黃 輝， 徐列明,3， 平 鍵， 周 揚(yáng)

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所， 上海 201203；3 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203；4 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腦科學(xué)研究所， 上海 201203 5 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 治未病中心， 上海 200437

肝纖維化是許多慢性肝病，包括慢性乙型肝炎和丙型肝炎、酒精濫用、膽道梗阻、自身免疫性疾病、遺傳性血液色素沉著癥和非酒精性脂肪性肝病等[1]伴隨的病理變化。肝纖維化最終可導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。為了降低肝硬化和肝癌的病死率, 逆轉(zhuǎn)肝纖維化是十分必要的[2]。對(duì)肝纖維化的治療與研究在現(xiàn)階段仍處于十分重要的地位。

肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活是肝纖維化產(chǎn)生的中心事件。肝纖維化是傷口愈合過(guò)程異常的原因，導(dǎo)致HSC不斷活化，肝臟瘢痕組織形成。而免疫系統(tǒng)特別是T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子參與了HSC的活化和凋亡的調(diào)控。其中T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答涉及CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞, 主要通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(lèi)分子識(shí)別感染細(xì)胞上的病毒抗原[3-4]。許多針對(duì)HBV的治療性疫苗和免疫治療策略, 主要集中于如何誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，尤其是涉及特定T淋巴細(xì)胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，因此，確定HBV特異性效應(yīng)CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)HBV感染控制的影響至關(guān)重要。為了更確切地揭示扶正化瘀方抗肝纖維化的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，本文研究經(jīng)扶正化瘀方干預(yù)后小鼠肝臟CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)HSC的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6NCrl Vr小鼠，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0011]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2014-0008。予以普通飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 四氯化碳(CCl4)和橄欖油均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。扶正化瘀方干粉，批號(hào)：180308，由上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司提供。將分析純級(jí)別的CCl4與橄欖油按照1∶9比例混合，配制成濃度為10%的CCl4混合溶液。RPMI-1640，Hyclone；高糖DMEM培養(yǎng)基(1×)，Corning；胎牛血清(FBS)，Corning；PercollTM，GE Healthcare公司；Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc BlockTM)、FITC Hamster Anti-Mouse CD3e、BV421 Rat Anti-Mouse CD45、PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse CD4、APC Rat Anti-Mouse CD8a、PE-CF594 Hamster Anti-Mouse CD28，均購(gòu)自BD公司；Cell to cDNA Kit PLUS、2×SYBR Green qPCR Mix，EZ Bioscience公司。BSA，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5]制備扶正化瘀方藥物血清。

1.3 主要儀器 生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司；小型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；低溫高速離心機(jī)，JOUAN公司；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、cDNA逆轉(zhuǎn)錄儀，BIO-RAD公司；PCR擴(kuò)增儀，ABI公司；流式細(xì)胞分選儀(型號(hào)：BD FACSAriaTM Cell Sorter)，BD公司。

1.4 造模 參照文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)模型小鼠給予10%的CCl4腹腔注射12 h，制備急性肝損傷模型。

1.5 分組及干預(yù) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將18只C57雄性小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、扶正化瘀方組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。扶正化瘀方組提前給予扶正化瘀方灌胃5 d。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1天晚上給予模型組和扶正化瘀方組小鼠濃度為10%的CCl4，以2 mL/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射。染毒12 h后，2%戊巴比妥麻醉，腹主靜脈取血，無(wú)菌條件下，摘取肝臟用于病理觀察和淋巴細(xì)胞分選。之后行流式細(xì)胞分選術(shù)。小鼠肝星狀細(xì)胞株(JS 1)以10%血清培養(yǎng)，之后與CD8+T淋巴細(xì)胞以2∶1比例培養(yǎng)于96孔板中，重復(fù)3批。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法 (1)使用微板法檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST含量。(2)將小鼠肝組織在10%中性甲醛中浸泡固定48 h后逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，56 ℃石蠟包埋，4 μm厚切片，用于HE染色，光鏡下觀察。(3)qPCR檢測(cè)JS 1中纖維狀膠原蛋白Ⅰ(Collagen type Ⅰ，Col.Ⅰ) mRNA和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-SMA) mRNA的表達(dá)(表1)。按照EZ BioscienceTMqPCR SYBR Green Master Mix Protocol試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。(4)使用美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀(BD FACSAriaTMCell Sorter)無(wú)菌分選小鼠肝臟中CD8+T淋巴細(xì)胞。

表1 qPCR引物列表

1.7 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，倫理審查號(hào)：PZSHUTCM190301014，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 CCl4急性造模后各組小鼠肝臟病理觀察 HE染色顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇無(wú)充血、出血，肝細(xì)胞排列整齊、形成肝板，門(mén)靜脈周?chē)皡R管區(qū)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞變性壞死。模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞多胞漿疏松、水樣變性，散在氣球樣變，見(jiàn)灶性壞死。扶正化瘀方組小鼠肝細(xì)胞變性、壞死程度較模型組有所減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠肝臟病理光鏡觀察(HE染色)

2.2 CCl4急性造模后各組小鼠血清ALT和AST水平變化 模型組的ALT和AST水平均顯著高于正常組(P值均<0.000 1)，經(jīng)扶正化瘀方預(yù)防用藥5 d的扶正化瘀方組ALT升高的幅度明顯小于模型組(P<0.001)(圖2)。

圖2 各組小鼠血清ALT和AST水平變化

2.3 各組肝臟相關(guān)細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞比例 3組間總淋巴細(xì)胞、CD45、CD4-CD8+T、CD8+CD28-T比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)(表2)。

表2 各組肝臟相關(guān)細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞比例

2.4 JS 1與CCl4急性肝損傷小鼠肝臟CD8+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24 h及48 h后α-SMA mRNA、Col.ⅠmRNA的表達(dá)變化

2.4.1 α-SMA mRNA 對(duì)照組(JS 1單培養(yǎng))、正常組(JS 1與正常小鼠肝臟的CD8+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng))、模型組(JS 1與CCl4急性肝損傷小鼠肝臟的CD8+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng))、扶正化瘀方組(經(jīng)扶正化瘀方治療的CCl4急性肝損傷小鼠肝臟分離的CD8+T淋巴細(xì)胞與JS 1共培養(yǎng))在24 h時(shí)JS 1表達(dá)α-SMA mRNA相似，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。但是共培養(yǎng)到48 h時(shí)，與對(duì)照組和正常組相比，模型組α-SMA mRNA的表達(dá)均明顯升高(P值均<0.01)。扶正化瘀方組的α-SMA mRNA表達(dá)升高則不明顯，與模型組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。

圖3 JS 1與各組小鼠肝臟CD8+ T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后表達(dá)α-SMA mRNA的變化

2.4.2 Col.Ⅰ mRNA 在共培養(yǎng)24 h時(shí)間點(diǎn)，與模型組相比，扶正化瘀方組的JS 1表達(dá)Col.ⅠmRNA明顯下降(P<0.01)。在共培養(yǎng)到48 h時(shí)，與對(duì)照組和正常組相比，模型組JS 1表達(dá)Col.ⅠmRNA上升明顯(P值均<0.001)；扶正化瘀方組JS 1表達(dá)Col.ⅠmRNA明顯低于模型組和正常組(P值均<0.001)(圖4)。

圖4 JS 1與各組小鼠肝臟CD8+ T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后表達(dá)Col.ⅠmRNA的變化

3 討論

肝纖維化的發(fā)生機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，其中HSC活化和凋亡受到免疫系統(tǒng)的調(diào)控，而細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在造成肝損害方面尤為重要。肝臟富含先天免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、炎癥性單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和自然殺傷T淋巴細(xì)胞, 參與炎癥反應(yīng)[6-7]。肝內(nèi)淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、自然殺傷T淋巴細(xì)胞和黏膜相關(guān)的不變T淋巴細(xì)胞被確定為肝臟先天免疫系統(tǒng)中的重要淋巴細(xì)胞[8-10]。

活化的HSC以表達(dá)α-SMA為標(biāo)志，同時(shí)產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原蛋白, 與肝纖維化相關(guān)的主要是Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白在纖維化肝中明顯增多。Col.Ⅰ的沉積是肝纖維化發(fā)病機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵特征[11]。

扶正化瘀復(fù)方是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，根據(jù)“虛損生積”，即“正虛血瘀”的病機(jī)特點(diǎn)，由丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子(制)6味中藥配伍而成。具有“益精養(yǎng)肝，活血祛瘀”的作用。研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方可以通過(guò)降低炎癥因子的表達(dá)，直接或間接調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用，利于肝臟功能的恢復(fù)。有研究[15]使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)荷瘤昆明小鼠T淋巴細(xì)胞亞群及腫瘤細(xì)胞凋亡開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)扶正化瘀方中中藥成分桃仁的重要化學(xué)組成成分桃仁總蛋白治療后，明顯改善荷瘤小鼠CD4+/CD8+的細(xì)胞失衡狀態(tài), 恢復(fù)機(jī)體正常的免疫狀態(tài), 從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。這些資料均提示，扶正化瘀方可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)來(lái)抗肝纖維化。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)扶正化瘀方進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，在24 h及48 h時(shí)間點(diǎn)，正常組α-SMA、Col.Ⅰ的mRNA表達(dá)變化均不太明顯，這與課題組以往以健康者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞與LX-2共培養(yǎng)和LX-2單培養(yǎng)24 h后的研究結(jié)果趨勢(shì)一致[16]，說(shuō)明正常CD8+T淋巴細(xì)胞并不刺激HSC的活化。

發(fā)生炎癥反應(yīng)的慢性肝炎患者由于肝臟內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞過(guò)度存在，不能清除抗原，致使炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，促使CD8+T淋巴細(xì)胞活化，導(dǎo)致HSC的活化，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[17]。但是一項(xiàng)Meta分析[18]發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細(xì)胞或顆粒酶B產(chǎn)生的增加、CD4+T淋巴細(xì)胞的減少對(duì)濾泡性腫瘤預(yù)后十分有利，且CD8+T淋巴細(xì)胞可能是濾泡性腫瘤良好預(yù)后的標(biāo)志性指標(biāo)。Klametha等[19]對(duì)140例病毒感染和外周T淋巴細(xì)胞瘤患者外周血行流式細(xì)胞術(shù)后發(fā)現(xiàn)，其CD3+、CD8-、CD7-T淋巴細(xì)胞會(huì)反應(yīng)性增加。而在HCV患者經(jīng)過(guò)直接抗病毒藥物治療后，CD8+T淋巴細(xì)胞衰老及功能指標(biāo)有所改善，利于肝纖維化治療[20]。是否因?yàn)椴煌膊≈蠧D8+T淋巴細(xì)胞表型發(fā)生改變，故而其持續(xù)增加在不同疾病中所發(fā)生的作用也不盡相同？那么CD8+T淋巴細(xì)胞在小鼠CCl4急性肝損傷模型中是產(chǎn)生何種作用值得思考。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)C57小鼠預(yù)防給藥扶正化瘀方5 d后再造模，獲得成功。病理觀察提示：經(jīng)扶正化瘀方預(yù)先用藥后，扶正化瘀方組小鼠肝細(xì)胞變性、壞死程度較模型組均有所減輕；對(duì)小鼠血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：扶正化瘀方組小鼠AST水平變化與模型組相似，但是ALT升高的幅度明顯小于模型組，T淋巴細(xì)胞比例降低。以上結(jié)果提示，扶正化瘀方用藥5 d，已顯示保護(hù)肝細(xì)胞的藥效。

將CD8+T淋巴細(xì)胞與JS 1共培養(yǎng)24 h，模型組的CD8+T淋巴細(xì)胞尚未顯示出對(duì)JS 1的明顯影響，但共培養(yǎng)到48 h，其促進(jìn)JS 1活化的作用十分明顯，該組JS 1表達(dá)α-SMA mRNA和Col.Ⅰ mRNA遠(yuǎn)高于對(duì)照組和正常組。說(shuō)明扶正化瘀方預(yù)先給藥5 d能顯著減輕CCl4所致的小鼠急性肝損傷，扶正化瘀方能夠轉(zhuǎn)變肝臟的CD8+T淋巴細(xì)胞，使之由激活HSC促進(jìn)肝纖維化，轉(zhuǎn)變?yōu)橐种艸SC活化，并且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制HSC活化的作用更加顯著，進(jìn)而減緩纖維化進(jìn)程，甚至有可能逆轉(zhuǎn)纖維化。這一結(jié)果與課題組以往研究[21]中，扶正化瘀方有效組患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞能顯著減少共培養(yǎng)的LX-2中α-SMA mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而扶正化瘀方無(wú)效組患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞這種作用不明顯的結(jié)果相一致。扶正化瘀方經(jīng)治小鼠肝臟的CD8+T淋巴細(xì)胞與JS 1共培養(yǎng)48 h，抑制了JS 1的活化，可能是CD8+T淋巴細(xì)胞與共培養(yǎng)的JS 1直接接觸的結(jié)果。此結(jié)果與臨床扶正化瘀方治療有效患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞及其亞群通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，抑制共培養(yǎng)的HSC活化的觀察結(jié)果不一致[16]。

以上研究結(jié)果均提示扶正化瘀方藥物血清可能通過(guò)誘導(dǎo)小鼠肝臟CD8+T淋巴細(xì)胞抑制共培養(yǎng)的JS 1活化，這種抑制作用可能主要不是通過(guò)細(xì)胞因子調(diào)控的，但尚不能明確區(qū)分藥物對(duì)HSC的直接或間接的調(diào)控作用。

囿于現(xiàn)階段分選技術(shù)的限制，如采用流式技術(shù)分選耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)細(xì)胞損傷較大，影響活率和得率；目前市場(chǎng)上無(wú)快捷分離的CD28磁珠試劑盒可在小鼠應(yīng)用，故動(dòng)物實(shí)驗(yàn)暫時(shí)無(wú)法進(jìn)一步研究CD8+T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)HSC的調(diào)節(jié)作用，期待以后能在人肝臟中開(kāi)展后續(xù)研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：徐列明、周揚(yáng)、平鍵負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫(xiě)作思路；黃輝參與收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫(xiě)論文；徐列明、周揚(yáng)負(fù)責(zé)修改論文，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。