周映君，謝純良，陳柏忠，龔文兵，朱作華，許 超，楊 琦，彭源德,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長沙 410205；2.廣東新寶堂生物科技有限公司，廣東江門 529000）

新會(huì)柑，又稱陳皮柑，主產(chǎn)于江門市新會(huì)地區(qū)，為廣東省十大道地藥材之一中國地理標(biāo)志產(chǎn)品。兼具藥食兩用的特色，具有理氣健脾、和胃止嘔、燥濕化痰等功效。近年來，廣陳皮產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，現(xiàn)有種植面積已超6667 hm2，果品年產(chǎn)量達(dá)230000 t[1-2]。不同于其他柑橘品種，新會(huì)柑的開發(fā)利用多局限于其果皮，而其柑肉由于味酸籽多，且去皮后不耐存放而被隨意丟棄，不僅造成了極大的資源浪費(fèi)，也對(duì)環(huán)境造成了污染[3]。調(diào)查研究證實(shí)，新會(huì)柑果肉亦含豐富的活性成分，如黃酮、多糖、酚類、氨基酸等[4]，仍具有較高的利用價(jià)值。

酵素是一種功能性微生物產(chǎn)品，通常以水果為原料，經(jīng)過一種或多種有益菌發(fā)酵而成，不僅保留了水果原有的礦物質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)成分，還含有多種微生物次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗菌消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、修復(fù)機(jī)體損傷等功效，受到廣泛關(guān)注[5-6]。近年來我國學(xué)者開始重視酵素食品的研究與開發(fā)，并在從多個(gè)方面進(jìn)行了廣泛研究。研究結(jié)果表明，葡萄、蘋果、藍(lán)莓、枸杞、草莓酵素在發(fā)酵過程中抗氧化性能總體呈上升趨勢(shì)，且抗氧化活性與酚類物質(zhì)含量增加相關(guān)性較大[7-10]。紅茶菌酵素對(duì)小鼠免疫功能有正向調(diào)節(jié)功能，可以顯著提高IL-1和IL-2活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞的殺傷活性[11]。天然酵素運(yùn)動(dòng)飲料對(duì)小鼠增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力和消除疲勞具有一定的積極作用[12]。天麻酵素可通過調(diào)節(jié)小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及氧化應(yīng)激水平來達(dá)到鎮(zhèn)靜催眠作用[13]。而發(fā)酵枸杞汁在緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝方面也具有有益效果[14]。因此，將新會(huì)柑果肉開發(fā)利用，制備新會(huì)柑酵素，對(duì)豐富新會(huì)柑加工形式，實(shí)現(xiàn)其高值化利用具有重要意義。

目前，酵素的生產(chǎn)方式仍舊以傳統(tǒng)發(fā)酵為主，但因發(fā)酵周期長，且易受環(huán)境微生物、發(fā)酵體系和氣候條件因素所限制，影響了酵素產(chǎn)品的開發(fā)與利用。因此對(duì)于酵素的研究重點(diǎn)主要集中于接種發(fā)酵。酵素食品中微生物種類繁多，其優(yōu)勢(shì)微生物主要集中在酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等，這些微生物之間協(xié)同作用，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味和活性物質(zhì)產(chǎn)生起到重要作用[15]。其中乳酸菌發(fā)酵可以產(chǎn)生易于人體吸收的氨基酸和乳酸等物質(zhì)，有利于人體消化和促進(jìn)腸道健康；酵母菌可以產(chǎn)生醇類物質(zhì)，并與有機(jī)酸結(jié)合，促進(jìn)并豐富酵素的風(fēng)味體系。楊立啟[16]探究了不同乳酸菌種發(fā)酵體系中柑橘全果汁的抗氧化活性和生物活性物質(zhì)的變化規(guī)律，并證實(shí)植物乳桿菌是最佳的乳酸菌發(fā)酵菌種。在發(fā)酵過程中，適量酵母菌的存在可產(chǎn)生醇類物質(zhì)，該類物質(zhì)與有機(jī)酸結(jié)合可促進(jìn)多種特征風(fēng)味物質(zhì)的形成。因此在酵素制備過程中常會(huì)使用乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵處理[17]。但在不同酵母菌在發(fā)酵對(duì)酵素品質(zhì)的影響尚缺乏文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)室前期從藏靈菇中分離得到三株不同的生香酵母，本研究則比較了這三株酵母菌種與植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵對(duì)新會(huì)柑酵素有機(jī)酸、活性物質(zhì)含量和抗氧化性能的影響，為新會(huì)柑的綜合性開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新會(huì)柑 廣東江門新寶堂生物科技有限公司提供；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum（Picp-2））、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae（Sc））、單胞釀酒酵母（Kazachstania unispora（Ku））、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus（Km）） 由本實(shí)驗(yàn)室提供；MRS肉湯培養(yǎng)基、酵母提取物、大豆蛋白胨、福林酚、沒食子酸 北京索萊寶科技有限公司；ABTS 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；過二硫酸鉀、苯酚、葡萄糖 國藥集團(tuán)；總SOD測(cè)定試劑盒（WST-1） 南京建成生物工程研究所；植物γ-氨基丁酸（GABA）ELISA試劑盒 江蘇晶美生物科技有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌器 重慶雅瑪拓科技有限公司；潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)限公司；高速冷凍離心機(jī)Eppendorf公司；全波長酶標(biāo)分析儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；恒溫水浴鍋 北京中興儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 酵母菌：將菌種接種于YPD固體培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中充分活化，連續(xù)傳代3次，并以2%的比例接種至200 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)20 h，使菌種活菌數(shù)在 1.0×107CFU/mL以上。

乳酸菌：將菌種接種于MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中充分活化，連續(xù)傳代3次，并以2%的比例接種至200 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)18 h，使菌種充分活化至活菌數(shù)在1.0×109CFU/mL以上。

1.2.2 新會(huì)柑酵素的制備 新會(huì)柑→去皮→打漿→加糖→裝瓶→殺菌→接種消毒封口→發(fā)酵→過濾→酵素

操作要點(diǎn)：將去皮后的新會(huì)柑果漿進(jìn)行破碎打漿處理，加入5%（w/v）赤糖，以200 mL/瓶的規(guī)格分裝在滅菌后的發(fā)酵瓶中，80 ℃巴氏殺菌處理20 min，接種果漿體積5%乳酸菌后，消毒封口，并置于35 ℃培養(yǎng)箱中恒溫靜置發(fā)酵48 h。隨后，分別以果漿體積的1%接種三種不同酵母菌種，于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫靜置發(fā)酵96 h，發(fā)酵過程中，每隔24 h取樣一次。將所去新會(huì)柑酵素樣品離心（9000 r/min，10 min，10 ℃），除去肉眼可見殘?jiān)吹眯聲?huì)柑酵素原液，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)方法

1.2.3.1 酵母活菌數(shù)檢測(cè) 分別于酵母菌接種的第0、1、2、3、4 d進(jìn)行取樣，3000 r/min離心 5 min去除大量殘?jiān)?，梯度稀釋，?00 μL上清液涂布于含有100 mg/mL氨芐的YPD固體平板上。30 ℃避光培養(yǎng)48 h后，平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)其活菌數(shù)。

1.2.3.2 總糖含量的檢測(cè) 參照GB/T 5009.7-2016中方法，采用菲林試劑直接滴定法分析不同酵母發(fā)酵過程中總糖含量的變化規(guī)律。

1.2.3.3 總酸含量和pH的測(cè)定 總酸含量的測(cè)定：參照GB/T 12456-2008中方法，采用酸堿滴定法檢測(cè)不同酵母發(fā)酵過程中新會(huì)柑酵素的總酸含量。 根據(jù)滴定樣品稀釋液消耗的NaOH溶液量，計(jì)算樣品中的總酸含量（乳酸當(dāng)量）。

利用酸度計(jì)直接測(cè)定新會(huì)柑酵素發(fā)酵液的pH。

1.2.3.4 生物活性物質(zhì)檢測(cè) 粗多糖含量的檢測(cè)：參照SN/T 4260-2015測(cè)定酵素中的粗多糖的總含量。

總黃酮含量檢測(cè)：參照GB/T 12143-2008附錄G中方法測(cè)定酵素中總黃酮的含量。

總多酚含量檢測(cè)：參照GB/T 31740.2-2015附錄A中方法測(cè)定酵素中總多酚的含量

GABA含量檢測(cè)：采用植物γ-氨基丁酸（GABA）ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.5 特征性有機(jī)酸含量的測(cè)定 參GB 5009.157-2016《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》的方法，采用HPLC法檢測(cè)不同酵母發(fā)酵所產(chǎn)酵素中有機(jī)酸含量。

待測(cè)樣品的預(yù)處理：取新會(huì)柑酵素樣品，用無菌水稀釋至一定的倍數(shù)，將稀釋液通過孔徑0.22 μm的濾膜，透過液備用。

1.2.3.6 抗氧化能力測(cè)定 DPPH自由基清除能力的測(cè)定：配制并吸取濃度為 0、2、4、6、8、10 μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，加入1 mL DPPH的乙醇溶液（0.2 mmol/L），混合后靜放 30 min（常溫避光），在517 nm波長下測(cè)定相應(yīng)的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同處理酵素樣品稀釋后，分別吸取1 mL，加入1 mL DPPH的乙醇溶液（0.2 mmol/L），混合后靜放30 min（常溫避光），517 nm測(cè)吸光值。每個(gè)樣品測(cè)3次平行。DPPH自由基清除能力以每毫升VC含量等價(jià)物來表述，通過VC標(biāo)曲回歸方程計(jì)算。

超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定：在10 mL試管中加入 5.7 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH8.2），加入0.2 mL樣品進(jìn)行混合之后放置在25 ℃保溫箱中，10 min 后取出，再加 0.1 mL（10 mmol/L）鄰苯三酚溶液（已預(yù)熱），快速混勻后用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定320 nm波長1 min內(nèi)吸光值的增加值（Aj），線性范圍內(nèi)算出每1 min吸光度的增加值，另取如上試劑，用等體積水替代樣品，測(cè)定在320 nm波長下，1 min內(nèi)吸光度的增加值（Ai）。

羥基自由基（·OH）清除能力測(cè)定：羥基自由基（·OH）清除測(cè)試方法參照文獻(xiàn)[18]反應(yīng)方法，在試管中依次加入硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）、過氧化氫溶液（6 mmol/L）、樣品各2 mL后靜放置10 min，之后再加入2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L），靜放 30 min后在510 nm處測(cè)定吸光度A0，用蒸餾水代替樣品溶液同樣處理，測(cè)定吸光值A(chǔ)x。

ABTS＋自由基清除力的測(cè)定：0.2 mL 7.4 mmoL/L ABTS 與 0.2 mL 2.6 mmoL/L K2S2O8混合，在室溫條件黑暗處反應(yīng)12 h，反應(yīng)完成后用95%乙醇（pH7.4磷酸鹽緩沖液，95%乙醇或甲醇）稀釋40～50倍，使得混合液在734 nm光度下吸收值處于0.68～0.72（工作液）。

配制并吸取濃度為 0、4、8、12、16、20 μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)液0.2 mL于2 mL離心管中，加入0.8 mL稀釋后的工作液，混合均勻后靜置反應(yīng)6～8 min，迅速測(cè)定734 nm波長處的吸光值。對(duì)以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同處理酵素樣品稀釋后，分別吸取0.2 mL，加入0.8 mL稀釋后的工作液，混合均勻后靜置反應(yīng)6～8 min，迅速測(cè)定734 nm波長處的吸光值。每個(gè)樣品測(cè)3次平行。ABTS清除能力以每毫升VC含量等價(jià)物來表述，通過VC標(biāo)曲回歸方程計(jì)算。

總還原力的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[19]的方法略作修改[19]，準(zhǔn)確移取不同的樣品溶液1.0 mL，隨即快速加入2.5 mL的PBS緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液。將混合溶液置于恒溫水浴中50 ℃孵育20 min，取出后加入2.5 mL 10% TCA，反應(yīng)溶液產(chǎn)生渾濁，將反應(yīng)溶液室溫下以3500 r/min離心12 min，吸取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL后，再加入0.5 mL的三氯化鐵溶液（0.1%），搖勻后靜置10 min。使用多功能酶標(biāo)儀在700 nm下測(cè)得反應(yīng)物的吸光值，空白以蒸餾水代替樣品液，吸光值和還原能力成正比。

SOD的測(cè)定：SOD活性利用WST-1法使用南京建成檢測(cè)試劑盒進(jìn)行酵素總SOD活力測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0對(duì)本文數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每組重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 新會(huì)柑酵素發(fā)酵過程中酵母菌落數(shù)變化

通過不同發(fā)酵時(shí)間酵母菌落數(shù)可以直觀了解不同種類酵母在新會(huì)柑發(fā)酵液中的生長情況。在發(fā)酵過程中酵母菌利用發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長代謝，由圖1可知釀酒酵母、單胞釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母在乳酸菌發(fā)酵2 d后的新會(huì)柑發(fā)酵液中均可以正常生長，菌落數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸增加。發(fā)酵前期酵母菌生長快速但菌濃度差異不顯著，隨著發(fā)酵液中物質(zhì)不斷消耗，有機(jī)酸含量增加，酵母菌生長速度放緩，并出現(xiàn)顯著差異。如圖1所示，發(fā)酵后期單胞釀酒酵母活菌數(shù)僅為5.54×106CFU/mL，明顯低于釀酒酵母（8.57×106CFU/mL）和馬克斯克魯維酵母（7.93×106CFU/mL）。由此可見，單胞釀酒酵母的耐酸性較弱，在新會(huì)柑酵素中的增殖能力相對(duì)較低。

圖1 新會(huì)柑酵素復(fù)合發(fā)酵過程中酵母生長動(dòng)態(tài)Fig.1 Dynamics of yeast growth during the combined fermentation of Xinhui citrus ferment

2.2 不同酵母菌種發(fā)酵對(duì)新會(huì)柑酵素總糖、pH和總酸含量的影響

糖類物質(zhì)作為微生物發(fā)酵過程中的主要碳源，通過總糖含量變化分析微生物生長和代謝狀況。由圖2可知，在酵母菌發(fā)酵的前72 h，總糖濃度呈顯著（P＜0.05）下降的趨勢(shì)，說明此階段微生物的生長比較旺盛，糖類物質(zhì)主要用于其增殖和合成代謝。此后，隨著發(fā)酵液酸度的增加、菌種老化和發(fā)酵環(huán)境變差等原因，菌落總數(shù)趨于平緩，對(duì)糖的需求量降低，因此在發(fā)酵后期釀酒酵母、單胞釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母發(fā)酵液中的總糖含量分別降至0.83±0.02、0.81±0.01、0.81±0.01 g/100 g，并趨于穩(wěn)定。該結(jié)果表明在酵母接種發(fā)酵3 d后，基本可達(dá)到完全發(fā)酵。同時(shí)，四種處理?xiàng)l件下新會(huì)柑發(fā)酵液中總糖下降趨勢(shì)基本一致，可見乳酸菌為新會(huì)柑酵素制備過程中的主要優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌。

圖2 新會(huì)柑酵素復(fù)合發(fā)酵過程中總糖含量變化Fig.2 Changes of total sugar content in Xinhui citrus combined fermentation

pH可以反映發(fā)酵過程的異常情況，總酸同樣表明發(fā)酵過程中微生物的代謝變化情況。乳酸菌發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物為乳酸，本文以乳酸為對(duì)照，得到新會(huì)柑酵素酵母發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的總酸含量變化趨勢(shì)。由圖3可知，新會(huì)柑發(fā)酵初期，乳酸菌快速定殖并進(jìn)行生長代謝，產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物（如乳酸和乙酸等有機(jī)酸），使得pH從初始的3.96迅速下降至3.32。而在接入酵母菌后，其pH不再呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并維持相對(duì)穩(wěn)定，且不同酵母菌種接種發(fā)酵的新會(huì)柑發(fā)酵液pH無明顯差異。但其總酸含量卻隨著發(fā)酵時(shí)間的延長不斷增加，其中釀酒酵母接種后總酸含量從初始的15.99±0.23 g/kg增加至19.65±0.69 g/kg，馬克斯克魯維酵母接種后總酸含量從初始的15.96±0.27 g/kg增加至19.92±0.29 g/kg，單胞釀酒酵母接種后總酸含量則從初始的15.98±0.07 g/kg增加至19.26±0.24 g/kg，低于前兩種酵母處理發(fā)酵液（圖4）。該結(jié)果與酵母菌活菌數(shù)增長趨勢(shì)相一致，表明在新會(huì)柑的發(fā)酵過程中總酸含量的差異性與酵母菌的生長代謝能力有一定的相關(guān)性。

圖3 新會(huì)柑酵素復(fù)合發(fā)酵過程中pH變化Fig.3 Changes of pH in Xinhui citrus combined fermentation

圖4 新會(huì)柑酵素復(fù)合發(fā)酵過程中總酸含量變化Fig.4 Changes of total acid in Xinhui citrus combined fermentation

2.3 不同酵母菌種發(fā)酵對(duì)特征有機(jī)酸含量的影響

有機(jī)酸是新會(huì)柑中重要的營養(yǎng)成分，對(duì)風(fēng)味和口感的形成具有重要意義。本文主要以酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸為研究對(duì)象，通過HPLC對(duì)不同酵母菌種發(fā)酵體系中新會(huì)柑酵素的有機(jī)酸含量進(jìn)行了比較分析。由圖5可知，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后新會(huì)柑酵素乳酸和乙酸是變化最明顯的兩種有機(jī)酸。其中植物乳桿菌與釀酒酵母、單胞釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母復(fù)合發(fā)酵處理的新會(huì)柑酵素乳酸含量分別為新會(huì)柑原漿的4.32倍、4.23倍和4.36倍。乙酸含量在新會(huì)柑原漿中含量極低，但發(fā)酵后則分別增加至 1.57±0.21、1.65±0.35、1.67±0.16 g/kg。但不同發(fā)酵處理?xiàng)l件下乳酸和乙酸含量差異不顯著。檸檬酸是柑橘果實(shí)有機(jī)酸的主要成分，占總有機(jī)含量的70%～90%。本研究中發(fā)現(xiàn)單胞釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母發(fā)酵的新會(huì)柑酵素中，檸檬酸含量分別降低10.61%和14.25%，而釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵與植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵新會(huì)柑酵素中檸檬酸含量與發(fā)酵前差異不顯著。該結(jié)果證實(shí)單胞釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母具有一定的降解檸檬酸能力。此外，研究結(jié)果也證實(shí)，酒石酸、蘋果酸在新會(huì)柑發(fā)酵后略有增加，而琥珀酸發(fā)酵后略有降低，但其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。

圖5 不同發(fā)酵體系中新會(huì)柑酵素特征有機(jī)酸含量比較分析Fig.5 Comparative analysis of organic acid content in different fermentation systems of Xinhui citrus ferment

2.4 不同酵母菌種發(fā)酵對(duì)新會(huì)柑酵素活性物質(zhì)含量的影響

柑橘全果汁中存在著大量的酚酸、類黃酮、粗多糖、γ-氨基丁酸等活性物質(zhì)[20]，因此本研究對(duì)不同酵母發(fā)酵新會(huì)柑酵素中活性物質(zhì)含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖6（A）所示。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后的新會(huì)柑酵素中粗多糖含量極顯著下降（P＜0.01)，可能是由于乳酸菌在代謝過程中將粗多糖分解利用或者轉(zhuǎn)化所致，但菌種間的代謝會(huì)相互影響。本研究中發(fā)現(xiàn)釀酒酵母、單胞釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系的粗多糖代謝能力相當(dāng)，發(fā)酵完成后粗多糖含量分別為3.12和3.54 g/kg。而馬克斯克魯維酵母卻可以抑制植物乳桿菌對(duì)多糖的代謝，該體系發(fā)酵后粗多糖可達(dá)4.37 g/kg，顯著高于釀酒酵母菌、單胞釀酒酵母發(fā)酵的粗多糖含量（P＜0.05），可能由于馬克斯克魯維酵母具有一定的產(chǎn)多糖能力所致。

圖6 不同發(fā)酵體系中新會(huì)柑酵素活性物質(zhì)含量比較Fig.6 Comparison of bioactive substance content in different fermentation systems of Xinhui citrus ferment

由圖6（B）可知，發(fā)酵后新會(huì)柑酵素中總黃酮含量顯著增加（P＜0.05），其中乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵總黃酮含量可提高5.8%，而釀酒酵母、單胞釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母復(fù)合體系發(fā)酵后總黃酮含量分別可提高15.14%、38.73%、20.36%。其主要是由于發(fā)酵微生物分泌的糖苷酶將不溶性膳食纖維結(jié)合的黃酮釋放形成水溶性黃酮所致。由此可見，添加酵母可以顯著提高水溶性黃酮的含量（P＜0.05），且單胞釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系分泌的糖苷酶更有利于新會(huì)柑黃酮的釋放。

發(fā)酵過程中果蔬某些成分經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化和化合物解聚會(huì)導(dǎo)致總酚含量的增加[21]。從圖6（C）可以發(fā)現(xiàn)，四種新會(huì)柑發(fā)酵液總酚含量均顯著高于未發(fā)酵新會(huì)柑果汁（P＜0.05），且不同酵母菌種發(fā)酵處理間無顯著差異。

γ-氨基丁酸是柑橘中一類重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有調(diào)整血壓、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、減少中性脂肪、治療癲癇、增強(qiáng)動(dòng)物采食能力等生物活性[22]。對(duì)不同酵母發(fā)酵新會(huì)柑酵素中γ-氨基丁酸含量進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵處理后發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量顯著增加（P＜0.05）。其中植物乳桿菌與馬克斯克魯維酵母復(fù)合發(fā)酵新會(huì)柑酵素中γ-氨基丁酸含量最高，可達(dá)82.85 mg/kg，顯著高于植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵及其與釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系所制備的新會(huì)柑酵素（P＜0.05）。由此可見，該發(fā)酵體系更有利于酵素溶液中γ-氨基丁酸的富集。

2.5 不同酵母菌種發(fā)酵新會(huì)柑酵素抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)

本研究以SOD活力、DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力和總還原力來表征不同酵母菌種復(fù)合發(fā)酵體系對(duì)新會(huì)柑酵素體外抗氧化能力的影響[7]。SOD是所有生物在有氧條件下對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的第一道防線[23]，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量超氧陰離子自由基，延緩衰老，提高機(jī)體免疫力。由圖7可知，無論是單菌還是混菌發(fā)酵后新會(huì)柑發(fā)酵液中SOD活力均有所提高，分別可達(dá) 149.08、155.03、165.33、161.62 U/mL，顯著高于發(fā)酵前（124.69 U/mL）（P＜0.05）。此外，不同處理間進(jìn)行比較后可發(fā)現(xiàn)單胞釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系和馬克思克魯維酵母復(fù)合發(fā)酵體系制備新會(huì)柑酵素SOD活力顯著高于植物乳桿菌單菌發(fā)酵體系（P＜0.05）。而釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系中SOD活力也有一定提高，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異，該現(xiàn)象可能與不同復(fù)合菌發(fā)酵體系中SOD酶種類與活性不同有一定的相關(guān)性。

圖7 不同發(fā)酵體系中新會(huì)柑酵素抗氧化性能比較Fig.7 Comparison of antioxidant activity of enzyme in different fermentation systems of Xinhui citrus ferment

發(fā)酵后新會(huì)柑酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力均有所提高，以VC含量計(jì)算，與未發(fā)酵新會(huì)柑相比，植物乳桿菌單菌發(fā)酵與添加釀酒酵母、單胞釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母復(fù)合發(fā)酵后分別可提高5.12%、4.84%、6.61%、7.42%，有極顯著性差異（P＜0.01）。此外，不同酵母發(fā)酵方式處理后，新會(huì)柑發(fā)酵液DPPH的增長趨勢(shì)與發(fā)酵液中的總酚含量變化趨勢(shì)相似，可見清除DPPH自由基的能力與酚酸類化合物之間有一定的相關(guān)性。該結(jié)果與草莓酵素的相關(guān)研究結(jié)果具有一致性[10]。

除DPPH自由基外，ABTS+自由基同樣可用于評(píng)估體外抗氧化活性，在生物制品抗氧化活性的判定中具有較好的應(yīng)用[9]。對(duì)不同發(fā)酵體系新會(huì)柑酵素的ABTS+自由基清除能力進(jìn)行了測(cè)定，并以VC含量計(jì)，結(jié)果表明深度發(fā)酵后，新會(huì)柑酵素仍可維持較高的ABTS+自由基清除能力，但與未發(fā)酵前相比仍呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。其中馬克斯克魯維酵母發(fā)酵體系下降最為顯著（P＜0.05），可達(dá)7.61%；單胞釀酒酵母發(fā)酵體系次之，為6.71%；而釀酒酵母發(fā)酵體系下降最小，僅為5.69%。楊立啟[16]研究了不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)柑橘全果汁抗氧化活性的影響后發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致柑橘果汁ABTS+自由基清除能力顯著下降，與本研究結(jié)果基本一致。多糖具有良好的抗氧化功能，但發(fā)酵后新會(huì)柑粗多糖含量顯著降低（P＜0.05），這可能是新會(huì)柑酵素是 ABTS+自由基清除力下降的原因之一。

羥基自由基是人體內(nèi)常見的自由基之一，可以破壞紅細(xì)胞，對(duì)DNA、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)造成危害[24]。隨著發(fā)酵的深入，不同發(fā)酵體系下新會(huì)柑酵素的羥自由基清除能力也發(fā)生了較為顯著的變化（P＜0.05）。其中馬克斯克魯維酵母發(fā)酵體系中新會(huì)柑酵素羥基自由基清除率顯著升高至82.48%（P＜0.05），而釀酒酵母發(fā)酵體系和單胞釀酒酵母發(fā)酵體系中新會(huì)柑酵素羥基自由基清除率則分別下降至73.91%和74.15%（P＜0.05）。由此可見，新會(huì)柑酵素羥自由基清除能力的變化因發(fā)酵菌種體系而異。

超氧陰離子自由基是一種活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，過量產(chǎn)生可加速機(jī)體衰老速度。由圖7可知，未發(fā)酵的新會(huì)柑果汁超氧陰離子自由基清除率極低，但經(jīng)不同發(fā)酵體系處理后其清除力均有極顯著提高（P＜0.01），其中釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系清除力最高，可至13.82%，而植物乳桿菌單菌發(fā)酵體系則為13.09%，均極顯著高于馬克斯克魯維酵母發(fā)酵體系的 8.81%（P＜0.01）。

還原力亦為評(píng)估體外抗氧化活性的另一重要方法。在一定范圍內(nèi)，還原力越大，抗氧化活性越好。相較而言，還原力是一個(gè)更綜合性抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)，與多種抗氧化機(jī)制有關(guān)，包括過多金屬離子型的催化劑、結(jié)合自由基的清除、過氧化物的分解反應(yīng)等，可以綜合反映樣品的體外抗氧化水平[25]。對(duì)不同發(fā)酵體系的總還原力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明發(fā)酵后新會(huì)柑酵素的總還原力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），依據(jù)總還原力大小依次為：植物乳桿菌單菌發(fā)酵體系＜釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系＜單孢釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵體系＜馬克斯克魯維酵母復(fù)合發(fā)酵體系，其吸光度分別為0.738、0.765、0.831、1.094。由此可見馬克斯克魯維酵母體系發(fā)酵新會(huì)柑酵素體外抗氧化綜合指標(biāo)最高。

3 結(jié)論

本文主要探究了不同酵母菌與植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵對(duì)新會(huì)柑酵素品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)在不同新會(huì)柑發(fā)酵體系中，pH、總糖、總酸含量和有機(jī)酸組成差異不顯著；但其生物活性物質(zhì)含量和抗氧化水平卻有較大差異。結(jié)果表明發(fā)酵7 d后，新會(huì)柑酵素中總黃酮、總酚和γ-氨基丁酸的含量均有顯著提高（P＜0.05）。其中在馬克斯克魯維酵母與植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵體系中粗多糖和γ-氨基丁酸在含量均顯著高于其它三種發(fā)酵體系（P＜0.05），而其總黃酮含量也高達(dá)1.336 g/kg，僅次于單胞釀酒酵母與植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵體系。在抗氧化功效方面，發(fā)酵后新會(huì)柑酵素的SOD活力、DPPH自由基清除力、超氧陰離子自由基清除力和總還原力均有顯著提高（P＜0.05）。通過不同發(fā)酵體系中發(fā)酵液抗氧化水平比較分析，證實(shí)馬克斯克魯維酵母與植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵體系中羥自由基清除力和總還原力均顯著強(qiáng)于其它發(fā)酵體系（P＜0.05）。由此可見，馬克斯克魯維酵母發(fā)酵體系制備的新會(huì)柑酵素在活性物質(zhì)含量和抗氧化功效方面均強(qiáng)于釀酒酵母和單胞釀酒酵母體系。不同乳酸菌和酵母在發(fā)酵過程中可以形成不同的微生態(tài)環(huán)境，菌種間的相互作用控制著產(chǎn)品的風(fēng)味特點(diǎn)、生物活性成分和保健特性。因此，對(duì)新會(huì)柑酵素中乳酸菌與酵母菌的協(xié)同生長代謝機(jī)理仍有待進(jìn)一步分析。本研究可為高品質(zhì)新會(huì)柑酵素產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)參考，為新會(huì)柑柑肉的高值化開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，并有利于當(dāng)?shù)仃惼ぎa(chǎn)業(yè)的發(fā)展。