豬牙皂皂苷脂質(zhì)體的制備及其黏膜毒性的評(píng)價(jià)*

趙立敏，陳曉蘭，陳 林，彭孟婷，陳 瑤

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

中風(fēng)是現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)對(duì)急性心腦血管栓塞疾病的一個(gè)統(tǒng)稱，是一種老年人多發(fā)、常見(jiàn)病，早期發(fā)病率呈逐年快速增加的趨勢(shì)。因早期中風(fēng)發(fā)病急、晚期臨床治療難、治療時(shí)間窗口窄，所以中風(fēng)有發(fā)病率高、發(fā)病快、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多的六大特征。

豬牙皂來(lái)源于豆科植物皂莢(GleditsiasinensisLam.)的干燥不育果實(shí)。性溫氣微、微辛、咸、有小毒，黏膜刺激性大。歸屬肺、大腸經(jīng)。豬牙皂主要含有多種三萜皂苷，被收載在2005版《中國(guó)藥典》，有改善心肌缺血、抗炎、抗病毒、抗過(guò)敏、抗腫瘤[1-7]多種功效。

鼻腔給藥?kù)钐祵?shí)驗(yàn)和大鼠缺血性腦中風(fēng)模型[8-9]證明了豬牙皂皂苷經(jīng)鼻黏膜吸收有顯著的祛痰作用，對(duì)大鼠缺血性腦中風(fēng)也有明顯的藥效作用，充分印證了古人對(duì)豬牙皂藥性認(rèn)識(shí)的正確性和鼻腔給藥的合理性。但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)豬牙皂皂苷的黏膜毒性非常大，因脂質(zhì)體有促進(jìn)吸收、減毒增效、靶向定向作用、藥物穩(wěn)定性高、細(xì)胞親和性大[10-16]等作用。本課題將豬牙皂皂苷制備成脂質(zhì)體經(jīng)鼻腔給藥以降低豬牙皂皂苷的黏膜毒性。

1 儀器及試劑

表1 儀器及試劑Tab.1 Instruments and reagents

續(xù)表1

2 方法與結(jié)果

2.1 豬牙皂脂質(zhì)體中總皂苷的測(cè)定方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取齊墩果酸對(duì)照品11.16 mg加入甲醇定容于10 mL容量瓶中，超聲溶解備用。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的確立

取對(duì)照品和空白脂質(zhì)體溶液分別用5%香草醛-冰乙酸溶液與高氯酸顯色后在540 nm測(cè)定吸光度，結(jié)果表明該波長(zhǎng)處空白脂質(zhì)體無(wú)干擾，則選540 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制濃度0.03348 mg/mL、0.0558 mg/mL、0.07812 mg/mL、0.12276 mg/mL、0.14508 mg/mL、0.1674 mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液，揮干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、1 mL高氯酸。在60 ℃水浴下顯色15 min后冷卻5 min，加入冰醋酸至刻度，在540 nm下測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)的線性回歸方程：a=3.7906c+0.1599，r=0.9995。表明齊墩果酸在0.03348～0.1674 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品濃度為1.106 mg/mL的溶液50 μL，置10 mL容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)法下連續(xù)測(cè)定A值6次，以A值計(jì)算RSD為0.36%。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取脂質(zhì)體溶液0.2 mL，置10 mL容量瓶中定容，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、15 h后按“2.1.3”項(xiàng)下連續(xù)測(cè)定吸光度，以A值計(jì)算RSD為0.47%，說(shuō)明脂質(zhì)體在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一份豬牙皂皂苷脂質(zhì)體樣品6份，每份0.2 mL，照“2.1.3”項(xiàng)下操作分別測(cè)定A值，以A值計(jì)算RSD為0.49%。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn)

取空白脂質(zhì)體6份，分別加入同一濃度的齊墩果酸對(duì)照品溶液，照“2.1.3”項(xiàng)操作，分別測(cè)定A值，計(jì)算回收率為93.5%、91.3%、90.5%、93.0%、93.0%、91.1%。RSD為1.35%。

2.1.8 包封率和載藥量的測(cè)定

定包封率測(cè)定：吸取脂質(zhì)體溶液5 mL，置于5 mL離心管中高速離心40 min(13000 r/min)，吸取上清液適量，定容至10 mL，照“2.1.3”項(xiàng)操作，分別測(cè)定A值。計(jì)算包封率，包封率公式為：

包封率=(脂質(zhì)體中包封的藥物/脂質(zhì)體中藥物總量)×100%=1-介質(zhì)中未包封的藥物量/(脂質(zhì)體中藥物總量+介質(zhì)中未包封的藥量)

同上方法測(cè)定載藥量：載藥量(%)=(脂質(zhì)體中藥物總量-游離藥物量)/脂質(zhì)體取樣量總重×100%

2.2 脂質(zhì)體的制備方法

豬牙皂脂質(zhì)體制備方法為薄膜分散法：稱取實(shí)驗(yàn)室自制的豬牙皂皂苷(純度為36.5%)0.02 g，加15 mL pH為8.0的PBS緩沖液超聲溶解5 min后備用，另稱量卵磷脂0.2 g，膽固醇0.05 g，用20 mL三氯甲烷溶于250 mL圓底燒瓶，在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成均勻薄膜，加入豬牙皂皂苷PBS緩沖液混合溶液，在25 ℃條件下水化150 min。照“2.1.8”項(xiàng)測(cè)定吸光度，計(jì)算并得其包封率。

2.3 脂質(zhì)體處方及工藝優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，藥脂質(zhì)量比(豬牙皂總皂苷和卵磷脂的質(zhì)量之比)、膜材質(zhì)量比(卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量值之比)、緩沖液pH值、水化溫度等因素對(duì)脂質(zhì)體成膜和水化過(guò)程有很大的影響。因此以藥脂質(zhì)量比(A)、膜材比(B)、緩沖液pH值(C)、水化合物溫度(D)等因素作為主要因素，以包封率為主要考察指標(biāo)。照“2.1.8”項(xiàng)法計(jì)算包封率。用L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2、表3和表4。

表2 正交因素設(shè)計(jì)表Tab.2 Design of orthogonal factors

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=2)Tab.3 Design and results of L9(34)orthogonalexperiment(n=2)

表4 脂質(zhì)體制備正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.4 Results of variance analysis

由試驗(yàn)表可知，豬牙皂皂苷脂質(zhì)體包封率影響力排序?yàn)镃>B>D>A，最佳工藝流程為A2B2C3D3，藥物與卵磷脂比為1∶10，卵磷脂與膽固醇的比為4∶1，緩沖液pH值為8.0，水化溫度45 ℃。4項(xiàng)因素?zé)o顯著性。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

據(jù)最佳工藝條件，制備3份豬牙皂皂苷脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率，包封率為72.67%±0.38%，3次驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明優(yōu)化工藝合理可行，穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。

2.5 載藥量測(cè)定

照“2.1.8”項(xiàng)法計(jì)算最佳工藝條件下制備的脂質(zhì)體載藥量，載藥量為41.8%±0.67%。

2.6 豬牙皂皂苷的質(zhì)量考查

2.6.1 脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位的測(cè)定

用貝克曼激光粒徑儀測(cè)定粒徑和Zeta電位。吸取0.1 mL豬牙皂皂苷脂質(zhì)體稀釋至10 mL并測(cè)定粒徑。豬牙皂總皂苷脂質(zhì)體粒徑均值為(150.11±2.10)nm，豬牙皂皂苷脂質(zhì)體粒徑分布均勻。Zeta電位均值為(-31.70±1.50)mV，表明豬牙皂皂苷脂質(zhì)體穩(wěn)定性較好。

2.6.2 脂質(zhì)體顯微鏡觀察

另取一滴脂質(zhì)體滴在載玻片上，滴加1滴香柏油后制片在顯微鏡高倍鏡下觀察。觀察到豬牙皂皂苷脂質(zhì)體呈圓形。

圖1 豬牙皂皂苷脂質(zhì)體的粒徑測(cè)定結(jié)果Fig.1 Particle size measurement results of the saponin liposome

圖2 豬牙皂皂苷脂質(zhì)體的顯微觀察結(jié)果Fig.2 Microscopic observation of the saponin liposome

2.6.3 脂質(zhì)體透射電鏡觀察

透射電鏡觀察到脂質(zhì)體為圓形。

圖3 豬牙皂皂苷脂質(zhì)體的透射電鏡觀察結(jié)果Fig.3 Transmission electron microscope observation ofthe saponin liposome

2.7 豬牙皂皂苷脂質(zhì)體細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

2.7.1 試驗(yàn)步驟

將蟾蜍(50～100 g，采購(gòu)于蟾蜍養(yǎng)殖合作社)隨機(jī)分為4組，每組5只。設(shè)置為生理鹽水組、2%去氧膽酸鈉組、豬牙皂皂苷組和豬牙皂皂苷脂質(zhì)體組。將蟾蜍用錐子破壞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)后仰臥固定在解剖板上，用止血鉗使蟾蜍嘴巴保持張開(kāi)狀態(tài)，每組分別給藥0.5 mL溶液涂于上顎，30 min后，取上顎帶纖毛的表皮，生理鹽水洗凈，制片顯微鏡下觀察纖毛運(yùn)動(dòng)后，放置在含水的層析缸中，保持濕潤(rùn)。每10 min觀察一次纖毛運(yùn)動(dòng)，記錄全部纖毛運(yùn)動(dòng)停止的時(shí)間。與生理鹽水組比較各組的纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間，以評(píng)價(jià)各組別的黏膜毒性。

表5 粘膜毒性試驗(yàn)結(jié)果(X±S，n=5)Tab.5 Mucosal toxicity test results(X±S，n=5)

2.7.2 結(jié)果

從表中對(duì)比生理鹽水組可知，豬牙皂皂苷組纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間最短，占生理鹽水組百分比0.2%；去氧膽酸鈉組次之，占生理鹽水組百分比26.8%。說(shuō)明豬牙皂皂苷黏膜毒性最大，去氧膽酸鈉組粘膜毒性較豬牙皂皂苷組小。豬牙皂皂苷脂質(zhì)體組纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)，且占生理鹽水組百分比為61.6%。表明豬牙皂皂苷脂質(zhì)體組黏膜毒性很小。豬牙皂皂苷制備為脂質(zhì)體以后黏膜毒性減小。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

采用薄膜分散法制備的豬牙皂皂苷脂質(zhì)體具有可行性高、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，用正交法優(yōu)化的處方使得豬牙皂皂苷脂質(zhì)體包封率為72.67%±0.38%，載藥量為41.8%±0.67%，電位為(-31.70±1.50)mV，粒徑為(150.11±2.10)nm。豬牙皂皂苷脂質(zhì)體粒徑分布較均勻，外形圓整規(guī)則，粘膜毒性較小。

3.2 討論

豬牙皂皂苷有很多的藥理作用，豬牙皂皂苷對(duì)于治療缺血性腦中風(fēng)的效果已經(jīng)明確，但因粘膜毒性較大未被廣泛應(yīng)用，本課題利用脂質(zhì)體包載作用，將豬牙皂制成脂質(zhì)體，以此起到增效減毒的作用，對(duì)豬牙皂皂苷的臨床應(yīng)用具有重要的意義，本試驗(yàn)僅對(duì)其黏膜毒性進(jìn)行了考察，接下來(lái)將對(duì)豬牙皂皂苷脂質(zhì)體的藥效進(jìn)行研究。