轉(zhuǎn)基因玉米深加工產(chǎn)品中DNA 提取方法的研究

王 輝，趙愛君，張全軍

（1.中華人民共和國東營海關(guān)，山東 東營 257091；2.山東吉龍集團(tuán)有限公司，山東 萊陽 265200；3.濰坊工商職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262234）

0 引言

玉米作為糧食、飼料兼用的農(nóng)作物，是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重中之重。中國作為世界第二大玉米生產(chǎn)國，同樣對玉米的需求與日俱增。在耕地面積不變的情況下要增加玉米產(chǎn)量就必須將基因工程引入玉米種植，基因工程在玉米的種植中已經(jīng)得到較成熟的應(yīng)用。近年來，美國及加拿大等地區(qū)都研發(fā)出自己的轉(zhuǎn)基因玉米品種，如Monsanto、Dekalb、Systems 等公司研制的抗除草劑、抗蟲及雄性不育玉米，瑞士的先正達(dá)公司（Syngenta） 成功培育的轉(zhuǎn)Bt 抗蟲甜玉米[1]。與普通深加工食品一樣，轉(zhuǎn)基因玉米在深加工過程中其自身的DNA 也會遭受嚴(yán)重的破壞，伴隨著加工中出現(xiàn)的各種物理、化學(xué)或酶因子等因素，都影響到了DNA 質(zhì)量，因此玉米深加工產(chǎn)品中DNA 的提取技術(shù)就關(guān)乎到后期檢測的可靠性。對玉米深加工產(chǎn)品的DNA 提取技術(shù)進(jìn)行了研究，并對提取的DNA 的質(zhì)量和純度進(jìn)行檢測，從而確定最佳方法，為檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)特別是出入境檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測人員檢測玉米DNA 質(zhì)量提供了極大方便。同時，對檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化也具有十分重要的意義，為以后各種深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的DNA 提取技術(shù)提供很好的技術(shù)保障[2]。

1 試驗(yàn)原理

1.1 DNA 提取的原理

由于DNA 及RNA 在0.14 mol/L 的NaCl 溶液中溶解性不同（前者不能溶解而后者可溶），可將二者從破碎細(xì)胞漿液中進(jìn)行分離。

樣品在破碎過程中，細(xì)胞中的DNA 釋放到提取液中，DNA 因此會被降解而影響得率。由于檸檬酸鹽和EDTA 可抑制酶的活性，同時使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離，因此可將其加入提取液，然后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的陰離子去垢劑SDS，攪拌2 h，也可用氯仿—異戊醇除去蛋白，然后離心除去蛋白質(zhì)，得到核酸上清液。最后用預(yù)冷的95%乙醇將DNA 從已去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的提取液中沉淀出來[3-4]。

1.2 DNA 的分離原理

DNA 的分離采用瓊脂糖凝膠電泳，電泳的驅(qū)動力靠DNA 本身的負(fù)電荷。因?yàn)镈NA 帶負(fù)電荷，所以它會從負(fù)極向正極移動，移動的距離與樣品的分子量有關(guān)。 電泳后樣品極易洗脫，區(qū)帶也很容易染色，從而便于定量測定。將瓊脂糖凝膠制成干膜還能夠長期保存。

1.3 紫外可見分光光度法檢測原理

由于DNA 和RNA 鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)的波長260 nm 處的吸收值有最大吸收峰，因此可以選擇波長260 nm 來測定DNA 或RNA 的光密度OD260，測定值不僅與DNA 或RNA 含量有關(guān)，還與其構(gòu)型不同出現(xiàn)差異。

一般在檢測同一樣品的DNA、RNA 含量時會測定3 個波長下的光密度，分別為OD260，OD280，OD230，然后通過計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。

經(jīng)驗(yàn)證：①純DNA 的OD260/OD280≈1.8（如果<1.6，表明樣品中含有蛋白質(zhì)、酚等污染物；如果>1.9，表明有RNA 污染）；RNA 的OD260/OD280為1.7～2.0（如果<1.7 時表明有蛋白質(zhì)或酚污染；如果2.0 時表明樣品中可能有異硫氰酸殘存）；②純RNA的OD260/OD280≈2.0。當(dāng)OD260/OD280>2時可能被蛋白污染，可以通過增加酚抽提降低測定值；OD260/OD230<2可能與GIT 污染有關(guān)，說明鹽分去除不充分，可通過再次沉淀并用70%的乙醇洗來處理滌。OD260/OD280的比值可用來評估核酸的純度，OD260/OD230用來評估去除鹽分的多少。

2 材料和儀器

2.1 試驗(yàn)材料

玉米片、爆米花，市售。

2.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

可調(diào)式移液器（0.5～10，5～50，20～200，100～1 000 μL），離心管（1.5 mL），藍(lán)、黃、白槍頭，DK-S24 型恒溫水浴鍋，高速離心機(jī)，LDZX-40BI 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，電子天平，冰箱，瓊脂糖凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)分析儀，紫外可見分光光度計(jì)，比色皿等。

2.3 試驗(yàn)試劑

100 g/L CTAB 溶液、β - 巰基乙醇、20 mg/mL蛋白酶K、無水乙醇、70%乙醇、異丙醇、Tris 平衡酚、醋酸銨、5 mol/L 氯化鈉、1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 值8.0）、0.5 mol/L EDTA溶液、苯酚∶氯仿（25∶24，V/V）、氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V）、苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V）、瓊脂糖、雙蒸水、0.25 mol/L HCl溶液、0.25 mol/L NaOH溶液。

CTAB 提取緩沖液（20 g/L）：20g/L CTAB 溶液，1.4 mol/L NaCl溶液，0.1 mol/L Tris-HCl溶液，0.05 mol/L EDTA溶液，pH 值8.0，滅菌后使用。

3×CTAB 提取緩沖液：濃度0.1 mol/L Tris-HCl，25 mmol/L EDTA 溶液，2.5 mol/L NaCl 溶液，2%硫基乙醇溶液，3%CTAB 溶液，pH 值8.0，滅菌后使用。

TE 緩沖液：濃度1 mmol/L EDTA（pH 值8.0），濃度10 mmol/L Tris-HCl（pH 值7.4～8.0），滅菌后使用。

0.5×TBE 溶液：濃度0.045 mol/L Tris- 硼酸溶液，濃度0.001 mol/L EDTA 溶液，滅菌后使用。

3 試驗(yàn)方法

3.1 DNA 提取的試驗(yàn)方法

3.1.1 樣品預(yù)處理

將玉米片和爆米花磨成粉待用。

3.1.2 經(jīng)典CTAB 法

（1） 取4 只1.5 mL 離心管分別編號為1，2，3，4，1 和2 號管加0.1 g 玉米片粉，3 和4 號管加0.1 g爆米花粉，分別加入CTAB 緩沖液600 μL，混勻，然后加入4 μL 的蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻。放入65 ℃的恒溫水浴中加熱60 min，并保持10 min搖勻一次。

（2） 加等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混勻。

（3） 在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min。

（4） 緩慢抽取上清液置于新離心管，加等體積-20 ℃下預(yù)冷異丙醇，緩慢混勻后，室溫靜置30 min。

（5） 在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 再次離心10 min。

（6） 棄去上清液，加入體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇400 μL 洗滌沉淀2～3 次。

（7） 離心管倒置于面巾紙上，自然晾干。

（8） 加入TE 緩沖液50 μL 溶解沉淀，于-20 ℃下保存。

3.1.3 CTAB 法的初步改良

（1） 取4 個1.5 mL 離心管編號1，2，3，4，分別加20 g/LCTAB 緩沖液350 μL，1 和2 號管加0.1 g玉米片粉，3 和4 號管加0.1 g 爆米花粉，再分別加20 g/L CTAB 緩沖液150 μL。

（2） 加入4 μL 蛋白酶K，充分混勻后，放入恒溫水浴鍋中65 ℃下水浴60 min，每10 min 混勻一次。

（3） 分別加入650 μL Tris 平衡酚溶液，顛倒混勻10 min。

（4） 在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min。

（5） 取上層液體置于新離心管，加苯酚∶氯仿（25∶24） 600 μL，顛倒混勻10 min。

（6） 在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min。

（7） 緩慢抽取上清液至新離心管，加入2 倍體積-20 ℃預(yù)冷無水乙醇，緩慢混勻后，于室溫下靜置30 min。

（8） 離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心3 min。

（9） 棄去上清液，用體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇400 μL 洗滌沉淀3 次。

（10） 自然晾干后，加入TE 緩沖液40 μL 溶解沉淀，于-20 ℃保存。

3.1.4 CTAB 法有效改良

（1） 取4 個1.5 mL 離心管編號1，2，3，4，在1 和2 號管加人少量（至1.5 mL 離心管的最小刻度0.1 mL 處） 玉米片粉，3 和4 號管加少量爆米花粉。

（2） 加入65 ℃下預(yù)熱的CTAB 提取緩沖液700 μL，充分振蕩混勻，放入65 ℃恒溫水浴中加熱2 h。

（3） 樣品冷卻至室溫后，加入氯仿∶異戊醇（24∶1） 600 μL，緩慢顛倒混勻約5 min。

（4） 離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速7 500 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中；1 和3 號加入1/2 體積的5 mol/L NaCl，2 和4 號加入NH4Ac 調(diào)整終濃度為10 mmol/L。再加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20 ℃放置30 min。

（5） 以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心3 min，棄去上清液。

（6） 沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗滌1 次，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心3 min，棄去上清液。

（7） 自然晾干后，加入TE 緩沖液50 μL 溶解沉淀，于-20 ℃保存。

3.1.5 煮沸法

（1） 取4 個1.5 mL 離心管編號1，2，3，4，1和2 號管加0.1 g 玉米片粉，3 和4 號管加0.1 g 爆米花粉。

（2） 分別加入0.25 mol/L 的NaOH 溶液100 μL，充分混勻。

（3） 沸水水浴30 s。

（4） 再加入濃度0.25 mol/L 的HCl 溶液100 μL，1 mol/L 的Tris-HCl 50 μL，充分混勻。

（5） 沸水水浴2 min。

（6） 冷卻后，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心12 min。

（7） 將上清液移至新的離心管中，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20 ℃放置30 min。

（8） 以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心3 min，棄去上清液。

（9） 沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗滌1 次，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心3 min，棄上清液。

（10） 自然晾干后，加入TE 緩沖液50 μL 溶解沉淀，于-20 ℃下保存。

3.2 瓊脂糖電泳檢測的試驗(yàn)方法

（1） 凝膠的配制。試驗(yàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的凝膠。稱取0.8 g 瓊脂糖置于錐形瓶中，加入0.5×TBE 100 mL，電爐加熱至瓊脂糖全部融化，混勻備用。

（2） 凝膠的制備。首先，取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的凝膠滴入玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣，使其封好，將內(nèi)槽置于水平位置并將“梳子”放好。其次，將冷卻到70 ℃左右的瓊脂糖凝膠液倒入玻璃板的內(nèi)槽中，使其慢慢展開，直至整個玻璃板表面形成均勻膠層。最后，靜置冷卻至凝膠完全凝固，然后垂直輕拔梳子，添加0.5×TBE 電泳緩沖液至添加了凝膠及內(nèi)槽的電泳槽中，直至沒過膠板為止。

（3） 加樣。在凝膠板上將提取的DNA 樣品和Buffer 混合。用10 μL 微量移液器將樣品加入小槽內(nèi)，一個樣品使用一個加樣頭，以防污染。

（4） 電泳。將加樣后的凝膠板在電壓為60～100 V的電源中進(jìn)行電泳操作，此時樣品的移動方向?yàn)樨?fù)極（黑色） 向正極（紅色），直至溴酚藍(lán)移動到距離凝膠膠板下沿約1 cm 處時，關(guān)閉電源。

（5） 染色與拍照。電泳結(jié)束后，將凝膠板取出，浸入溴化乙錠（EB） 染色約20 min，然后在紫外光照射下使DNA 顯示出條帶，觀察條帶并用紫外分析儀拍照。

3.3 紫外可見分光光度計(jì)檢測的試驗(yàn)方法

（1） 啟動紫外可見分光光度計(jì)，預(yù)熱30 min。（2） 雙蒸水清洗比色皿，并用吸水紙吸干，用雙蒸水做對照。

（3） 設(shè)定狹縫后校零。

（4） 從成像的結(jié)果中選出各方法比較好的樣品，稀釋1 000 倍，記錄編號和稀釋度。

（5） 將盛有待測樣液的比色皿放入樣品室的S架上，關(guān)閉蓋板。

（6） 紫外分光光度計(jì)的波長分別設(shè)定為波長260，280 nm，測定OD 值。

（7） 記錄光密度值并計(jì)算出DNA 濃度和純度。

4 結(jié)果與分析

4.1 瓊脂糖電泳檢測的結(jié)果

4.1.1 經(jīng)典CTAB 法經(jīng)典CTAB 法提取的DNA 測定結(jié)果見圖1。

圖1 經(jīng)典CTAB 法提取的DNA 測定結(jié)果

4.1.2 CTAB 法初步改良

CTAB 法初步改良1 提取的DNA 測定結(jié)果見圖2。

圖2 CTAB 法初步改良1 提取的DNA 測定結(jié)果

4.1.3 CTAB 法有效改良

CTAB 法有效改良1 提取的DNA 測定結(jié)果見圖3。

圖3 CTAB 法有效改良1 提取的DNA 測定結(jié)果

4.1.4 煮沸法

煮沸法提取的DNA 測定結(jié)果見圖4。

圖4 煮沸法提取的DNA 測定結(jié)果

4.2 紫外可見分光光度計(jì)檢測的結(jié)果

玉米片各方法提取DNA 的OD 值測定結(jié)果如下。

經(jīng)典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA的OD 值見表1。

表1 經(jīng)典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA 的OD 值

爆米花各方法提取DNA 的OD 值測定結(jié)果如下。

經(jīng)典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA的OD 值見表2。

表2 經(jīng)典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA 的OD 值

4.3 討論

4.3.1 瓊脂糖電泳結(jié)果討論

由電泳圖明顯可看出，煮沸法遠(yuǎn)不如CTAB 法效果好，說明煮沸法不適合玉米片、爆米花DNA 的提取。由圖1 ～ 圖4 來看，CTAB 有效改良法提取DNA 效果好，幾乎無拖尾現(xiàn)象，而其他CTAB 法效果不好，說明原有的CTAB 法并不適合玉米片、爆米花DNA 提取，在方法上、試劑上都要有很大改進(jìn)，如延長消化反應(yīng)時間、提高提取緩沖液中NaCl含量等。

4.3.2 分光光度計(jì)結(jié)果討論

玉米片：在所有方法中，CTAB 有效改良法提取的DNA 純度比較好，其他方法提取出DNA 的OD 比值均小于1.6，說明有蛋白質(zhì)、酚等污染，產(chǎn)物純度不夠。

爆米花：在所有方法中，CTAB 有效改良法提取的DNA 純度最高，其他方法提取出DNA 的OD比值均小于1.6，說明有蛋白質(zhì)、酚等污染，產(chǎn)物純度不夠。

5 結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果來看，改良的CTAB 法能成功從玉米深加工產(chǎn)品玉米片、爆米花中提出DNA，經(jīng)典CTAB 和初步改良CTAB 法效果都不如有效改良法好，煮沸法不適合玉米片和爆米花DNA 的提取。