吳碧君， 劉小英

(莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 莆田 351144)

大杯蕈(Panusgiganteus)又名巨大革耳、豬肚菇、大杯傘、漏斗菇、大杯香菇等，是一種中高溫型食用菌品種[1]。大杯蕈菌肉肥厚、口感脆爽鮮美，子實(shí)體中富含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等[2-3]，在市面上深受消費(fèi)者喜愛。目前，市面上大杯蕈菌種管理較為混亂，同種異名、異種同名等現(xiàn)象較為普遍，給大杯蕈良種收集選育、資源管理與菌株鑒定帶來(lái)巨大困難。分子生物技術(shù)從DNA水平上分析菌株間的遺傳多樣性，不受食用菌栽培環(huán)境和傳統(tǒng)栽培周期的影響，可以快速高效地分析菌株間的親緣關(guān)系。

其中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat,ISSR)技術(shù)具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[4]，已被應(yīng)用于食用菌菌株鑒定、遺傳多樣性分析、輔助育種等方面[5-9]。高傲等[10]采用ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)22個(gè)雞腿菇菌株的遺傳多樣性進(jìn)行綜合分析，供試雞腿菇菌株在遺傳相似系數(shù)為0.8時(shí)可分為4大類，聚類分析與主坐標(biāo)分析基本一致。楊和川等[11]基于分子標(biāo)記技術(shù)研究了10株杏鮑菇的遺傳多樣性，結(jié)果表明，供試菌株在遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí)可分為3類，且RAPD分析結(jié)果與主成分分析一致。張妍等[12]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合菌絲生長(zhǎng)速度等農(nóng)藝性狀研究20個(gè)金頂側(cè)耳菌株種內(nèi)遺傳多樣性，研究顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.65時(shí)，絕大部分菌株呈現(xiàn)較強(qiáng)的地域性，按照南北方來(lái)源地聚為2類；表型性狀與基因型結(jié)果基本吻合，親緣關(guān)系遠(yuǎn)的菌株農(nóng)藝性狀差異大。表型農(nóng)藝性狀是傳統(tǒng)菌種鑒別方法之一，但極易受到環(huán)境的影響，只能鑒別到屬內(nèi)種間水平[13]，結(jié)合ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)，可以提供更準(zhǔn)確的遺傳多樣性結(jié)果。目前，有關(guān)大杯蕈的研究主要集中在栽培技術(shù)、蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、多糖等活性物質(zhì)的研究[14-16]，針對(duì)大杯蕈遺傳多樣性的研究鮮少報(bào)道?；诖?，本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)計(jì)算遺傳相似系數(shù)、聚類圖，結(jié)合大杯蕈子實(shí)體形態(tài)，分析10個(gè)大杯蕈菌株的遺傳多樣性，以期為大杯蕈菌株鑒定和良種選育等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

10個(gè)供試大杯蕈菌株編號(hào)、來(lái)源如表1所示。

1.1.2 試劑及引物

本試驗(yàn)所用DNA marker、TaqPCR Mix、4s Gel Red染料、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖B、5×TBE、TE緩沖液及ISSR引物均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

表1 供試的10個(gè)大杯蕈菌株

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，定容至1 000 mL，pH值自然。

原種及栽培袋培養(yǎng)基：63%木屑+20%棉籽殼+16%麩皮+1%石灰，原種培養(yǎng)基含水量為50%～55%，栽培種為60%，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生物學(xué)特征測(cè)定方法

在18 mm×180 mm的試管內(nèi)接種供試母種，以活化菌絲體。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，將接種完的供試菌株試管置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察菌絲生長(zhǎng)情況，記錄菌絲顏色。

1.2.2 菌絲體培養(yǎng)及DNA提取

將滅菌玻璃紙鋪入PDA平板，并從活化后的大杯蕈菌株斜面上挑取菌絲塊接種于PDA平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)7～15 d。培養(yǎng)結(jié)束后，刮取平板上活化后的菌絲作為試驗(yàn)材料，采用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA(上海生工生物工程股份有限公司)。提取物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和條件

ISSR-PCR反應(yīng)的總體系為50 μL，反應(yīng)體系為：25 μLTaqPCR Mix，4 μL引物(10 μmol·L-1)，2 μL模板DNA，19 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，45～55 ℃(退火溫度依不同引物而定)退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 電泳和數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。電泳圖譜中在同一水平位置上擴(kuò)增出的強(qiáng)帶或可分辨性好的弱帶，賦值“1”，未擴(kuò)增出條帶，賦值“0”，形成0/1數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大杯蕈菌絲及子實(shí)體形態(tài)特征

對(duì)10個(gè)大杯蕈菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)，并觀察菌絲及子實(shí)體形態(tài)特征(表2)。10個(gè)大杯蕈菌株菌絲顏色均為白色。菌蓋顏色分為淺褐色、褐色；菌柄顏色分為淺褐色、褐色、米白色3種。按菌株的菌蓋和菌柄顏色劃分，除漳州菌株的菌蓋和菌柄顏色不一致(菌蓋為褐色，菌柄為米白色)，其余9個(gè)大杯蕈菌株的菌蓋和菌柄皆為淺褐色或褐色。根據(jù)菌柄類型可分為圓錐形和圓柱形，其中僅T27-1801菌株為圓錐形菌柄。

表2 大杯蕈菌絲及子實(shí)體形態(tài)特征

2.2 大杯蕈菌株ISSR-PCR分析擴(kuò)增結(jié)果

從30條引物中篩選出8條(表3)可以擴(kuò)增出多態(tài)性好、清晰度高條帶的引物，8條引物分別為UBC 809、UBC 816、UBC 817、UBC 818、UBC 856、UBC 857、UBC 878、UBC 888。表3所示，不同引物對(duì)供試菌株的擴(kuò)增條帶多態(tài)性不一樣。引物UBC 857擴(kuò)增出26條條帶，多態(tài)率為96.15%。引物UBC 818擴(kuò)增的多態(tài)率最高，為100%。8條引物對(duì)10個(gè)菌株共擴(kuò)增出的DNA片段大小為200～2 000 bp，共擴(kuò)增出111條條帶，其中多樣性條帶91條，占總帶數(shù)的81.98%，說(shuō)明10個(gè)大杯蕈菌株具有豐富的遺傳多樣性。每條引物對(duì)供試菌株的擴(kuò)增條帶為9～26條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出11條條帶。引物UBC 817和UBC 857對(duì)10個(gè)大杯蕈菌株的擴(kuò)增圖譜見圖1。

表3 不同ISSR引物對(duì)供試大杯蕈菌株的擴(kuò)增結(jié)果

左圖為引物UBC 817，右圖為引物UBC 857；M為D2000 Marker，1～10為菌株編號(hào)。圖1 部分引物擴(kuò)增結(jié)果

2.3 供試菌株遺傳相似性分析

基于ISSR-PCR的擴(kuò)增結(jié)果，采用NTSYSpc 2.10軟件計(jì)算供試菌株間遺傳相似系數(shù)(表4)。結(jié)果顯示，10個(gè)大杯蕈菌株遺傳相似系數(shù)在0.477～0.856，平均遺傳相似系數(shù)為0.730，表明這10個(gè)菌株遺傳關(guān)系較近。菌株JZ007與JZ001相似系數(shù)最小，說(shuō)明T27-1801和壽光這2個(gè)菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；菌株JZ003與JZ006相似度最大為0.856，說(shuō)明T27-207與東北這2個(gè)菌株的親緣關(guān)系較近。

表4 10個(gè)大杯蕈菌株遺傳相似系數(shù)

2.4 10個(gè)大杯蕈菌株的聚類分析

圖2表明，10個(gè)大杯蕈菌株在遺傳多樣性上存在一定的差異。在遺傳相似系數(shù)為0.60時(shí)，10個(gè)大杯蕈菌株聚為2類；在遺傳相似系數(shù)為0.68水平上分為4類。其中，T27-1801、T212菌株聚為一類；T220單獨(dú)為一類；T27-207、T27-202、東北、壽光、古田、高郵為第3類；漳州菌株單獨(dú)形成第4類。T212為大杯蕈品種莆蕈1號(hào)自交后代，T27-1801為莆蕈1號(hào)與T212菌株的雜交后代，二者親緣關(guān)系較近聚在一起。結(jié)合大杯蕈子實(shí)體形態(tài)，漳州菌株的菌柄和菌蓋顏色不一致，菌柄米白色區(qū)別于其他9個(gè)菌株，這與聚類結(jié)果一致，單獨(dú)聚為一類。T27-207、東北菌株在遺傳相似系數(shù)為0.86處聚為同一類群，這有可能是由于市面上大杯蕈在引種過(guò)程中出現(xiàn)的同種異名所致。

圖2 10個(gè)供試菌株的UPGMA聚類分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選了8條多態(tài)性好、清晰度高的引物對(duì)10個(gè)大杯蕈菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。8條引物共擴(kuò)增出111條DNA片段，多樣性條帶91條，多態(tài)率為81.98%，說(shuō)明供試菌株具有豐富的遺傳多樣性。供試菌株的平均遺傳相似系數(shù)為0.730，遺傳關(guān)系較近。ISSR分子標(biāo)記可有效分析大杯蕈菌株遺傳多樣性。

菌株、品種間遺傳多樣性分析在食用菌良種選育和種質(zhì)資源保藏中具有重要意義。研究表明，食用菌子實(shí)體顏色等農(nóng)藝性狀可能對(duì)遺傳多樣性有一定影響[17]。觀察食用菌子實(shí)體顏色、形態(tài)等農(nóng)藝性狀結(jié)合ISSR等分子標(biāo)記方法從DNA分子水平上檢測(cè)菌株基因組間的遺傳多樣性已在多種食用菌上有所報(bào)道。目前，大杯蕈還沒(méi)有系統(tǒng)的遺傳多樣性分析報(bào)道。江玉姬等[18]研究9個(gè)巨大革耳菌株的親緣關(guān)系，經(jīng)ISSR聚類分析表明9個(gè)菌株分為2類，C.m0002菌株單獨(dú)聚為一類。結(jié)合子實(shí)體形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，C.m0002菌株的子實(shí)體為多脂鱗傘，為同名異種。宮志遠(yuǎn)[19]搜集35個(gè)山東主栽平菇菌株，在遺傳相似系數(shù)為0.665時(shí)供試菌株的遺傳關(guān)系可按照子實(shí)體顏色分為黑色、灰黑色、白色3個(gè)類群。但是，譚艷[20]利用ISSR分子標(biāo)記方法分析29個(gè)金針菇菌株種間的遺傳差異，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)未能按照供試菌株的子實(shí)體顏色區(qū)分開。楊和川[11]基于RAPD技術(shù)研究10個(gè)杏鮑菇菌株的遺傳多樣性，在遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí)將供試菌株分為3類，也未能利用RAPD技術(shù)將供試菌株按照子實(shí)體菌蓋顏色進(jìn)行分類。譚艷等[20]研究結(jié)果與本研究一致，未能利用分子標(biāo)記技術(shù)按照子實(shí)體的顏色區(qū)分供試菌株。真菌的生長(zhǎng)速度、子實(shí)體形態(tài)等農(nóng)藝性狀受多基因控制，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，易受到溫度、濕度等栽培環(huán)境的影響[21]，采用多種分子標(biāo)記綜合分析的結(jié)果能夠更準(zhǔn)確地體現(xiàn)供試菌株間的親緣關(guān)系。汪昊等[22]認(rèn)為，綜合不同的分子標(biāo)記方法進(jìn)行聚類分析，由于原理不同聚類結(jié)果略有差異，但可以更加準(zhǔn)確地反映菌株間的親緣關(guān)系，研究中綜合采用了ISSR、SRAP、TRAP 3種分子標(biāo)記結(jié)果，在遺傳相似系數(shù)為0.75時(shí)將19個(gè)香菇菌株分為6類。武海月等[13]通過(guò)ISSR和SRAP技術(shù)綜合分析19個(gè)榆黃菇品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.70時(shí)，可將榆黃菇分為4類。高傲等[10]基于ISSR和SRAP的聚類分析結(jié)果將22個(gè)供試菌株分為4類，結(jié)果與主坐標(biāo)分析吻合。

因此，在今后的研究工作中應(yīng)從地域、親緣關(guān)系等方面考慮選取材料，擴(kuò)大研究群體，增加引物數(shù)量，結(jié)合農(nóng)藝性狀觀察和拮抗試驗(yàn)；另一方面，豐富分子標(biāo)記方法，融合不同分子標(biāo)記技術(shù)優(yōu)勢(shì)。雙管齊下，優(yōu)化聚類結(jié)果，提高遺傳分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。