOD活性，這與前人的研究結(jié)果一致．

T-AOC是一項(xiàng)衡量生物有機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，可以反映機(jī)體清除自由基的能力[24]，因其對(duì)低濃度的環(huán)境污染物較為敏感，故常作為檢測和評(píng)價(jià)環(huán)境污染程度的重要生物標(biāo)志物[25-26]．在兩棲動(dòng)物方面，陳姣姣研究了兩種新煙堿類殺蟲劑對(duì)3種兩棲類(黑眶蟾蜍Duttaphrynus melanostictus、中華蟾蜍和大樹蛙Rhacophorus dennysi)蝌蚪的影響，表明T-AOC的變化趨勢(shì)是隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)[27]．本研究結(jié)果表明，在啶蟲脒和噻蟲嗪的作用下，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的T-AOC的變化與SOD變化相似，出現(xiàn)先被誘導(dǎo)應(yīng)激而提高活性，然后受到抑制而降低活性．表明高質(zhì)量濃度和長時(shí)間的暴露對(duì)蝌蚪的抗氧化系統(tǒng)有一定的損害作用．

MDA是生物有機(jī)體內(nèi)氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其濃度水平反映了脂質(zhì)過氧化的程度，即機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度，生物有機(jī)體在外界有毒物質(zhì)作用下，體內(nèi)MDA含量會(huì)積累上升[28]．本研究結(jié)果表明，在較低質(zhì)量濃度的啶蟲脒和噻蟲嗪作用下，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)被激活，提高清除氧自由基的能力，MDA含量下降；但隨著藥物質(zhì)量濃度的提高和暴露時(shí)間的延長，蝌蚪體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)受到損傷，不能及時(shí)清除過量的氧自由基，MDA含量則逐漸上升，這與SOD活性和T-AOC的變化是相符的．

綜上所述，啶蟲脒和噻蟲嗪對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的毒性為低級(jí)，但兩棲動(dòng)物蝌蚪常棲息于靜態(tài)的、窄淺的或暫時(shí)性水體中，環(huán)境污染物容易積累，對(duì)蝌蚪仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性．啶蟲脒和噻蟲嗪這兩種新煙堿類殺蟲劑能改變鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的抗氧化系統(tǒng)活性，長時(shí)間的暴露將對(duì)蝌蚪產(chǎn)生不利影響．