響應面法優(yōu)化酶法提取羊肚菌菌柄多糖工藝研究

劉書彤，吳 磊，劉兆昱，朱振元

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

羊肚菌（Morchella esculenta）作為一種可食用、可藥用、鮮嫩可口的野生真菌，主要生長于潮濕的闊葉林地上，由于其形態(tài)酷似羊肚而得名[1]。《本草綱目》 中對于羊肚菌有這樣的記載：“甘寒無毒，益腸胃，化痰利氣，補腦提神”[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學的研究表明，其含有的活性成分，能夠調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)[3]，具有抗疲勞[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]、保肝、護肝[7]等功效。

目前，野生羊肚菌的生長條件對氣候、溫度、濕度、土壤等多種外界環(huán)境條件要求高，產(chǎn)量較低，致使羊肚菌在市場上供不應求、造成價格居高不下的局面。供應到市場上的羊肚菌需要滿足地方等級規(guī)格和出口外銷的質(zhì)量標準，主要以全剪柄精品（pileus of Morchella esculenta，PME）為主，需要將3～5 cm 長的菌柄裁剪[8]，致使我國每年會產(chǎn)生數(shù)以萬噸的羊肚菌下腳料，造成資源浪費。有研究表明，羊肚菌菌柄富含多糖[9]、礦物質(zhì)元素[10]、不飽和脂肪酸[11]、氨基酸[12]、維生素[13]、多酚[14]等多種活性成分，但羊肚菌菌柄的細胞組織結(jié)構(gòu)緊密，由果膠、幾丁質(zhì)、纖維素等多種成分組成，一般的物理方法難以破壞細胞組織。通常采用熱水浸提法，稀酸、稀堿提取法等，張景等人[15]采用傳統(tǒng)水提醇沉方法羊肚菌子實體多糖得率為6.69%，雖然簡單易操作，但是提取溫度高易造成能源浪費；稀酸、稀堿提取法測得羊肚菌多糖得率分別為10.74%，5.04%，但存在容易破壞其活性成分結(jié)構(gòu)等問題[16]。酶法提取多糖具有反應條件溫和、安全無毒且能夠減少原料和試劑的消耗等優(yōu)點，從而降低成本；果膠酶能夠破壞植物細胞壁，使細胞內(nèi)活性成分流出溶解從而提高得率[17]。

以裁剪掉的羊肚菌菌柄為原料，使用酶法對羊肚菌菌柄進行提取工藝優(yōu)化，以提高多糖得率，探究在何種條件下多糖的得率最優(yōu)，對羊肚菌下腳料進行高值化開發(fā)，以期為羊肚菌菌柄在食品、保健品、藥品等領域的深加工提供理論依據(jù)，為鄉(xiāng)村振興提供綠色動力。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌菌柄，貴州省榕江盤正農(nóng)業(yè)有限公司提供；果膠酶（50 kU/g）、纖維素酶（20 kU/g）、木瓜蛋白酶（200 kU/g），綿陽鑫奧科生物科技有限公司提供；標準葡萄糖溶液（0.1 mg/L），上海源葉生物科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速粉碎機，永康市圣象電器有限公司產(chǎn)品；分析天平，愛來寶生物技術有限公司產(chǎn)品；pH 計，德國Sartorius 公司產(chǎn)品；加熱攪拌水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機，上海縱科實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

將購得的羊肚菌菌柄在40 ℃條件下烘干6 h 后粉碎，過100 目篩，即得羊肚菌菌柄粉末，加入酶進行酶解后，于95 ℃條件下滅酶，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，取上清液加入4 倍體積無水乙醇，低溫靜置過夜，然后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min，棄上清液，加入蒸餾水溶解沉淀，凍干即得羊肚菌菌柄粗多糖[18]。

1.3.2 不同酶的選取

稱取4 份羊肚菌菌柄粉末0.50 g，1 組不添加酶作為空白對照，其余3 組分別加入果膠酶0.05 g，纖維素酶0.05 g，木瓜蛋白酶0.05 g；調(diào)節(jié)pH 值4.0，于45 ℃條件下酶解2 h，試驗5 次，比較不同酶對羊肚菌菌柄多糖得率的影響。

1.3.3 羊肚菌菌柄多糖得率測定

結(jié)合硫酸-苯酚法[19]測定初始提取物中羊肚菌菌柄多糖的含量。

（1）標準曲線的繪制。分別吸取質(zhì)量濃度0.1 mg/L的標準葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 置于試管中，加蒸餾水補至1 mL，再分別向每個試管中加入6%的苯酚溶液溶液1.0 mL 和濃硫酸溶液5.0 mL，并充分混勻，靜置10 min，放入30 ℃水浴鍋中水浴20 min，冷卻至室溫后，于波長490 nm 處測定吸光度。最后，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。得到的標準曲線線性回歸方程為Y=10.991 4X+0.012 1，相關系數(shù)R2=0.999 2。

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

（2）多糖得率的測定。提取的多糖按照上述方法測定吸光度，按下式計算得率[20]：

式中：W——羊肚菌菌柄多糖的得率，%；

C——測得羊肚菌菌柄多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——定容體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 羊肚菌菌柄多糖酶解條件工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗。①酶添加量對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶解時間1 h，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4.0，考查不同酶添加量（0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。②酶解時間對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4.0，考查不同酶解時間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。③酶解溫度對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解時間1 h，酶解pH 值4.0，考查不同酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。④酶解pH 值對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。稱取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解時間1 h，酶解溫度45 ℃，考查不同酶解pH 值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5）對酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影響。

（2）響應面優(yōu)化設計。基于單因素試驗的結(jié)果，采取Box-behnken 中心組合試驗設計。

試驗設計因素與水平設計見表1。

表1 試驗設計因素與水平設計

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 分析數(shù)據(jù)，Origin Pro 2019 作圖，SPSS 27 進行顯著性分析，利用Design Expert 13 進行響應面試驗的設計及優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶種類對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶種類對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖2。

圖2 酶種類對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖2 可知，在一定的提取條件下，加入酶后可以相對提高羊肚菌菌柄多糖的得率，果膠酶組多糖得率最高，為6.35%，是由于果膠酶可以有效地將果膠等大分子物質(zhì)分解成小分子，增加活性成分的釋放[21]。因此，試驗選用果膠酶進行酶解。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶添加量對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶添加量對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖3。

圖3 酶添加量對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖3 可知，隨著酶添加量的增加，羊肚菌菌柄的多糖得率先增大后減小。當酶添加量達到1.0%時，多糖得率為4.53%（p＜0.05）。可能是由于增大酶濃度可以使酶與底物更加充分接觸，酶解效果提高，多糖得率增加；當酶添加量大于1.0%時，多糖得率有所下降，可能是由于酶添加量增加部分多糖發(fā)生降解作用，導致多糖得率降低[22]。因此，確定酶添加量為1.0%。

2.2.2 酶解時間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶解時間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖4 可知，當酶解時間低于1.5 h 時，酶與底物未能充分反應完全，1.5 h 時得率達到最大為5.39%（p＜0.05），隨酶解時間的延長，羊肚菌菌柄多糖得率逐漸減小，可能是由于酶解時間過長會引起多糖炭環(huán)裂解結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，或是其他水溶性成分的溶出干擾了測定，導致多糖含量降低[23]。

2.2.3 酶解溫度對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

酶解溫度對羊肚菌菌柄多糖得率的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由圖5 可知，隨著酶解溫度的升高，羊肚菌菌柄多糖得率先上升后下降，在45 ℃時達到最大值，為6.91%（p＜0.05）?？赡苁怯捎诿笇囟茸兓^敏感，溫度過低時酶的活性未被激活；溫度升高時酶變性而失活，降低了酶與底物的反應，導致酶解產(chǎn)物減少[24]。因此，選取45 ℃為最適酶解溫度。

2.2.4 酶解pH 值對羊肚菌菌柄多糖得率的影響

由于不同酶的最適pH 值不同，因此酶的活性也受pH 值的影響[25]。

酶解pH 值對多糖得率的影響見圖6。

圖6 酶解pH 值對多糖得率的影響

由圖6 可知，隨著酶解pH 值的上升，多糖得率先升后降，在酶解pH 值4.0 時達到最高值，為5.82%（p＜0.05）；酶解pH 值低于4 時，酶與底物的反應不充分；酶解pH 值高于5 時，可能酶的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，進而引起酶的活性和酶構(gòu)象發(fā)生變化[26]。因此，羊肚菌菌柄多糖提取最佳酶解pH 值為4。

2.3 響應面分析法試驗結(jié)果

2.3.1 Box-behnken 試驗設計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在影響羊肚菌菌柄多糖得率的4 個因素中分別選取3 個水平進行編碼（表1）。

響應面試驗設計及結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析

利用Design Expert 對表2 試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的回歸方程：

回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗見表3。

表3 回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗

由表3 可知，該模型顯著（p＜0.000 1），失擬項p=0.053 1＞0.050 0，不顯著。R2=0.965 1，表明該模型可以較好地反映酶解羊肚菌菌柄提取多糖過程中各影響因素與響應值的關系并預測最佳條件。4 個因素對羊肚菌菌柄多糖得率影響的主次順序為B＞C＞A＞D，即酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解pH 值。

2.4 Box-behnken 響應面圖分析

曲線趨勢圖通過將4 個因素中任意2 個因素固定為零水平，以反映兩兩交互作用對羊肚菌菌柄多糖得率的影響。

各因素對羊肚菌菌柄多糖得率影響的響應面圖和等高線圖見圖7。

由圖7 可知，結(jié)合曲線趨勢圖及等高線圖反映出酶解時間對羊肚菌菌柄多糖得率的影響更顯著，與方差分析的結(jié)果一致。經(jīng)響應面模型分析得到酶提羊肚菌菌柄多糖的最佳條件為酶添加量0.980 2%，酶解時間1.397 3 h，酶解溫度43.820 8 ℃，酶解pH值3.967 8，此時羊肚菌菌柄多糖得率為7.133 8%。為方便操作，將羊肚菌菌柄多糖的提取條件修正為酶添加量1%，酶解時間1.5 h，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4。在此條件下，進行5 次驗證試驗，測得羊肚菌菌柄多糖的平均得率為7.12%。

3 結(jié)論

以羊肚菌菌柄下腳料為試驗原料，在單因素試驗篩選基礎上，利用Box-behnken 響應面優(yōu)化酶法提取羊肚菌菌柄多糖的工藝技術，獲得最佳提取工藝參數(shù)為復合酶添加量1%（以底物質(zhì)量計），酶解時間1.5 h，酶解溫度45 ℃，酶解pH 值4，在此工藝參數(shù)下其得率為7.12%，接近模型預測的提取值。使用該工藝處理羊肚菌下腳料多糖得率與子實體接近，提高活性物質(zhì)得率的同時避免了資源浪費。試驗驗證了果膠酶提取羊肚菌菌柄多糖具有可行性，為進一步對羊肚菌菌柄下腳料的綜合利用及高值化開發(fā)提供科學理論依據(jù)，為鄉(xiāng)村振興提供綠色動力。